4.6 NOE效应及其应用
弛豫效应在NMR中的应用通常分为两类，即结构和动力学。一般说来，在动力学研究方面自旋晶格弛豫时间T1值更有用；而结构确定方面NOE效应更重要。尽管这两个方面有一些交叉，但总体来说，为了得到分子结构和（或）构象方面的信息，我们需要了解该分子在动力学方面的性质等，又如，利用NOE效应来确定高柔韧性分子的构象有时是困难的。
4.6.1 季碳原子
有机分子的13C自旋晶格弛豫时间受13C-1H偶极相互作用的影响，其中，离碳原子最近的质子对其影响最大。季碳原子由于没有直接键合成键的质子，所以季碳原子的弛豫过程比同一分子内的CH和CH2的碳要慢得多。例如，荧蒽中的四个季碳原子的弛豫速度要比五个次甲基慢5～8倍（见图4.19）。
图4.19 荧蒽的13C自旋晶格弛豫时间和13C{1H}核间奥氏效应（NOE效应）
参见书后的全书参考文献[13]
13C{1H}也有相似的NOE效应（见图4.19）。次甲基碳的NOE增强接近于最大值1.98，正如大多数偶极弛豫机制所预料的一样。对于季碳原子，较小的NOE值是由慢的偶极弛豫和相对较大的其他机制所引起的，而后者并不引起交叉弛豫。如图4.19所示，碳原子f、g和i由于其相邻碳原子均键连着质子（相应的为d、a和c），故其信号被增强，而碳原子h必须依靠较远的质子来增强其信号，故h有较小的NOE值。
4.6.2 CH和CH2中的碳
在刚性分子中，亚甲基碳上的两个质子有偶极相互作用，其弛豫速度是连有一个质子的次甲基碳的两倍。例如，金刚烷中13CH与13CH2自旋晶格弛豫时间的比接近于2.0（见图4.20）。实际的比例1.8可以理解为考虑了β质子（相邻碳上的质子）数的不同，CH有六个相邻的质子，CH2有两个。对于CH碳，由邻位质子引起的额外偶极弛豫是CH2碳的三倍，使其弛豫过程比只考虑该碳原子本身所键合的质子要快。通过标准键长与键角进行简单计算得到的T1比例（CH∶CH2）由2.0降到1.82，与实验值非常接近。最后要提到的是，13C自旋晶格弛豫并不总像金刚烷中的那么简单。在更复杂的低对称性分子中，各向异性翻转和内部运动常会带来更复杂的情况。
图4.20 金刚烷中13CH和13CH2碳原子的13C自旋晶格弛豫时间
参见书后的全书参考文献[14]
偶极弛豫机制与r-6（r为距离）的关系是分子结构信息的重要来源。到目前为止，最有用的弛豫参数是NOE，适当条件下，其值是由单一弛豫机制（偶极弛豫）和单一核间距离决定的，而能提供的信息较少。自旋晶格弛豫时间是由与所邻近原子核进行偶极相互作用后决定的。
4.6.3 NOE值对结构的确定
化学家经常遇到的问题是一个新合成的分子是不是想要的化合物。许多情况下，除了一些细小的但是重要的细节（如立体化学或取代基的位置）外，分子结构是容易确定的。其中，NOE效应提供了一条很有帮助的途径。
如图4.21中N-三异丙甲硅烷基吲哚的三甲基硅烷化有两种可能的三甲基硅烷基衍生物，得到4位或7位的取代物。两种异构体都有五个非等价的芳香质子，所以1H NMR谱中有四个双重峰和一个双重峰的双重裂分峰。除非依靠非常细微的化学位移差别，否则很难确定生成的是哪种化合物。
图4.21 N-三异丙甲硅烷基吲哚的两种可能的三甲基硅烷化产物
图中给出了Si Me3中甲基质子和
的次甲基质子饱和后引起的NOE效应；请读者进一步参阅书后的全书参考文献[15]和[16]
