第二节 应用微生物学基本知识点
培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。由于微生物种类繁多，对营养物质的要求各异，加之实验和研究的目的不同，所以培养基在成分上也各有差异。但是，不同种类或不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素等。配制培养基时不仅要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之间的协调。此外，培养基还应具备适宜的酸碱度（pH）、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。
培养基的种类如下所示：
（1）按照培养基的营养物质来源，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基三类。
（2）按培养基外观的物理状态，可将培养基分成三类，即液体培养基、固体培养基和半固体培养基。
（3）按照培养基的功能和用途，可将其分为基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基等。
一、培养基的制备和灭菌
（一）实验目的
（1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。
（2）掌握培养基的制备方法。
（3）学会灭菌技术。
（二）仪器和器材
（1）锥形瓶、烧杯、培养皿、试管、吸管、玻璃棒等。
（2）棉花、橡皮圈、牛皮纸（或报纸）、纱布、洗液等。
（3）精密pH试纸6.4～8.4、10%HCl、10%NaOH。
（4）牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。
（5）高压蒸汽灭菌锅、电子天平、烘箱、电磁炉、小煮锅、冰箱等。
（三）实验内容
1.培养基的制备
配制培养基的流程：原料称量、溶解→调节pH→分装→过滤→塞棉塞和包装→灭菌→贮存。
（1）原料称量、溶解 根据培养基配方，准确称取各种原料成分，然后依次将各种原料加入水中，用玻璃棒搅拌使之溶解。配制固体培养基时，预先将琼脂称好洗净（粉状琼脂可直接加入，条状琼脂用剪刀剪成小段，以便熔化），然后将液体培养基煮沸，再把琼脂放入，继续加热至琼脂完全熔化。
（2）调节pH 液体培养基配好后，一般要调节至所需的pH。常用盐酸及氢氧化钠溶液进行调节。调节培养基酸碱度最简单的方法是用精密pH试纸进行测定。
（3）分装 培养基配好后，要根据不同的使用目的，分装到各种不同的容器中。不同用途的培养基，其分装量应视具体情况而定，要做到适量、实用。培养基是多种营养物质的混合液，大多具有黏性，在分装过程中，应注意不使培养基沾污管口和瓶口，以免污染棉塞，造成杂菌生长。分装培养基，通常使用大漏斗（小容量分装）或医用灌肠器（大容量分装）。培养基的分装量，应依照使用目的及实验的具体情况决定。
（4）过滤 用纱布、滤纸或棉花过滤均可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可不过滤。
（5）塞棉塞和包装 培养基分装到各种规格的容器后，应按管口或瓶口的不同大小分别塞以大小适度、松紧适合的棉塞（图1-7）。由于棉塞外面容易附着灰尘及杂菌，且灭菌时容易凝结水气，因此，在灭菌前和存放过程中，应用牛皮纸或旧报纸将管口、瓶口或试管包起来。
图1-7 包扎方法
（6）灭菌 培养基制备完毕后应立即进行高压蒸汽灭菌。如延误时间，会因杂菌繁殖生长，导致培养基变质而不能使用。
（7）贮存 培养基较长时间搁置不用或存贮不当，往往会因污染、脱水或光照等因素而变质，所以培养基一次不宜配制过多，最好是现配现用。因工作需要或一时用不掉的培养基应放在低温、干燥、避光而洁净的地方保存。对含有染料或其他对光敏感的培养基，要特别注意避光保存，特别是避免阳光长时间直接照射。
2.灭菌和消毒
采用强烈的理化因素使除任何物体外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称为灭菌。消毒则是用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物（主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞），实际上是部分灭菌。
微生物学实验最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温的致死作用，主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。
（1）干热灭菌
①火焰灭菌：这种方法灭菌迅速彻底，微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧进行灭菌。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可以通过火焰灼烧灭菌。
②加热灭菌：用干燥热空气杀死微生物的方法称为加热灭菌。将灭菌物品置于干燥箱内，在160～170℃加热1～2h。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积做适当调整，以达到灭菌目的。玻璃制品、金属用品及能耐高温的物品都可以用此法灭菌。但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用加热灭菌。加热灭菌箱如图1-8所示。
图1-8 加热灭菌箱
1—温度计与排气孔 2—温度调节旋钮 3—指示灯 4—温度调节器 5—鼓风钮
a.加热灭菌操作步骤
装箱：将准备灭菌的玻璃器材洗涤干净、晾干，包装好放入灭菌箱内，关好箱门。
灭菌：接通电源，打开灭菌箱排气孔，待温度升至80～100℃时，关闭排气孔。继续升温至160～170℃时，开始计时，恒温1～2h。
灭菌结束后，断开电源，自然降温至60℃，打开加热灭菌箱门，取出物品放置备用。
