学习活动3 外植体接种与培养

【学习目标】 1．树立起无菌操作的观念。

2．能正确使用超净工作台。

3．能正确进行外植体接种。

【学习准备】 培养基、外植体、超净工作台、接种器械灭菌器、镊子、手术剪、接种刀、无菌牛皮纸、无菌滤纸、外植体灭菌剂、75%酒精纱布2份、95%酒精、无菌水、废液收集瓶。

【学习过程】

问题1

什么是外植体接种？

基本知识

一、外植体接种的概念

接种是将消毒好的外植体在超净工作台上分离，切割成适宜的大小，并放入培养基的无菌操作过程。

二、外植体接种前的准备工作

1．在接种前2~3个星期用甲醛熏蒸接种室；每立方米空间用10 mL甲醛溶液加5 g高锰酸钾，密闭熏蒸24 h，然后打开房门，放走甲醛气体。平时的常规消毒可用70%酒精或0.1%新洁尔灭喷雾，使空气中的灰尘颗粒沉降。

2．将培养基和接种工具放进超净工作台，接种前1 h打开紫外线灯进行灭菌，30 min后关掉。

3．在接种前20 min打开超净工作台的风机。

4．接种员洗净双手，带上接种材料，在缓冲室换好专用实验服，戴上口罩，并换上拖鞋等，进入接种室。

5．上超净工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处，然后擦拭工作台面。

6．用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪刀从头到尾灼烧一遍，然后反复灼烧工具尖端处，培养皿要过火烤干，或用组织培养专用灭菌器对工具进行消毒灭菌。

7．按规范放好各种用品和接种材料，一般中间放置无菌纸或培养皿，右边放置灭菌器、酒精灯和接种材料，左边放置包扎用品及培养基。

三、接种

1．首先将消毒好的外植体材料放在无菌纸或灭过菌的培养皿或小瓷碟中进行切割，切块大小要适中。外植体的大小一般以0.5~1 cm为宜。具体来说，叶片、花瓣等为20~25 mm2的小方块，茎段长0.5~1 cm，茎尖分生组织长0.2~0.3 mm，并带1~2个叶原基。

注意：在切割过程中，剪刀和镊子每使用片刻就应擦干净放入95%酒精中，待灼烧放凉备用。通常两套工具交换使用，可提高工作效率，并防止连续污染（也称为交叉污染）的发生。如镊子夹了未消毒好的材料，再夹其他材料，就会造成交叉污染。又如剪刀或镊子碰到台面、管（瓶）的外壁、棉塞，以及手拿的部位过近，未能充分灼烧，连续使用过久等，都易引起交叉污染。经常灼烧操作工具可减少这种污染，即便污染，也是一个个独立发生的，不会连续成批地污染。

图4-3-1叶片外植体培养

2．用上述灼烧灭菌过的镊子将切割好的外植体材料植入培养基表面。具体操作是：左手几乎水平拿试管或培养瓶，靠近酒精灯焰，将管口外部在灯焰上灼烧数秒钟（管口不能灼烧灭菌，否则棉塞易烧坏），将灰尘、杂菌等固定在原处，此时在灯焰附近用右手慢慢打开瓶盖或棉塞，以免空气速向管内冲击，导致管口灰尘等冲入，造成污染。瓶盖或棉塞始终拿在手上，这时再将管口在灯焰上旋转，使其充分灼烧灭菌，主要注意管口附近，包括管口内表面，然后用右手拇、食、中指拿镊子夹一块外植体送入管内，轻轻插在培养基上，再轻轻盖上瓶盖或塞上棉塞，最后将管口及棉塞在灯焰上灼烧数秒，灼烧时应旋转，避免烧坏。镊子灼烧后放回架上，这样便完成了一瓶的接种操作，接着再接种第二瓶，如此一直到外植体全部接种完。

操作时注意瓶盖、棉塞不能乱放，要仔细理解并牢固树立无菌操作观念，严格执行无菌操作。

问题2

外植体接种应遵循怎样的操作流程？

基本操作

四、外植体接种的基本操作流程

图4-3-2外植体接种的基本操作流程

五、接种后的工作

1．接种完毕要清理干净工作台，关掉工作台的电源。

2．及时将接种好的材料放到培养室中培养。

3．接种用过的器皿及有关用品应及时清洗。

六、培养

接种后的外植体应放在培养室培养。培养室的条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控，其中最主要的条件是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值。

1．光照

植物组织培养是在含糖的培养基上进行的，所以光照的主要作用在形态建成的诱导方面。光对组织培养的影响主要表现在光照时间、光照强度和光质三个方面。

（1）光照时间：大多数植物选择通过一定的光暗周期来进行组织培养。每天14~16 h光照，8~10 h黑暗，即可满足大多数植物生长发育的需要。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗培养下比在光照下生长更好，如红花、乌饭树的愈伤组织。

（2）光照强度：光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，尤其是对外植体细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长得粗壮，而光照强度较弱，幼苗容易徒长。对绝大多数植物来说，1000~5000 lx的光照强度即能满足一般组织培养的需要。

（3）光质：光质通常指不同波长的光波。光质对愈伤组织的诱导、培养组织的增殖以及器官的分化有明显的影响。一般红光可引起细胞干物质的重量增加并利于根的形成；蓝光可引起细胞中的质体转化为叶绿体，对促进腋芽、不定芽生长有明显的作用。如百合珠芽在红光下培养，8周后分化出愈伤组织，但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织；唐菖蒲子球块接种15 d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。倪德祥等对香石竹的研究表明，白光下生长量最大，红、黄、绿、蓝光对生长有抑制作用，单色光对叶绿素合成有抑制作用，叶绿素的合成需要在复合光条件下完成。

2．温度

在植物组织培养中，不同植物繁殖的最适温度不同，一般在23℃~28℃之间。通常低于15℃时，培养的外植体组织生长缓慢或出现停滞，但高于35℃对生长也不利。植物组织培养过程所需温度与其原产地有关，一般原产于热带或亚热带的植物，培养时需要较高的温度，即（28±2）℃；生长在高海拔和较低温度环境的植物，则培养的环境温度可适当低些，因为在较高温度条件下组培苗生长缓慢。

3．湿度

植物组织培养中的湿度主要有两个方面：一是培养容器内的湿度条件，二是培养室的湿度条件。培养容器内的湿度主要受培养基影响，相对湿度可达100%，而培养室的湿度随季节有很大变动，它可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%~80%的相对湿度。培养室的湿度过高过低都不利于培养物的生长，过低会造成培养基失水，从而改变各种成分的浓度，使渗透压升高，影响培养物的生长和分化；过高又会造成杂菌滋生，导致污染。

4．通气状况

培养容器内的气体成分会影响培养物的生长和分化。氧气是植物组织培养必需的，在接种时应避免把整个外植体全部埋入培养基中，以免缺氧。在静止的液体培养基中宜架上滤纸桥，由滤纸的浸润提供水分和营养。另外，培养基经高压灭菌，瓶中可能有乙烯产生，而且在培养过程中培养物本身也会释放乙烯和高浓度的二氧化碳。高浓度的乙烯对正常的形态建成是不利的，会阻碍培养物的生长，甚至会对培养物产生毒害作用。

5．培养基的pH值

外植体的培养增殖都要求一定的pH值。通常一般培养基的pH值在5.6~6.0之间。如果pH值不适则直接影响外植体对营养物质的吸收，进而影响外植体的脱分化、增殖和器官形成。不过pH值对不同植物的影响会有差异，有的宜偏酸，有的宜偏碱，在实际工作中应依不同植物而调整。