通过两个快速的NOE实验可以解决这个问题。对三甲基硅烷质子的单峰的照射可以增强四个双重峰中的两个双重峰；而对三异丙甲硅烷基中CH质子的多重峰进行照射时，便可以增强另两个双重峰的强度。只有4位的取代物才会出现上面提到的现象，而7位的三甲基硅烷基衍生物在每一个实验中只引起一个双重峰的增强。这是一个应用NOE确定分子结构的成功而简洁的例子，它很容易确定是4位（结构左）还是7位（结构右）引入了三甲基硅烷基。
在对核磁共振信号的精细分析当中，一级谱规则准确性受到限制。我们往往会误认为在同一个基团中质子之间不会出现耦合（如手性中心邻碳两个质子），如甲基上的三个质子，谱图上确实看不到这三个质子的耦合信号，所以会认为在同一个基团内无耦合。我们可以从理论上认为：磁等价核间的自旋-自旋相互作用不会产生多重峰分裂。在目前条件下，可以认为甲基中三个质子无任何耦合。
在复杂谱的报道中，例如对二取代苯衍生物，呋喃衍生物类，如果按一级谱近似好，可以这样报道，但是较多的是按照复杂谱以多重峰m来报道。
4.6.4 NOE效应对蛋白质结构的确定
近年来NMR最引人注目的成就之一就是对溶液中蛋白质的三维结构的确定。从最开始的氨基酸的NMR谱，到现在已经可以确定相对分子质量达20000的蛋白质的结构，包含有150个氨基酸碎片。
图4.22 由NOE效应决定蛋白质的结构
（a）沿着多肽链不同的位置观测核间的NOE效应；（b）其中各点必须相互靠近。用相关计算机程序可以找出符合所有距离限制的结构
用NMR技术测定蛋白质结构的关键就是在分子中已知位置上的一对质子间观测上百个NOE值。这些信息可以与同一碎片或相邻碎片间的原子核联系起来，但更多的是把分子中不同部位的质子联系在一起。这种NOE的“连接”性可以对涉及的质子之间的空间距离进行上限设定，根据情况的不同，从0.2 nm到0.5 nm不等。尽管与蛋白质的整体长度（通常有几百纳米）相比，这一间距限制很短而且往往很不精确，但是如果蛋白质中有足够的质子被扰动，这种方法还是可以很有效地确定蛋白质的结构的（见图4.22）。所需要的只是精确的计算机运算来寻找符合NOE的限制以及三键耦合常数引起的扭角限制的构象。
整个过程取决于以下几个方面。首先，划定一个1H NMR谱图的碎片，也就是说，尽可能多地解析序列中指定共振峰，归属碎片系列中特殊的质子。最初阶段是要确定同一氨基酸碎片中质子所对应的NMR谱线。已知一对质子只有被两三个化学键隔离才会有可能观察到自旋-自旋耦合常数，所以可以列出每一碎片中的自旋-自旋耦合常数来解决以上问题。例如，丙氨酸很容易被确定，因为它是唯一的一个由α-CH质子和侧链（一个甲基）组成AX3自旋体系的氨基酸。
接下来就要通过观测相邻片段中质子间的NOE效应，并与单独的氨基酸自旋体系联系起来，也就是说，相邻的氨基NH质子，它们之间相距0.2～0.5 nm，通过这种方法可以从一个碎片到另一个碎片依次标出谱图。
因此还必须有两种类别的NMR实验：一种用来确定键与键之间的联系（J耦合），另一种则用来确定空间上的联系（NOE效应）。尽管对于小分子可以通过一系列有选择性地激发实验来获得这类信息，例如，依次饱和各个共振峰来观察谱图中其他位置的变化，但是对于蛋白质来说这一方法并不适用，因为会在10个单位的化学位移范围内出现超过1000条的谱线，共振峰都相互重叠着。实际上，随着二维NMR技术的发展，蛋白质结构的确定已经成为可能，这种技术使共振峰分散到二维频率范围中，缓解了峰的拥挤状况，并且在一次实验中就可以获得某种特定的全部相关信息（J耦合或NOE效应），而不需要对选定的频率进行照射。