b.注意事项：灭菌的玻璃器皿切不可有水，以防止炸裂。灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。灭菌物品不能直接放在烘箱底板上，以防止包装纸或棉花被烤焦。灭菌温度恒定在160～170℃为宜，温度超过180℃，棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
（2）湿热灭菌 湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。原因：热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强，水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性；热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时，可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理15min后即可杀死，酵母菌和真菌的孢子要耐热些，要用80℃以上的温度才能杀死，而细菌的芽孢更耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。湿热灭菌常用的方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。
①常压蒸汽灭菌：常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。由于常压蒸汽的温度不超过100℃，压力为常压，大多数微生物的营养细胞能被杀死，但芽孢细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采用间歇灭菌或持续灭菌的方法来杀死芽孢细菌，达到完全灭菌。
巴氏消毒法：是一种低温消毒法，用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法。具体方法可分为两类，第一类是低温维持法，如在63℃下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是高温快速法，用于牛奶消毒时只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体。
间歇灭菌法：适用于不耐热培养基的灭菌。方法：将待灭菌的培养基在100℃下蒸煮30～60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20～30℃下保温过夜，诱导残留的芽孢萌发，第二天再以同样的方法进行灭菌，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。
蒸汽持续灭菌法：微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备时常用这种方法。在容量较大的蒸锅中进行。从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，待锅内温度达到100℃时，持续加热3～6h，杀死绝大多数芽孢和全部营养体，达到灭菌目的。
②高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌方法。
灭菌原理：将待灭菌的物体放在有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa）维持35min。此法适用于一切微生物学实验室、医疗保健机构中对培养基及多种器材、物品的灭菌。在空气完全排除的情况下，一般培养基只需在0.1MPa下灭菌30min即可。
灭菌设备：主要设备是高压蒸汽灭菌锅，有立式、卧式及手提式等不同类型。高压蒸汽灭菌锅如图1-9所示。
图1-9 高压蒸汽灭菌锅
手提式灭菌锅使用方法：
a.加水：直接加水至标定水位线以上。
b.装锅：将待灭菌的物品装入锅内，不要太紧太满。关严锅盖，打开排气阀。
c.加热排气：合上电闸通电加热。持续加热至锅内的水沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，维持2～3min以排除冷空气。
d.保温保压：当压力升至0.1MPa时，温度达121℃，此时应控制热源。保持压力，维持30min后，切断热源。
e.出锅：当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物。注意切记在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以防培养时杂菌污染。
f.保养：灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。
（3）紫外线杀菌 紫外线的波长范围是15～300nm，其中波长在260nm左右的紫外线杀菌作用最强。紫外灯是人工制造的低压水银灯，能辐射出波长主要为253.7nm的紫外线，杀菌能力强且较稳定。紫外线杀菌作用是因为它可以被蛋白质（波长为280nm）和核酸（波长为260nm）吸收，造成这些分子的变性失活。紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣服、纸张或大多数其他物体，但能够穿透空气，因而可以用作物体表面或室内空气的杀菌处理，在微生物学研究及生产实践中应用较广。在一般实验室、接种室、接种箱中，均可利用其杀菌。紫外灯的功率越大，效能越高。但是紫外线对眼黏膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以应避免在紫外灯下工作，必要时需穿防护工作衣帽，并戴有色眼镜进行工作。
3.常用玻璃器皿的清洁与灭菌
