三、猪繁殖与呼吸综合征

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）所引起的猪的一种接触性传染病。临诊上以母猪的繁殖障碍及呼吸道症状和仔猪的死亡率增高为主要特征。母猪的繁殖障碍可表现为怀孕后期流产、死产和弱仔，产后仔猪的死淘率增加，断奶仔猪死亡率高，母猪再次发情时间推迟。哺乳仔猪死亡率超过30%，断奶仔猪的呼吸道症状明显，主要表现为高热、呼吸困难等肺炎的症状。OIE将本病列为B类动物疫病，我国把其列为二类动物疫病。

本病1987年在美国初次发现，并呈地方流行性。1990年起先后在美洲、欧洲、大洋洲与太平洋岛屿、亚洲等国家和地区蔓延。目前在世界上的主要生猪生产国均发现了本病。本病已给世界养猪业造成严重的经济损失，包括流产、死产及哺乳期前后猪只死亡的损失、饲料利用率低下、药物费用及劳动力费用增加等，引起了各国普遍重视。因为当时不清楚该病的原因，曾被称为猪神秘病（Swine mystery disease，SMD）、猪蓝耳病（Blue-ear discase）、猪不孕和呼吸综合征（SIRS）、猪流行性流产与呼吸道综合征（PEARS）、蓝色流产等，1991年召开的国际会议上，被正式命名为“猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）”，1996年OIE已将PRRS列入B类传染病。我国郭宝清等于1996年首次在暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。

（一）病毒特征

PRRSV为套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎毒属（Arterivirus）。在美国被称为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），而在欧洲则称其为来利斯塔德病毒（Lelystad virus，LV）。该病毒为小型有囊膜的单链RNA病毒，呈20面体对称，核衣壳直径40～45nm，衣壳上有5mm的突起，病毒粒子的直径为60～70nm，对乙醚、氯仿等敏感。PRRSV无血凝活性。

现已证实至少存在2种完全不同类型的病毒，即分布于欧洲的A亚群及分布于美洲的B亚群。欧洲分离株（欧洲株）与美洲分离株（美洲株）虽然在形态及理化特性方面相似，但用多克隆和单克隆抗体进行血清学检查发现它们存在着较大的差异。典型的差异株是欧洲的 Lelystad毒株和美洲的 ATCC VR-2332株。通过核衣壳蛋白单克隆抗体（MAbs）不仅可以区分欧洲株与美洲株，而且可以区别它们的抗原位点。PRRSV核苷酸序列已确定，将欧洲株与美洲株的氨基酸序列进行比较时，发现欧洲分离株间的序列完全相同，而欧洲株与美洲株间则有显著的差异。

除了已经被确认的LV和VR-2332毒株间的不同外，在北美分离的 PRRSV毒株间也有差异（即类VR-2332），其中包括在同一时间同一猪场分离到的毒株（Mengeling等，1997）。一般情况下这些差异是仅有很少或者不引起表现型改变的少数序列（碱基）的变化，然而，在北美分离株中确实表现出不同的血清型（Nelson，1998）和毒力（Halbur等，1995；Halbur等，1996b； Mengeling等，1996c）。

PRRSV可在猪肺泡巨噬细胞上增殖并产生细胞病变，也可在其他细胞如Marc-145等细胞上增殖。巨噬细胞内的病毒滴度最高可以达到106.5/ml TCID50。分离株 ATCC VR-2332可以在传代细胞系CL-2621上增殖。这些培养细胞于感染后2～4d出现细胞病变，滴度可达107/ml TCID50。

病猪的呼吸道上皮及脾巨细胞内均有病毒抗原存在。从死胎、弱仔的血液、腹水、肺等处可以分离到病毒。

PRRSV对热和pH敏感。37℃48h、56℃45min即丧失活性。37℃12h后病毒的感染效价降低到50%；4℃时，1周内病毒感染性丧失90%，但是在1个月内仍然能够检测到低滴度的感染性病毒。－70℃或－20℃下可以长期（数月到数年）稳定存活，感染猪的肺组织Hank’s液匀浆中的病毒在－70℃保存18个月毒力不变。在pH6.5～7.5环境中稳定，但在pH低于5或高于7的环境下很快被灭活。