4.6.5 分子动态结构研究
前面提到，有关分子运动的信息只有在分子结构很好的确定条件下通过弛豫数据来获取。所以许多弛豫研究使用几何“探针”，通常主要以偶极弛豫机制为主，例如CH基团中的13C、NH基团中的15N等。
（1）甲基基团内的旋转 在前面的一个例子中，我们发现CH2中碳原子的弛豫速度几乎是CH的两倍，依此类推，我们可以预测在相同的分子中，一个甲基碳通过直接与相连的三个质子的偶极耦合，这个甲基碳的弛豫速度是13CH基团的3倍。但是，事实并不是这样。这是因为存在甲基基团内部的快速旋转。例如，间三甲苯中甲基碳的偶极弛豫速度比苯环上的碳还要慢（见图4.23）。如果我们还记得在极其窄的范围内，较快的运动意味着较慢的弛豫的话，这一现象就很容易理解了。苯环上的碳原子没有内部的运动，只能靠相应分子的整体缓慢的翻转来改变13C-1H的偶极相互作用而产生弛豫；而苯环上的甲基旋转得更快，使偶极相互作用更有效地被均化，所以弛豫更慢。
图4.23 间三甲苯和邻二甲苯中CH和CH3基团的13C自旋晶格弛豫时间
图中只显示由偶极作用所引起的弛豫时间；参见书后的全书参考文献[17]
如图4.23所示，在邻二甲苯中的甲基和苯环上CH中的13C的自旋晶格弛豫时间T1非常接近。这是因为邻二甲苯中相邻甲基间的空间位阻使基团内的运动变慢，使甲基碳的弛豫速度相对于苯环上的碳要快。对邻二甲苯数据的分析显示，甲基基团内部的旋转速度是分子整体旋转速度的大约12倍，势垒大约为6 kJ/mol。
（2）各向异性旋转 图4.24显示二苯基二乙炔分子中苯环上13C的自旋晶格弛豫时间。由于邻位上β质子数目的不同，处于2号位上的碳原子（C2）的弛豫过程要比C3和C4慢。但实际上，C2和C3的T1值非常相近，而且几乎是C4的5倍。
图4.24 二苯基二乙炔分子中苯环上C2、C3、C4位的13C自旋晶格弛豫时间
参见书后的全书参考文献[18]
这种现象的起因来自这一棒状分子的各向异性旋转：分子绕短轴头对头的运动比绕长轴的运动要慢得多。C4的弛豫过程主要由改变相邻质子与其偶极耦合作用的运动来决定，也就是说，改变C—H键与磁场方向的夹角。显然，从这一方面来看，绕长轴方向的快速旋转的作用不明显，而是绕短轴方向（如图4.24中分子的头对头方向）的运动使C4发生弛豫。因为头对头运动过程很慢，所以分子处于极窄的条件范围内，故使C4的弛豫过程快。相反，C2和C3处的CH旋转矢量离长轴远一点，使绕此轴的快速运动可以改变CH偶极耦合作用，相应，弛豫过程就慢。分子绕短轴（头对头）的运动要比绕长轴的运动慢20倍。
当然这是一个有关各向异性运动的特殊例子，并不是所有的分子都如此偏离球形对称，但是在许多小分子中还是可以辨别出这种各向异性运动引起的效应的。
（3）烷基链 13C自旋晶格弛豫过程可以用来研究高度绕性分子的运动。例如，图4.25所示线性化合物癸烷（C10H22）、二十烷（C20H42）和1-癸醇（C10H21OH）中碳的自旋晶格弛豫时间（纵向弛豫时间）T1值。这些数据可以由分子的整体运动和分子内运动来理解。随着相对分子质量和分子黏度的增加，分子的整体运动速度变慢。而在链端，绕着单个C—C键旋转的分子内运动则比较快。