（1）清洁 清洁的玻璃器皿是得到正确实验结果的重要条件之一。要求所使用的器皿不能妨碍得到正确的结果，至少必须洗去灰尘、油垢、无机盐类等物质。器皿洗涤之后，必须晾干或烘干备用。
①洗涤工作注意事项
a.任何洗涤法，都不应对玻璃器皿有所损伤。所以不能使用对玻璃器皿有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的制品来擦拭玻璃制品。
b.用过的器皿必须及时洗涤，放置太久会增加洗涤的困难。随时洗涤还可以提高器皿的使用率。
c.含有对人有传染性的或者是属于植物免疫的微生物试管、培养皿及其他容器，应先浸在5%石炭酸溶液内或蒸煮灭菌后再进行洗涤。
d.盛过有毒物品的器皿，不要与其他器皿放在一起。
e.难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。
f.强酸强碱及其他氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，必须倒在废水缸中。
g.剩余汞溶液，切勿装在铝锅等金属器皿中，以免引起金属的腐蚀。
②洗涤剂的种类及应用
水：水是最主要的洗涤剂，但只能洗去可溶解在水中的沾污物。不溶解于水的沾污物，如油、蜡等，必须用其他方法处理以后，再用水洗。
肥皂：肥皂是很好的去污剂。一般肥皂的碱性都不强，不会损伤器皿和皮肤，所以洗涤时常用肥皂。热的肥皂水（5%）去污力很强，洗去器皿上的油脂很有效。
去污粉：去污粉内含有碳酸钙、碳酸镁等，有起泡沫和除油污的作用，有时也可以加一些盐、硼砂等，以增加摩擦作用。一般玻璃器皿、搪瓷器皿等都可以使用去污粉。
洗衣粉：洗衣粉有很强的去污能力。用1%的洗衣粉液洗涤载玻片和盖玻片，能达到良好的清洁效果。
洗涤液：通常用的洗涤液是重铬酸钾的硫酸溶液，是一种强氧化剂，去污能力很强，常用它洗涤玻璃和瓷质器皿上的有机质。
硫酸及碱：器皿上如有煤膏、焦油以及树脂一类物质，可以用浓硫酸或40%氢氧化钠溶液洗。
有机溶剂：有时洗涤油脂物质及其他不溶于水也不溶于酸和碱的物质，需要用特定的有机溶剂，常用的有机溶剂有汽油、丙酮、酒精、苯、二甲苯及松节油等。
③各种玻璃器皿的洗涤方法
新玻璃器皿的洗涤法：新购置的玻璃器皿含有游离碱，应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，再用水充分冲洗干净。
含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤法：先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮下，并用刷子蘸肥皂擦洗内壁，然后用自来水洗去肥皂。
载玻片及盖玻片的洗涤法：新载玻片可放入1%的洗衣粉液内煮沸1min，待沸点泡平下后，再煮沸1min，如此2～3次，待冷却后用自来水冲洗干净。用过的载玻片和盖玻片，应用纸擦去油垢，然后浸入洗衣粉液中，方法同新载玻片洗衣粉液洗涤法，只不过时间要长些（30min左右）。
（2）灭菌
①包装：移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1～1.5cm长的棉塞。棉塞要塞得松紧适宜。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4～5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，使包装纸包住移液管的尖端，压紧移液管，在桌面上向前搓转，使纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。吸管包裹法如图1-10所示。
图1-10 吸管包裹法
按实验需要，可单支或多支包装，待灭菌。
②用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住。
③培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将10套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，5套、5套相对）包好。
④按照实验要求进行灭菌。
二、微生物的分离、培养和接种技术
在不同的生态系统中，生存着不同的微生物；在同一生态系统中，不同种类的微生物混在一起生活。如果要获得某种微生物时，就需要从混杂的微生物类群中将其分离出来，得到只含有该种微生物的纯培养。这种方法就称为微生物的分离与纯化。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本技能，其中无菌操作是微生物接种技术的关键。由于实验目的、实验器皿、培养基种类等不同，所用的接种方法也不尽相同。不同的接种方法，所使用的接种工具也不同。
（一）实验目的
（1）从环境中分离、培养微生物，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法。
（2）学会几种接种技术。
（二）仪器和器材
（1）无菌培养皿、吸管、锥形瓶、试管、无菌水等。
（2）已灭菌的培养基、待测样品（土壤、水体、活性污泥等）。
（3）接种环、酒精灯、恒温培养箱等。
（三）纯种分离的操作方法及步骤
1.稀释平板法
（1）取样 用无菌瓶到现场取一定的土壤或湖水或待测水样，迅速带回实验室。
（2）稀释水样
①将5只装有9mL无菌水的试管10-1、10-2、10-3、10-4、10-5依次编号。
②以无菌操作，用1mL的无菌吸管吸取1mL的待测水样置于第一个无菌水试管中，将吸管吹吸三次，摇匀，即为10-1浓度的混合菌液；用1mL的无菌吸管吸取1mL10-1浓度的菌液置于第二个无菌水试管中，将吸管吹吸三次，摇匀，即为10-2浓度的混合菌液。依次类推稀释到10-5。
（3）平板制作
①将无菌培养皿编号10-3、10-4、10-5各三套，另取一套为对照。
②另取一支1mL的无菌吸管从浓度小的10-5菌液开始，依次分别取1mL菌液于相应编号的培养皿内，每个浓度做三个平板，每次吸取菌液时注意摇匀，且在吸管中反复吹吸几次。
