第一章 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其他方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在紫外光下至少可以检出1～10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围较广，不同浓度的琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5～500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移率由下列多种因素决定。

1.DNA的分子大小

线状双链DNA分子在一定浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率与DNA分子质量的对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2.琼脂糖浓度

一个特定的线状DNA分子，其迁移率在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小，分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2%～1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3%～0.7%，DNA片段介于两者之间则所需胶浓度为0.8%～1.0%。

3.DNA分子的构象

DNA分子在电场中的移动速度不仅和分子量有关，还和它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而开环DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时，发现凝胶上有数条DNA带，难以确定是质粒DNA不同构象引起，还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

4.电源电压

在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5V/cm。

5.嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15%。

6.离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE [含EDTA（pH 8.0）和Tris-乙酸]、TBE（Tris-硼酸和EDTA）、TPE（Tris-磷酸和EDTA），一般配制成浓缩母液，储于室温。

一、实验材料

（1）TAE电泳缓冲液TAE（50×）储存液：242g Tris，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH 8.0），定容至1000mL。使用液为TAE（1×）。

（2）6×DNA上样缓冲液 30mmol/L EDTA，36%甘油，0.05%二甲苯腈蓝FF，0.05%溴酚蓝。

（3）溴化乙锭配成10mg/mL溶液，双蒸水配制，避光保存，用时以1∶20000稀释。溴化乙锭为致癌剂，配制时防止皮肤接触。

二、实验仪器

DYY-III型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、微波炉、离心机、凝胶成像系统。

三、操作步骤

（1）0.8%琼脂凝胶板的配制 取0.8g琼脂糖加100mL TAE（1×），微波炉加热融化，将其冷却至55～65℃，倒入制胶槽中。

（2）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板。

（3）DNA样品5μL加1μL 6×DNA上样缓冲液，混匀后全部加样于琼脂糖板的样品孔中。

（4）稳压电泳100V约30min，使溴酚蓝指示剂泳动至适当位置。

（5）取出凝胶板，置溴化乙锭溶液中染色20min。

（6）在凝胶成像仪观察结果。

四、技术要点

（1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶。在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与50bp的双链线状DNA一致。

不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见表1-1。

（2）电泳中注意防止凝胶发热。

（3）将电泳仪置稳压挡，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。

（4）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。

思考题

1.DNA样品点样前与6×DNA上样缓冲液混匀的作用是什么？

2.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？