图4.25 癸烷、二十烷和1-癸醇中烷基链的13C自旋晶格弛豫时间
纵轴以指数为单位；参见Doddrell D，Allerham d A. J Amer Chem Soc，1971，93：1558和Lyerla J R，Mclntyre H M，Torchia D A.Macromolecules，1974，7：11
比较两种烷烃二十烷和癸烷：二十烷翻转慢些，所以一般T1值小，然而却有相对较快的分子内运动，使沿着碳链方向的T1值发生较大的变化，使链端基的弛豫过程最慢；癸烷分子翻转速度更快，且两种类型的运动速率相近，使分子内的运动显得不那么重要，T1值的范围也更小。
对于1-癸醇，由于黏度的增强，T1值比癸烷小，比二十烷小，这反映了由于氢键引起的分子内运动受到限制。
（4）固态苯 由于强烈的分子间和分子内的偶极裂分等作用，温度低于90 K的固态苯的1H NMR谱只有一条宽40 kHz的单峰。如图4.26（a）所示，在90～120 K之间峰突然变尖，一直到接近熔点时，峰形基本上保持不变，此时快速的翻转运动使谱线宽度变窄不到1 Hz。固态苯中谱线宽度的变化是由于分子绕其六重轴重新取向，因而得到偶极相互作用部分地平均化。当旋转频率接近于刚性晶格谱线宽度时，就会发生谱线变窄。
图4.26 固态苯随温度变化的1H NMR谱线宽度和1H的自旋晶格弛豫时间
有关这一运动的更多证明可以由苯环上质子的T1值来得到，该值在170 K时达到最小，如图4.26（b）所示。显然，旋转频率与质子的共振频率是一致的，这一温度条件下为23.4 MHz。
选择性氘代苯的使用使分子间和分子内运动引起的弛豫过程分开，并给出分子间H—H键的距离（0.2495±0.0018）nm，该距离非常符合用X衍射确定的苯的结构数据。苯分子的活化能和苯的自旋指前因子分别为15.5 kJ/mol和9.1×10 s-1。
13C NMR的纵向弛豫时间T1值的大小被用来测定一些生物医学活性分子的挠性结构。也用来研究药物分子与靶点的结构。因为T1值可以用于测定分子在溶液状态下的动力学行为。这可以细化到定量地用来观察碳原子上的质子连接和配位基团的情况。药物分子可以看成是生物大分子的特殊的“配体”，T1可以提供细微的药物配体作用下的大分子的挠性结构变化。一般说来，较长的弛豫时间说明了这部分分子链段的增加，即挠性越大，T1越长。有人测定了一个端基肽链上的碳原子的T1值，说明了链端的基团运动快，则挠性大，则T1长。
如下述一个简单的化合物T1值的变化就比较明显：
理解生命运动中的化学过程依靠对蛋白结构的详尽的理解。酶催化，分子识别，信号转导，配体的键合，蛋白的折叠等都属于核心问题，NMR无疑对研究生物分子的动态结构提供了最可行的方法。最近，瑞士科学家Emsley等通过了位点专一的骨架和支链13C晶格弛豫测定了一种非结晶状态下的蛋白样品，使用了超快魔角旋转技术，通过增加旋转频率到60 kHz，去克服自旋扩散的问题，能够有效地测定位点专一的结构，以及支链上碳原子的纵向弛豫T1，进一步通过结合13C和15N自旋晶格弛豫，能够描述事物大分子的结构及其物理特性。（Lewandowski J R，Sein J，Sass H J，Grzesiek S，Blackledge M，Emsley L. J.Am.Chem.Soc.2010，132，8252）。