③将已经熔化并冷却到45℃左右的培养基15～20mL注入培养皿中。倒平板方法如图1-11所示。
图1-11 倒平板方法
④将培养基注入对照培养皿冷凝后，倒置于37℃恒温培养箱内培养24～48h，然后观察结果。
2.平板划线法
（1）取样，同前。
（2）将熔化并冷却到50℃左右的培养基15～20mL倒入培养皿中，制成平板。
（3）以无菌操作，右手持灼烧灭菌冷却的接种环取一环活性污泥（或土壤悬液、污水等其他样品），左手拿培养皿，方法同前打开皿盖，将接种环在培养皿表面轻轻地划线，可以是平行划线、扇形划线，或其他连续划线。划线后，盖好皿盖，培养皿倒置于37℃恒温培养箱内培养24～48h，然后观察结果。接种环用过之后，随即灼烧灭菌。
3.平板表面涂布法
（1）取样，同前。
（2）稀释样品，同前。
（3）制作平板，同前。
（4）在无菌的环境中，用无菌移液管吸取一定量的经过稀释的样品于平板上，用三角刮板在平板上旋转涂布均匀。
（5）正置，放在恒温培养箱中培养，次日把培养皿倒置继续培养。
（6）待长出菌落，分析观察结果。
采用以上任一方法分离后，若仍然有杂菌存在，可用相同分离方法再次分离，直至达到纯化标准为止。
（四）接种技术
1.接种用具
常用的接种用具有接种针、接种环、接种铲、移液管、滴管、三角刮刀、刮刀和定量移液器等。前三种用具主要用于从固体培养基到固体培养基或固体培养基到液体培养基的接种，后几种用具多用于从液体培养基到液体培养基或液体培养基到固体培养基的接种。接种用具如图1-12所示。
图1-12 接种用具
2.接种环境
微生物的分离培养、接种等操作，需要在无菌操作室、无菌操作箱或生物超净工作台等无菌环境下进行。
3.接种技术
接种是将一定量的微生物在无菌的条件下从一种培养基中转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。
（1）斜面接种 从已生长好菌种的斜面培养基上，挑取少量菌种，移植到另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：
①准备工作：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人、组别等。
②点燃酒精灯。
③接种：操作必须按无菌操作方法进行，具体操作流程（图1-13）如下：
图1-13 接种技术
手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管放在左手上，用拇指压住两支试管，中指位于两支试管中间，斜面向上，管口齐平，使它们位于水平位置。
旋松管塞：用右手旋松管塞，以便接种时易拔出管塞。
灼烧接种环：右手拿接种环，在酒精灯上，灼烧接种环及可能伸入到试管内的部分，重复此操作。
拔管塞：用右手的无名指、小拇指和手掌边取下菌种和待测试管的管塞，然后将试管口缓慢地过火灭菌。
接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管内，触及没有长菌的培养基部分，使接种环冷却。
取菌：接种环冷却后，轻轻蘸取少量菌体或孢子，然后将接种环移出菌种管。不要让接种环的部分碰到管壁。
接种：在火焰旁迅速将蘸有菌种的接种环伸入到另一待接试管中，从斜面培养基的底部向上做“z”形来回密集划线（图1-14）。
塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，在火焰旁将管塞塞上。
灭菌：将接种环灼烧灭菌。
图1-14 斜面接种
（2）液体接种
①从斜面培养基到液体培养基的接种方法：当接种量少时，取菌种，将蘸有菌种的接种环送入液体培养基中，使菌环上的菌种洗入液体培养基内并轻轻旋转，使菌环上的菌全部进入到液体培养液中。取出接种环并灼烧，试管过火后塞上棉塞，将培养液体轻轻摇动，使菌体在培养基内分布均匀，放置在恒温培养箱中培养，等待结果。
当接种量大时，可先在斜面培养基试管中加入定量无菌水，用接种环把菌苔刮下并散开，试管口在酒精灯上过火灭菌，再把菌悬液倒入液体培养基中。
②从液体培养基到液体培养基的接种方法：用液体培养物接种液体培养基时，在火焰旁用无菌的吸管或移液管吸取一定量的菌液接种，摇匀，放置培养箱中培养。
（3）固体接种 固体接种最普遍的形式是接种固体菌制剂。
①斜面培养基接种到固体培养基：在斜面培养基的试管中加入定量无菌水，把菌苔刮洗下来，制成菌悬液，按无菌操作方法将菌悬液直接倒入固体培养基中搅拌均匀，即可培养。
②用固体种子菌接种到固体培养基中：直接把接种的材料包括用孢子粉、菌丝孢子混合菌或其他固体培养的种子菌，混入灭菌的固体培养基中，充分搅拌，混合均匀后，进行培养。
（4）穿刺接种 这是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体，之后把它穿刺在固体或半固体培养基上的一种接种方法。具体操作如下：
①在酒精灯火焰旁，左手持试管，右手旋松棉塞。
②右手拿接种针灼烧灭菌，拔出棉塞。
③接种针先在培养基无菌处冷却，再用接种针的针尖蘸取少量菌种。
④将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中，且将接种针刺到试管的底部。
⑤沿接种线拔出接种针，塞上棉塞，灼烧接种针灭菌。
⑥接种过的试管直立在试管架上，然后培养。
⑦如果有运动能力的细菌，从接种线向外运动，所形成的接种线较粗，反之则细。
（五）思考题
（1）为什么接种环灼烧后要在无菌的培养基上蘸一蘸？
（2）如何检查细菌是否能够真正地运动？
三、纯培养菌种的菌体、菌落形态特征观察
（一）实验目的
（1）基本掌握不同培养基的配制方法。
（2）通过观察比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，初步达到鉴别上述四种菌落特征的能力。
（二）仪器和材料
（1）恒温培养箱、显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等。