（二）临床症状

潜伏期通常为14d。由于年龄、性别和猪群机体的免疫状态、病毒毒力强弱、猪场管理水平及气候条件等因素的不同，感染猪的临诊表现也不同。

繁殖母猪：急性发病后的主要表现是发热，精神沉郁，食欲减退或废绝，嗜睡，咳嗽，不同程度的呼吸困难，间情期延长或不孕。欧洲猪群中病猪出现耳部蓝紫色，同时在病猪的腹部及阴部也出现青紫色（图1-44）。

有时出现呼吸系统的临诊表现。在急性期有1%～3%的母猪可能流产，流产一般发生在妊娠的第21～109d（Hopper等，1992；White，1992）。急性病例发作约1周后，疾病进入第二阶段。这是病毒通过胎盘传播的结果，其特征为妊娠母猪多数在妊娠后期繁殖障碍。它可发生于先前无临诊症状感染的母猪，也可出现于疾病的第一阶段有临诊感染的母猪。第二阶段开始时与第一阶段重叠在一起，但第二阶段比第一阶段长，常为1～4个月。在第二阶段，妊娠100～114d的母猪，有5%～80%可能发生繁殖障碍。大多数繁殖障碍为母猪早产，但也可产妊娠足月或超出妊娠期的仔猪，或者出现流产。所产窝中有不同数量的正常猪、弱小猪、新鲜死胎（分娩过程中死亡）、自溶死胎（分娩前死亡）和部分木乃伊胎儿或完全木乃伊胎儿。当1～4个月流行期进一步发展时，每窝仔猪的主要异常情况从死胎和大的部分木乃伊化的胎儿变为小的较完全木乃伊化的胎儿，到小弱胎儿，到正常大小和有活力的仔猪。在一些猪场，主要的异常猪为活产、早产体弱和体小猪，但少数为死胎。人工接种妊娠84～93d的母猪时，潜伏期为2～4d，继之出现呼吸系统症状和皮肤颜色的改变，如耳尖变蓝等，于感染后6～12d可以观察到该母猪的流产现象。

哺乳猪：在母猪表现繁殖障碍的1～4个月间，出生时弱胎和正常胎儿的断奶前病死率都高（可达60%）。几乎所有的早产弱猪，在出生后的数小时内死亡。其余猪在出生后的第一周病死率最高，并且死亡可能延续到断奶和断奶后，在分娩舍内受到感染的仔猪，临诊上表现为精神沉郁、食欲不振、消瘦、外翻腿姿、发热（持续1～3d）和呼吸困难（闷气）及眼结膜水肿。有一些猪眼结膜水肿严重，导致典型的眼睑和结膜水肿，这是一种近于有“诊断意义”的病变。

断奶和育肥猪：持续性的厌食、沉郁、呼吸困难，皮肤充血，皮毛粗糙，发育迟缓，耳鼻端乃至肢端发绀。病程后期常由于多种病原的继发性感染（败血性沙门氏菌病、链球菌性脑膜炎、支原体肺炎、增生性肠炎、萎缩性鼻炎、大肠杆菌、疥螨等）而导致病情恶化。病死率较高。老龄猪和育肥猪受 PRRSV感染的影响小，仅出现短时间的食欲不振、轻度呼吸系统症状及耳朵皮肤发绀现象，但可因继发感染而加重病情，导致病猪的发育迟缓或死亡。

公猪：公猪感染后出现食欲不振、沉郁、呼吸道症状，缺乏性欲，其精液的数量和质量下降，可以在精液中检查到 PRRSV，并可以通过精液传播病毒而成为重要的传染源，但是公猪的病毒血症对受胎的影响还不清楚。精液变化出现于病毒感染后2～10周，表现为运动能力降低和顶体缺乏。

