任务2 微生物实验室规则

学习要求

1.了解食品微生物实验室危害的来源。

2.学习并掌握食品微生物实验室管理制度。

3.学会编写微生物实验室规则。

4.了解无菌室的设置要求。

5.掌握无菌室的灭菌方法。

6.掌握无菌室的操作规则。

知识准备

一、微生物实验室安全

（一）微生物实验室危害来源

实验室人员面临很多危害。有来自化学方面的有毒、易燃、易爆、腐蚀和致癌物的危害，有时还要面临高压、紫外线和其他辐射的危害。另外，微生物工作者还会受到来自微生物菌株的危害。

具体包括：

（1）潜在感染性物质的食入。

（2）感染性物质与皮肤和眼睛的接触。

（3）破损玻璃器皿的刺伤所引起的接种感染；锐器损伤（如通过皮下注射针头）可能引起意外注入感染性物质。

（4）实验室仪器、设备的使用不当（如移液管、绝缘损坏或接地不良的电器设备、高压灭菌锅等的使用）。

（5）感染性物质的溢出扩散（如废弃物、感染性材料所用的培养物、被污染的玻璃器皿、阳性的检验标本等带来的污染）。

营养琼脂和乳琼脂等培养基可以认为是无害的，但是当用作食品平板计数时，就可能存在危害，因为食品很容易被金黄色葡萄球菌和沙门菌等多种致病菌污染，这些致病菌能在这类培养基上生长，使得原来存在于食品中的少量致病微生物在培养基中大量繁殖，被吸入人体后可引起感染。

（6）气溶胶和空气中孢子的危害。

气溶胶是悬浮于气体介质的固态/液态微粒形成的相对稳定分散体系。必须强调的是，并不是说没有破损就不存在危险，滴加到培养皿中的菌液能将微生物气溶胶释放到空气中。微生物气溶胶十分危险，它很容易被不知不觉地吸入肺中，且很小的剂量就会对肺造成严重的影响。原来认为很多小真菌能在开放的实验室培养，但现在也怀疑它们会引起过敏反应或引发疾病，因为小真菌的分生孢子很轻，很容易在空气中扩散。因此必须采取适当的措施加以控制。

（二）微生物实验室生物安全管理

1.对微生物危害的预防

（1）人员防护

①进入实验室必须穿工作服，不要穿着工作服到实验室以外的地方。

②使用过的工作服在清洗前要先进行高压灭菌。

③当可能遇到传染性强的致病菌时，使用一次性外科手术手套，使用后高压灭菌。

④禁止在实验室吃食物、喝水、吸烟。

⑤使用黏性标签，禁止用舌头舔标签，禁止在工作中将钢笔或铅笔尖放入嘴中。

⑥若实验员身上有划伤或擦伤，要保证不让水漫湿伤口。另外，也可以戴一次性外科手术手套，但要在丢弃前先进行灭菌处理。

（2）意外事故急救措施当发生诸如菌株外泄、划伤和擦伤等意外事故时，应立即停止实验工作进行紧急处理，采取适当的急救措施，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗，污染表面可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2h以上（其间适量加溶液防止干燥），再经紫外灯近距离（1m内）照射2h以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2h以上后清理干净，将污染溢出物和用于清洁的纱布放入可耐受高压的双层塑料袋内并尽快施以高压。同时对该区域进行检测，证明已彻底灭菌，以防止其他工作人员被感染。用镊子将玻璃碎片夹入放尖锐物的专用坚硬容器中，在高压锅中灭菌，并要进行记录。

实验室所有人员应该知道急救箱、冲眼洗瓶和灭火器的存放位置。化学实验室和微生物实验室应列明可能存在的危险的清单，并便于查找，以便在意外事故发生后能将详细信息及时提供给医生。

（3）气溶胶和空气中孢子危害预防

①当菌液掉到地板上时，不应该立刻清理，要先用杀菌溶液消毒一段时间以降低产生的气溶胶的浓度。

②用移液管快速用力地吸取菌液会产生气溶胶，使用接种环，甚至移去装菌体的螺帽或棉塞时，都会形成气溶胶。因此在微生物实验室操作时动作应缓慢。

③产孢真菌在没有气溶胶形成的条件下仍能引起呼吸道感染和过敏反应，因此，应在不通风的环境中缓慢地操作，尽量避免突然的动作（致病真菌应在合适的接种箱中操作）。

④在没有足够的预防措施时，不能使用匀浆器和混合器处理污染空气的细菌菌体。用这些器具处理微生物含量较低的食品时，不会产生危害。如要制备食品样的稀释液，最好的方法是使用均质器，它可以减少气溶胶的产生。