（2）细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四种培养基配方（表1-1～表1-5）。
表1-1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
注：用于培养细菌，具体配制方法：将上述各成分加入900mL蒸馏水中，煮沸至琼脂完全溶解，加热过程中不断搅拌，避免糊底。用蒸馏水补充至1000mL，调整pH为7.0～7.2。趁热用纱布或脱脂棉过滤，分装灭菌后，冷藏备用。
表1-2 淀粉琼脂培养基（高氏一号）
续表
注：用于培养放线菌，具体配制方法：配制时先用少量冷水将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅拌边加水及其他药品，加热溶解后，补充水分至1000mL。
表1-3 蔗糖硝酸钠培养基（查氏培养基）
注：配制方法同牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。适合于鉴定多数霉菌，如用于分离霉菌时，可加乳酸调制成pH为5.0～5.5的酸性培养基。
表1-4 马铃薯培养基
注：用以培养酵母菌，具体配制方法：新鲜马铃薯去皮，切成薄片，称200g，加蒸馏水1000mL，煮沸0.5h，用四层纱布过滤，补足因蒸发而减少的水分，即制成20%马铃薯汁，然后再加入计算量的葡萄糖（或蔗糖）和琼脂。加热熔化并用玻璃棒从加热容器底部不断搅拌，直至所有组分完全溶解。如果在上述培养基中加入1%的酵母粉或蛋白胨，则能促进孢子的大量增加。
表1-5 豆芽汁培养基
注：适用于酵母菌和霉菌的培养，具体配制方法：先将洗净的豆芽放在水中煮沸30min，用两层纱布滤去豆芽，将豆芽汁补足水分，加糖（培养酵母菌时，糖量要高）。
（三）实验内容及方法
1.四种菌的培养
在无菌操作下，用接种环分别挑取平板上生长的各种菌，并把它们分别接种于各个培养基上，培养细菌的培养皿，置于37℃恒温培养箱中，培养24～48h，放线菌、酵母菌、霉菌在28℃下培养3～7d。
2.菌落形态特征的观察与比较
不同微生物的个体及其群体，在培养基上的菌落特征不尽相同，一般通过菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、颜色、气味、透明度、黏滞性、表面光滑与粗糙、质地软硬等综合情况进行判别。
将培养好的菌落逐个观察、比较，描述各种菌的菌落特征，并记录、绘制菌落形态图。四种菌的菌落形态特征如下：
（1）细菌 菌落多为光滑型，湿润或较湿润，质地软，菌落与培养基结合不紧，表面结构及边缘结构特征较多，透明或半透明，具有各种颜色，菌落正反面的颜色基本相同，但也有干燥、粗糙的，有的呈霉状但不起绒毛。
（2）酵母菌 菌落呈圆形，大小接近细菌，表面光滑，质地软，颜色多为白色和红色，稍透明，菌落和培养基结合不紧，菌落正反面的颜色基本相同。
（3）放线菌 菌落硬度大，干燥致密，且与基质结合牢固，不透明，不易被挑取，菌落表面呈粉状或褶皱呈龟裂状，颜色多样，菌落正反面颜色一般不同。
（4）霉菌 菌落干燥，绒状或棉絮状，大而疏松，不透明，能扩散生长，用接种环易挑取，菌落与培养基结合较牢固，颜色多样且鲜艳，菌落正反面颜色一般不同。（注意如果做分离实验少，得到的单菌落可能还不太纯，镜检时会出现多种形态。）
（四）思考题
1.实验中哪几个步骤为无菌操作？
2.通过实验，能根据菌落特征辨别不同的微生物吗？
四、紫外线杀菌实验
（一）实验目的
了解紫外线的杀菌作用原理，学习紫外线杀菌实验方法。
（二）实验原理
紫外线对微生物有很强烈的致死作用，微生物对紫外线的吸收与剂量有关。剂量高低取决于紫外灯的功率、照射距离与照射时间。此外紫外线穿透力很弱，普通玻璃、薄纸、水层等均能阻止其透过，故紫外线只限于进行物体表面或接种室的空气灭菌。经紫外线照射后的受损细胞，遇光会有光复活现象，故处理后的接种物应避光培养。
（三）实验器材
（1）活材料 培养好的细菌。
（2）培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
（3）器材 无菌水、无菌培养皿、1mL无菌吸管、玻璃刮铲、灭菌五角星形图案纸、紫外灯箱。
（四）实验方法
（1）制平板 取无菌培养皿6套，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入培养皿中，使之冷却成平板。
（2）菌悬液制备 取试管无菌水2支，以无菌操作法取培养好的两种细菌各2环，接入无菌水中充分摇匀，制成菌悬液。
（3）接种 将培养皿分成两组，分别接种菌悬液各0.1mL，用无菌刮铲涂匀，随即用无菌镊子夹取无菌图案纸小心放在接种好的平皿中央。接种图如图1-15所示。
图1-15 接种图
（4）紫外线处理 将紫外线灯先预热2～3min，再将上述培养皿置于紫外灯下，打开皿盖，在30cm距离处照射。一组1min，一组5min，一组10min，小心地取下图案纸，盖上皿盖。用黑布或厚纸遮盖，送入培养箱。
（5）培养 将培养皿于28～30℃下培养48h。
（6）取出培养皿观察并分析平板上细菌生长的状况，绘图表示。
（五）实验作业
记录观察到的结果，填写表1-6。
表1-6 实验结果记录表
五、水体中细菌菌落总数的测定
（一）概述
细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异氧菌密度的方法。因为细菌能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以，由此法所得的菌落可能要低于真正存在的活细菌的总数。
此法主要作为判定饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。
（二）实验目的
（1）了解和学习水中细菌总数的测定原理和测定意义。
（2）学习和掌握用稀释平板记数法测定水中细菌总数的方法。
（三）实验原理
