实验五 细菌的染色法
形态学检查是鉴定细菌一个重要的环节。细菌个体小，无色半透明，不染色在镜下不易被观察，给菌体着色后，即可在镜下清晰地观察其形态特征，有助于菌种的鉴定。
进行细菌染色时因其等电点低（pH2～5），细菌在中性、碱性以及弱酸性环境中都带有负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，常用亚甲蓝、复红、结晶紫等碱性染料染色。碱性染料电离后带色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合，使细菌着色。染色方法有单染色法与复染色法，只用一种染料使细菌着色的方法称单染色法，用两种或两种以上染料染色的方法称复染色法，主要有革兰染色法、抗酸染色法，此外还有多种特殊染色法。
一、细菌涂片的制作
【实验目的】
1. 了解细菌常用的一些染色方法。
2. 掌握细菌涂片制作的步骤。
【实验材料】
菌液或固体平板上生长的菌落及载玻片、接种环、酒精灯等。
【实验方法】
1. 涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下。
（1）用肉汤培养物涂片
1）右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。
2）将接种环按15°角放在酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红，然后将金属杆也通过火焰略加烧灼（图1-5）。对于接种环的使用，必须牢记一句话：使用前和使用后均要烧灼灭菌。
图1-5 接种环灭菌示意图
3）用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。
4）用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料（图1-6），此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。
图1-6 细菌培养物取材示意图
5）将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短，以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。
6）将接种环上材料涂于载玻片上，随后立即将接种环烧灼灭菌。为防止细菌溅洒污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放于内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。
（2）用斜面培养物涂片：用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载玻片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜，大小约1cm×1cm。无菌操作取材步骤同前。
2. 干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。
3. 固定：用木夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过3次，并固定住。此时杀死细菌，并使标本固定于载玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。
二、革兰染色法
【实验目的】
1. 掌握革兰染色法的步骤。
2. 熟悉革兰染色法的原理。
【实验原理】
革兰染色法于1884年由丹麦细菌学家Gram创建，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。经此法染色后，可将细菌分为两大类，即革兰阳性（G+）菌和革兰阴性（G-）菌，有助于细菌的鉴别。另外，根据初步染色结果，可以协助临床选择抗菌药物，并对了解细菌的致病性有一定的帮助。该染色法的机制：①细胞壁结构学说：基于革兰阳性菌细胞壁与革兰阴性菌细胞壁的差异。细菌经结晶紫初染染成紫色。革兰阳性菌细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞壁内漏出，仍为紫色。而革兰阴性菌细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经稀释复红染色液复染成红色。②等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pH2～3）比革兰阴性菌的等电点（pH4～5）低，在同一pH条件下，革兰阳性菌比革兰阴性菌所带负电荷要多，与带正电荷的碱性染料结合力牢固，不易脱色；③化学学说：革兰阳性菌含有大量核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%乙醇脱色；而革兰阴性菌含此种物质量少，故易被乙醇脱色。
【实验材料】
细菌涂片、结晶紫染色液、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红染液等。
【实验方法】
1. 传统革兰染色：
（1）将结晶紫染液加于细菌涂片上，染色（初染）1分钟。
（2）水洗后加卢戈碘液处理（媒染）1分钟。
（3）水洗后用95%乙醇脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止（约需30秒）。
（4）水洗后加稀释复红染液染色（复染）30秒。
（5）水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。
2. 改良革兰染色：
（1）龙胆紫（龙胆汁、乙醇）染色10秒，之后水洗。
（2）碘溶液（碘、碘化钾）染色10秒，之后水洗。
（3）脱色液（丙酮、乙醇）脱色10秒，之后水洗。
（4）沙皇溶液（沙皇、乙醇）复染10秒，之后水洗。
用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。
在染色过程中，水洗要用自来水或洗瓶的细水流徐徐冲洗涂片的表面，勿使强水流直接冲到涂片上。
【实验结果】
革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。
【思考题】
1. 细菌染色前，为什么必须进行固定？
2. 在革兰染色过程中，哪个步骤对染色结果影响最显著？
3. 试述革兰染色法的主要步骤、结果及实际意义。
三、抗酸染色法
【实验目的】
1. 了解抗酸染色法的原理及意义。
2. 学会抗酸染色法的基本过程，并且通过光学显微镜观察细菌的形态结构，能够对抗酸杆菌进行鉴别。
【实验原理】
分枝杆菌属最显著的特性为其细胞壁中含有大量类脂，可达菌体干重的40%左右，故生长形成粗糙型菌落，而且也难以用一般染料染色。然而，若设法用石炭酸复红染料使之着色后，又不易被3% 盐酸乙醇脱色，而非抗酸性细菌胞内的石炭酸复红染料易离开菌体，可被3% 盐酸乙醇脱色，不被着色，抗酸性与细胞壁内所含分枝菌酸残基和细胞壁固有层的完整性有关。结核分枝杆菌一般常用齐-尼氏抗酸性染色法染色，结核分枝杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞质等染成蓝色。
【实验材料】
1. 菌种：结核患者痰标本或BCG菌液。
2. 染液：石炭酸复红染液，3%盐酸乙醇，碱性亚甲蓝染液。
3. 器材：载玻片，显微镜，酒精灯，接种环等
【实验方法】
1. 取结核患者痰标本或BCG菌液涂片，干燥固定。
2. 石炭酸复红初染：将石炭酸复红染液滴在涂片上，染色10分钟，之后水洗。
3. 3%盐酸乙醇脱色：用3%盐酸乙醇脱色1分钟，之后水洗，使流出的液体几乎无色为止。
4. 碱性亚甲蓝复染：用碱性亚甲蓝染液复染1分钟，水洗，吸干水后用油镜检查。
【实验结果】
抗酸菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。