（4）实验室工作

①使用接种环时要特别小心才能避免造成空气和工作区域的污染。接种针和接种环在使用前后一定要灭菌，在火焰上加热整个接种针和接种环直至发红。没有安全灭菌炉和灭菌装置时，为避免环上的物质飞溅，可将接种环缓慢地伸入火焰加热灼烧。

②装有菌株的试管始终要放在试管架上，不要放在试验台边缘。

③微生物实验室经常培养致病菌。严格禁止用嘴移取液体。移液管中的棉花只能防止液体不被污染，却不能防止使用者被感染。要使用安全移液器，如橡皮吸球或移液泵。把移液管插入移液泵前，检查移液管是否有碎玻璃，然后将移液管轻轻旋转地插入移液泵中。

④用过的试管要放入盛有灭菌液的灭菌缸中，显微观察用过的载玻片和盖玻片分开后放入灭菌缸中，并保证所有的物品全部浸入灭菌液中。

⑤匀浆器和搅拌器只有在安全柜中才能用于粉碎含菌株的样品，操作产生的气溶胶会产生危害。在实验室使用均质器可以大大减少气溶胶的产生。

⑥正压的接种只能用于无菌测试，而不能用于微生物菌株的操作（致病性较高的菌株要在全封闭的接种室或负压接种箱中进行，负压接种箱的排风口要安装适当的滤膜将致病菌滤掉，以确保排出气体的安全）。

（5）致病菌株的使用 在许多国家，致病菌的分类和其培养的实验室设计、操作都有详细的导则和规范。例如，英国危害菌种咨询委员会（ACDP，1990）对微生物菌种进行分类管理并提出了不同类别菌种的控制方法。许多类似的导则和规范都出自医院和相关部门的病理学实验室或微生物实验室，因为这些机构的工作人员最容易被致病菌感染。食品厂的微生物工作者从实验室进入食品加工区时容易造成交叉污染，因此最好将实验室与食品加工区进行相应的物理隔离。

食品的质量保证试验会涉及菌落计数，最近似值（MPN）计数或和其他菌株的培养，但上述操作禁止在制备发酵食品菌株的实验室内进行，即使是用于发酵菌株本身质量评价的菌落计数也被禁止。因为这些操作难免会带入少量潜在的致病菌。

（6）离开实验室的程序

①完成实验室工作后，应将工作区域清扫干净后再离开，已用过的物品和培养液等不能放在操作台上，而要放在特制的手推车上准备灭菌。最后用适当的消毒液（如0.5%的碘酒）对工作区域消毒。

②任何时候离开实验室时，都要先将手彻底消毒洗净。

（7）实验室物质处理

①黑色塑料袋用来收集未污染或经高压过需处理的废物。

②废纸屡用来收未污染的废纸、用过的纸巾等。

③所有可能传染的物质必须高压或焚化，高压的最大好处是使传染性物质离开实验室，可保证安全。

④所有丢弃的标本、培养基和实验室废物必须放在专门容器里。

⑤用白色聚丙烯罐盛装2%新鲜配制次氯酸液，以供工作中临时处理丢弃标本、污染吸头、棉拭子，待一天工作结束之后，再经高压处理。

⑥黄色塑料袋用来处理污染的实验室废物，它们应封口再由工人拿去焚烧。

⑦带盖、带标签硬质容器用来盛装针头的锐器。

2.对化学危害的预防

（1）预防措施 对于危害极其严重的物质（如法律规定的致癌物质），要采取各种严格的措施加以控制，国家制定的相关法规应采用书面的形式，并附带操作草案，这个草案要对适当的弃置程序和紧急情况进行描述。这些程序要经过高级管理人员的同意（如安全、技术负责人）。书面草案的副本应由安全员保管，急救员和相关现场紧急救助人员（如消防人员）的档案应当保存在现场安全办公室。