水是微生物广泛分布的天然环境。水中的微生物主要来源有水中的水生微生物（如光合藻类），来自土壤径流、降雨的外来菌群，来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
细菌菌落总数（CFU）是指1mL水样在牛肉膏琼脂培养基中，于37℃培养24h后所生长的腐生性细菌菌落总数。它是有机物污染程度的指标，也是卫生指标。《生活饮用水卫生标准》（GB5749—2006）规定：细菌菌落总数在1mL自来水中不得超过100个。
（四）仪器器材
牛肉膏蛋白胨培养基和灭菌的平皿、移液管、试管等。
（五）实验内容与操作方法
1.自来水
（1）采集自来水水样 先将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌，再开放水龙头，流水5min后，用无菌的三角瓶取水样，如果水样含有余氯，则采样瓶灭菌后，按每500mL水样加3%的Na2S2O3·5H2O溶液1mL。
（2）以无菌操作方法，用无菌移液管吸取1mL水样注入无菌培养皿中，倾注15～20mL已熔化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，平放于桌上迅速摇匀，使水样与培养基充分混匀，凝固后倒置于37℃培养箱中，培养24h，然后进行菌落计数。每个水样倒三个平板，另取一个做空白对照，三个平板的平均菌落数即为1mL水样的细菌菌落总数。
2.水源水（江、河、湖、池等地表水体）
（1）水体取样 可以采用采样器或带塞的玻璃瓶取样。采样器或带塞的玻璃瓶提前灭菌，将带塞的玻璃瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拿掉瓶塞，瓶口逆着水流方向取水，水量不要过满，水面到瓶口留有2～3cm的空隙，盖上瓶盖，再将玻璃瓶从水中取出。
（2）稀释水样 在无菌条件下，将水样做10倍系列稀释（图1-16）。
（3）根据对水样污染情况的估计，选择2～3个适宜的稀释度，以培养后平板的菌落数在30～300个的稀释度为合适。吸取1mL稀释液于无菌平皿内，每个稀释度做3个重复。
图1-16
（4）以无菌操作方法，用无菌移液管吸取1mL水样注入无菌培养皿中，倾注15～20mL已熔化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，平放于桌上迅速摇匀，使水样与培养基充分混匀。
（5）培养基凝固后，倒置于37℃培养箱培养24h，计菌落数，算出三个平板的平均菌落数，再乘以稀释倍数即为1mL水样的细菌菌落总数。
（六）菌落计数及报告方法
用肉眼观察，计数平板上的细菌菌落数，也可用放大镜和菌落计数器计数。记下同一浓度的三个平板的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数即1mL水样中的细菌菌落总数。各种不同情况的计算方法如下：
（1）首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告（表1-7例次1）。
（2）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300，则按两者菌落总数之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的菌落总数（表1-7例次2及例次3）。
（3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1-7例次4）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1-7例次5）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1-7例次6）。
（6）在求同稀释度的平均数时，若其中一个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落数分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。
（7）菌落计数的报告，菌落数在100以内时核实有效报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的位数，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，可用10的指数来表示（表1-7报告方式栏）。若报告菌落数“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。细菌菌落测定结果记录于表1-8和表1-9中。
表1-7 计数菌落总数方法举例
表1-8 自来水中细菌菌落数测定结果
表1-9 水源水中细菌菌落测定结果
（七）思考题
（1）根据我国饮用水水质标准，讨论这次检验结果。
（2）测定水体中细菌菌落总数有什么意义？
六、水中大肠菌群数的测定
（一）实验目的
（1）了解和学习水中大肠菌群的测定原理和测定意义。
（2）学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二）实验原理
所谓大肠菌群是指在37℃、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成。
水的大肠菌群数是指100mL检测水样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。我国饮用水标准规定：大肠菌群数每升中不超过3个。
（三）实验器材
（1）锥形瓶、试管、移液管（1mL、10mL）、培养皿、接种环、试管架、酒精灯。
（2）蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠、溴甲酚紫乙醇溶液、蒸馏水。
（3）10%NaOH、10%HCl、精密pH试纸6.4～8.4。
（四）实验前准备工作
1.制作培养基
（1）乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵法的复发酵用）
配方：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、蒸馏水1000mL、pH=7.2～7.4。
制备：按配方分别称取各药品溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH为7.2～7.4。加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀后，分装于试管内，每管10mL，另取一小倒管倒放入试管内。塞好棉塞、包扎好。置于高压灭菌锅内，0.07MPa、115℃灭菌20min，取出置于阴冷处备用。
（2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供多管法初发酵用）按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于试管中，每管5mL。再分装大试管，每管装50mL，然后在每管内放置小倒管。塞棉纱、包扎，置高压灭菌锅内以0.07MPa灭菌20min，取出置于阴冷处备用。
2.水样的采集、保存和处置
可用自来水或受粪便污染的湖、河水。
（五）实验步骤
多管发酵法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度高的水中的大肠菌群测定。
1.生活饮用水的测定步骤
（1）初步发酵实验 在2支各装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大发酵管中，以无菌操作各加入100mL水样；在10支各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，以无菌操作各加入10mL水样，混匀后置于37℃恒温箱中培养24h，观察其产酸产气的情况。
情况分析：
①若培养基红色不变为黄色，小导管没有气体，即不产酸不产气，为阴性反应，表明无大肠菌群存在。
②若培养基由红色变为黄色，小导管有气体产生，即产酸又产气，为阳性反应，说明有大肠菌群存在。
③培养基由红色变为黄色说明产酸，但不产气，仍为阳性反应，表明有大肠菌群存在。
④若小导管有气体，培养基红色不变，也不浑浊，是操作技术上有问题，应重做检验。
以上结果为阳性者，说明水可能被粪便污染，需进一步检验。
（2）确定性实验 用平板划线分离，将经培养24h后产酸（培养基呈黄色）、产气或只产酸不产气的发酵管取出，以无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基（或伊红美蓝培养基）平板上划线分离，共三个平板。倒置于37℃恒温箱内培养18～24h，观察菌落特征。如果平板上长有如下特征的菌落并经涂片和进行革兰染色，结果为革兰阴性的无芽孢杆菌，则表明有大肠菌群存在。
在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征：
①紫红色，具有金属光泽的菌落；
②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
③淡红色，中心色较深的菌落。
在伊红美蓝培养基平板上的菌落特征：
①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
③淡紫红色，中心色较深的菌落。
（3）复发酵实验 用无菌接种环在具有上述菌落特征、革兰染色阴性的无芽孢杆菌的菌落上挑取一环于装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的发酵管内，每管可接种同一平板上（即同一初发酵管）的1～3个典型菌落的细菌。盖上棉塞置于37℃恒温箱内培养24h，有产酸、产气则证实有大肠菌群存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性菌（瓶）数，查表1-5至表1-8，报告每升水样中大肠菌群数。
根据阳性管数及实验所用的水样量，运用数理统计原理计算出每升（或每100mL）水样中总大肠菌群的最大可能数目（MPN），可用下式计算：
式中 A——阳性管数
B——阴性管数水样体积，mL
T——全部水样体积，mL
MPN的数据并非水中实际大肠菌群的绝对浓度，而是浓度的统计值。为了使用方便，现已制成检索表。所以根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数可直接检索表1-5至表1-8，即得结果。
2.水源水中大肠菌群的测定步骤
（1）稀释水样 根据水源水的清洁程度确定水样的稀释倍数，除严重污染外，一般稀释倍数为10-1及10-2，稀释方法见实验五所述的10倍稀释法，均需无菌操作。
（2）初步发酵实验 在无菌条件下，用无菌移液管吸取1mL10-2和10-1的稀释水样及1mL原水样，分别注入装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的5个发酵管中，另取10mL原水样注入装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，如果为较清洁的水样，可再取100mL水样注入装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵瓶中，置37℃恒温箱中培养24h后观察结果。以后的测定步骤与生活饮用水的测定方法相同。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管数或瓶数查表1-10至表1-13，即可求得每100mL水样中存在的大肠菌群数，乘以10即为1L水中的大肠菌群数。
表1-10 大肠菌群检验表 单位：个/L
注：水样总量300mL（二份100mL，十份10mL）。此表用于检测生活饮用水。
表1-11 大肠菌群检验表（-1） 单位：个/L
注：水样总量111.1mL。+表示有大肠菌群，—表示无大肠菌群。