每个实验室都应有所用化学物质的清单，列出每种化学物质的特性、相关的操作程序和弃置程序、使用标准的统计图表（表中列明化学物质危害的类型——有毒物、刺激物、腐蚀性物质和易燃物质等）。对所有涉及化学物质使用的操作步骤都应进行风险评估，工作液的瓶子上同样要加贴标签，以便于对使用的所有化学物质进行风险评估。如，V－P反应液或Kovaes试剂有毒，应加贴警示标签。有时粉末状的脱水培养基有毒，但配制成培养基后却没有特殊危害，这时就不需加贴警示标签。使用后的瓶子由他人清洗时，应告知清洗瓶子的人员瓶内废弃物是否存在有危害的物质。瓶中含有危害物质而未加贴标记会使很多清洗人员受到伤害。

（2）有毒有害物质的称量 因空气流动产生的影响，在通风橱中使用分析天平十分困难。现在有一种现成的称量系统，其放置天平的容器能保持轻微的负压，工作时废气经高效的离子滤膜过滤后排放。如果没有上述装置，对于危险的化学物质，也可采用以下方法称量。例如对丙烯酰胺粉末、铊化合物、硒盐和NNN′N′－四甲基－对次苯醇胺二盐酸等有毒、易爆类化合物的称量可以使用以下方法。

①称量一个空的、干净的螺帽容器；

②将预备称量的容器和化学试剂瓶拿到通风橱内；

③采取适当的保护措施防止药品与皮肤接触，将所需量的试剂移入预称量的螺帽容器中，并盖住螺帽；

④将已装有化学物质并盖好螺帽的容器放到天平上，称重；

⑤用称量后的总量减去容器的质量得到化学试剂的质量，然后根据化学试剂的质量，计算出配备溶液所需液体的体积；

⑥将密闭的容器、溶液拿回通风橱，采用适当的保护措施配成所需的化学溶液。

3.实验室制度中还应包括的内容

（1）特定岗位的实验操作应由称职的人员进行，离心机、高压锅、高效液相色谱、气相色谱仪和电泳仪等特殊仪器的操作，需要由仪器制造商对使用人员提供特殊培训后操作使用。

（2）应采用适当的人员防护措施，常规的防护包括穿工作服和戴防护眼镜；一些特殊工作还需要佩戴手套和面罩；戴隐形眼镜的人员仍需佩戴防护眼镜，因为化学物质溅入眼睛后可以渗透隐形眼镜并在隐形眼镜摘除前损伤眼睛，很稀的碱液也会引起永久性的角膜损伤。

（3）稀释或溶解腐蚀性的溶液和倾倒这类溶液时要特别小心，稀释强酸、强碱时要将溶质缓缓倒入水中，并不停搅拌，因为这些物质在溶解时会放出大量热量（如浓硫酸溶于水时）。

（4）不要让电线通过工作区域，操作台上方只能设置调节器和接线盒等；不要使用损坏的仪器、磨损的电线和损坏的插头。

（5）组装玻璃器皿时要用管夹和铁架台固定；滴定管中装液体时要使滴定管的顶部低于眼睛的水平线，而且要使用漏斗。

（6）气瓶不能随意摆放，可以固定在操作台上或气瓶支撑架上。

（7）试管穿过皮塞时，先用润滑剂润滑试管（如用液体清洁剂），然后用布握住皮塞，缓缓旋转试管插入。

（8）拿瓶子时，不要只拿瓶子的颈部和瓶盖；同时搬运多个瓶子时，要使用瓶子运送器；运送装有强酸强碱瓶子的容器要采用中等的防碎材料（如塑料容器）；装氨水的容器中有正压，开启时要特别小心；装过氧化氢的容器不要盖得太紧。

二、无菌室的准备

在微生物实验中，菌种的移植、接种和分离等工作，都要排除杂菌的污染，才能获得纯的符合要求的微生物纯培养体。为此，除严格按无菌操作进行外，尚需要有一个无杂菌污染的工作环境。通常，学生实验课时可在酒精灯旁进行无菌接种；小规模的操作可以使用无菌箱（接种箱）或超净工作台；工作量大的使用无菌室（接种室）；要求严格的可在无菌室内再结合使用超净工作台。

1.无菌室的设置

无菌室的设置可因地而宜，但应具备以下基本条件：

（1）无菌室要求结构严密，避免太阳直射，但应光照好，以玻璃为佳。室顶设立百叶排气窗口加窗封盖板，可以启闭，也可在窗口用数层纱布和棉花蒙好（但应常更换）。无菌室侧面靠底部应设进气孔，也应加可随时启闭的密封盖板，以便用后排湿通风。