表1-12 大肠菌群检验表（-2） 单位：个/L
注：水样总量11.1mL。+表示有大肠菌群，—表示无大肠菌群。
表1-13 大肠菌群的最可能数 单位：个/100mL
（六）实验作业
将实验结果记录在表1-14中，并对所测样品进行评价。
表1-14 监测分析原始记录（生物）
七、空气中浮游微生物的测定
（一）实验目的
（1）通过实验了解不同环境条件下空气中微生物的分布状况。
（2）学习并掌握空气中微生物测定的基本方法。
（二）实验原理
空气不是微生物生存的良好环境，然而，在空气中仍存在着相当数量的微生物。但是，其最终还是要沉降到固体表面或地面上。通过这一特点，空气中的微生物沉降到固体培养基的表面，经过培养，形成肉眼可以看到的细胞群体，即菌落。观察菌落的大小、形态，可以大致鉴别空气中存在的微生物种类。利用计数菌落数，按公式推算单位体积内微生物的数量。
（三）仪器和材料
（1）培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、查氏琼脂培养基。
（2）仪器 高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、空气采样器等。
（3）器皿 灭菌培养皿、三角瓶、无菌水等。
（四）实验内容与操作方法
1.沉降法
（1）标记培养皿 分别在皿底贴上标签，注明所用的培养基，同时进行编号。
（2）制作平板 将熔化的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯培养基，各倒入15个培养皿，冷凝。
（3）采样 在一定的面积内（室内或室外）按5点采样法，每种培养基、每个点放3个平板，打开培养皿盖，暴露5min或10min后，盖上培养皿盖。
（4）培养 将培养皿倒置，培养细菌的培养皿置37℃恒温培养箱培养24～48h，培养真菌和放线菌的培养皿置28℃恒温培养箱培养3～7d。
（5）观察 培养结束后，观察各种微生物的菌落大小、形态、颜色等特征，并记录。
（6）计算 计数平板上的菌落数，根据奥梅梁斯基换算公式计算出1m3空气中的微生物数量。如果平板培养皿的面积为100cm2，在空气中暴露5min，于37℃下培养24h后长出的菌落数，相当于10L空气中的细菌数，即：
式中 X——每立方米空气中的菌落数，个/cm3空气
N——平板培养基在空气中暴露5min，于37℃恒温培养箱培养24h后长出的菌落数，个/cm2
r——皿底半径，cm
2.过滤法
（1）准备 盛有10L蒸馏水瓶，100mL无菌水的三角瓶。
（2）安装 安装好空气采样器，将采样器分别放在5个采样点上。
（3）采样 打开10L蒸馏水瓶，使水缓缓流出，外界空气经过喇叭口进入100mL无菌水的三角瓶中，10L蒸馏水流完后，10L空气中的微生物被滤在100mL无菌水的三角瓶中。
（4）培养 将5个三角瓶的液体摇匀，分别从中吸取1mL注入无菌培养皿中（平行3个皿），之后，加入已经熔化的冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，摇匀，凝固后，置37℃恒温培养箱培养。培养放线菌和真菌相同方法。
（5）计算结果 培养24h，依平板上长出的菌落数，计算出每升空气中细菌的数目。先按下列公式计算出每一套采样器的细菌数，再求出5套采样器的平均值。
式中 s——1mL水中培养所得菌数，个/L空气
（五）思考题
（1）试比较沉降法和过滤法测定空气中微生物数量的异同点。
（2）试分析沉降法测定空气中微生物数量的优缺点。
（3）在空气微生物的测定中，应从哪几个方面确定采样点？
八、土壤中微生物的测定
土壤是微生物生长、繁殖及进行生命活动的天然培养基，土壤中微生物存在的种类多、数量大。通过测定土壤中微生物的种类、数量，了解土壤肥力及有机物降解、转化情况。
（一）实验目的
（1）学习土壤微生物样本的采集方法。
（2）了解土壤中微生物主要种群及其数量存在状况。
（3）了解微生物在土壤中的作用。
（二）仪器和材料
（1）培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）、淀粉琼脂培养基（培养放线菌）、查氏培养基（培养霉菌）。
（2）仪器 高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、移液枪等。
（3）器皿 灭菌培养皿、灭菌三角瓶、灭菌试管、无菌水等。
（三）实验内容与操作方法
1.土壤采样
（1）采样前准备 采样前应准备好灭菌的小铲、土钻若干把，灭菌的纸袋、铝盒、记录本。
（2）采样地点 根据实验要求选择采样地点，同时记录采样日期、时间；采样地的特点；土壤类型或土地利用方式；植被状况等。
（3）采样方法 在一定的土壤范围内，可采取蛇形或棋盘或五点法不同点取样，最少为5个点，每个点取约100g土样，放入纸袋中，并在采样袋上写明日期、时间、地点、采样人及采样深度等内容。
（4）样品保存 将采集的土样迅速带回实验室，准备测定。如不能及时测定，将土样放在4℃的条件下保藏，时间不要超过24～48h。
2.土壤微生物的测定
（1）配制土壤浸出液 将同一土壤范围的土样混合均匀，称取土样5g，加入装有45mL的无菌水的三角瓶中，再装入若干玻璃珠，充分振荡或在摇床上震荡10min，静置2min，制成10-1的稀释液，如果土壤中有机物质含量高，视情况制成10-2、10-3、10-4、10-5等不同稀释梯度的稀释液。
（2）土壤微生物的测定 每种土样选择3个稀释度，每个稀释度设3次重复。用无菌吸管吸取1mL的土壤悬液于无菌培养皿中，再加入已熔化并冷却至约45℃的培养基，然后轻轻地摇动，混合均匀。凝固后，倒置于37℃的恒温培养箱中培养。
（3）菌落计数 进行平皿计数时，可用肉眼观察计数，也可用放大镜和菌落计数器，记下同一浓度的3个平板的菌落数，计算平均值，再乘以稀释倍数。
（4）计算 计算出每克土壤中微生物的个数。
（四）思考题
（1）制作土壤浸出液时，为什么要充分震荡？
（2）如果土壤采集的量偏少，可能会出现什么问题？