（2）无菌室一般是有里外两间，较小的外间为缓冲间，以提高隔离效果。

（3）无菌室应安装推拉门，以减少空气流动。必要时，在向外一侧的玻璃上，安装一个双层的小型玻璃橱窗，便于内外传递物品，减少人员进出无菌室的次数。

（4）室内应有充足的照明、电热和动力用的电源。

（5）工作台台面应很平整、抗热、抗腐蚀、便于洗刷，可采用橡胶板或塑料板铺于台面。

（6）无菌室的里外两间均应安装照明灯和紫外线杀菌灯，吊装在经常工作位置的上方。

（7）缓冲间内应放置隔离用的工作服、鞋、帽、口罩、消毒用药物、手持式喷雾器、废物桶等。无菌室应有接种用的常用器具如酒精灯、接种环、接种针、不锈钢刀、剪刀、镊子、酒精棉球、玻璃铅笔等。

2.无菌室的杀菌

（1）方法

①紫外线灯照射：在每次工作前后均应打开紫外线灯，分别照射30min，进行杀菌。忌在紫外线灯开着的情况下进入室内，更不能在开着的紫外线灯下工作。

②熏蒸：先将室内打扫干净，打开气孔和排气窗通风干燥后，重新关闭好再进行熏蒸杀菌。常用的熏蒸药剂为福尔马林（含37%～40%甲醛的水溶液）。按6～10mL/m3的用量盛于铁制容器中，加半量高锰酸钾，通过氧化作用加热使福尔马林蒸发。熏蒸后应保持密闭12h以上，最好是隔夜。甲醛气体未散尽而要使用无菌室时，则在使用无菌室之前1～2h，按所用甲醛溶液量量取氨水，倒入搪瓷盘内，放入无菌室，使其挥发中和甲醛气体的刺激作用。除甲醛外也可用乳酸、硫磺等进行熏蒸杀菌。

③石炭酸液喷雾：在进接种室操作前，用手持喷雾器喷5%石炭酸溶液，主要喷于台面和地面，以防空气微尘飞扬。

（2）无菌室空气污染情况的检验为了检验无菌室内的无菌程度，需要定期在无菌室内进行空气中杂菌的检验，可在使用前或使用后进行，方法是：取牛肉膏琼脂和马铃薯蔗糖琼脂两种培养基的斜面和平板各3个，于无菌室使用前（或使用后），在无菌室内揭开皿盖放置台面上，0.5h后重新盖上，另一皿不打开作对照。两者同时放30℃下培养，48h后检验平皿培养基表面有无菌生长及菌落数量，根据检验结果采取措施。无菌室杀菌后使用前检验的结果应是无菌生长。如有霉菌生长则表明室内湿度过大，应通风干燥后再灭菌；如有细菌生长为主时可采用乳酸熏蒸，效果较好。

3.无菌室的操作规则

（1）将所用的材料、用品先全部放入无菌室内，以避免在操作过程中进出无菌室或传递物品（如同时放入了培养基，则需用牛皮纸遮盖），使用前打开紫外线灯，照射0.5h后，关闭紫外线灯，过一会儿才能使用。

（2）进入缓冲间，换好隔离工作服、鞋、帽，戴上口罩，用2%新洁尔灭（或煤酚皂液）将手浸洗1～2min后，再进入工作间。

（3）操作前再用酒精棉球擦手，然后严格按无菌操作进行工作。

（4）工作后应将台面收拾干净，废物丢入废物桶内，取出培养物品及废物桶，用5%石炭酸喷雾，再打开紫外线灯照0.5h，以保持无菌室的无菌状态。

【问题思考】

1.无菌室为什么有两间？

2.无菌室为什么有传递物品的窗口？

3.为了达到较好的无菌环境，在紫外灯下工作可以吗？

4.无菌操作时对双手有何要求？

5.实验室工作对工作服有何要求？

6.微生物实验室能不能喝水、吃食物？为什么？

7.实验室工作时如果有伤口怎么办？

8.菌液洒到桌面怎么办？

9.微生物实验室操作时动作为什么要缓慢？

10.用吸管吸取液体时可否用嘴吸？

11.离开实验室时应注意什么？