（三）病理变化

PRRSV能引起猪多系统感染，导致所有的组织都可能被病毒感染，然而大体病变仅出现于呼吸系统和淋巴组织。通常感染猪子宫、胎盘、胎儿乃至新生仔猪。剖检死胎、弱仔和发病仔猪常能观察到肺炎病变。患病哺乳仔猪肺脏出现重度多灶性乃至弥漫性黄褐色或褐色的肝变，可能对本病诊断具有一定的意义。此外，尚可见到脾脏肿大，淋巴结肿胀（图1-45），心脏肿大并变圆，胸腺萎缩，心包、腹腔积液（图1-46），眼睑及阴囊水肿等变化。

组织学变化是新生仔猪和哺乳猪纵隔内出现明显的单核细胞浸润及细胞的灶状坏死、肺泡间质增生而呈现特征性间质性肺炎的表现。有时可以在肺泡腔内观察到合胞体细胞和多核巨细胞。

（四）流行病学特征

易感动物：自然条件下，猪是唯一的易感动物，目前在许多国家的家猪及野猪均有报道。各种年龄猪对PRRSV均具有易感性，但以孕猪（特别是怀孕90日龄后）和初生仔猪最易感。野鸭在实验条件下对PRRSV有易感性，在感染后5～24d可以从粪便排毒但自身不发病，可能为本病的储存宿主。目前尚未发现其他动物对本病有易感性。

传染源：感染猪和康复带毒猪是主要的传染源。康复猪在康复后的15周内可持续排毒，甚至超过5个月还能从其喉部分离到病毒，病毒可以通过鼻、眼分泌物，胎儿及子宫甚至公猪的精液排出，感染健康猪。

传播途径：空气传播是本病的主要传播方式。本病主要通过呼吸道或通过公猪的精液在同猪群间进行水平传播，也可以进行母子间的垂直传播。此外，风媒传播在本病流行中具有重要的意义，通过气源性感染可以使本病在3km以内的猪场中传播。通过鼻腔人工接种细胞培养物可以导致本病。鸟类、野生动物及运输工具也可传播本病。

流行因素与形式：新疫区常呈地方性流行，而老疫区则多为散发性。冬季易于流行传播。病毒在猪群中传播极快，在2～3个月内一个猪群的95%以上均变为血清学抗体阳性，并在其体内保持16个月以上。PRRSV感染受宿主及病毒双方的影响。由于不同分离株的毒力和致病性不同，发病的严重程度也不同。许多因素对病情的严重程度都有影响，如猪群的抵抗力、环境、管理、猪群密度以及细菌、病毒的混合感染等。该病发生后经常可见的并发或继发病原包括猪呼吸道冠状病毒、猪流感病毒、猪链球菌和副猪嗜血杆菌。

PRRSV血清学阴性猪可通过口腔、鼻腔、肌肉内、子宫内、腹腔内接种感染，口、鼻的感染可能是自然感染的途径。多数猪只感染后呈隐性经过，但经口、鼻感染后病毒首先在扁桃体和肺中增殖，各日龄猪只在感染12～24h出现病毒血症，一般持续3～4周。病毒随血液扩散至全身，在淋巴结、脾脏、胸腺、骨髓及肺中增殖。在肺泡巨噬细胞内增殖的病毒能破坏巨噬细胞，使其数量减少、功能减退，从而导致免疫抑制。妊娠中期的胎儿对PRRSV易感，此时病毒对胎盘无作用，但妊娠后期感染时却对胎盘有影响。接种 PRRSV的公猪，有的发病，有的无任何表现，但均可通过精液排毒。

康复猪通常不能再发生感染。应用IFA法可于感染后5～7d检出抗体并可以持续数月，但病毒中和抗体的产生较晚，在感染后4～5周或更晚才能检出。本病的被动免疫可持续4～8周，抗体持续时间取决于从初乳中获得抗体的最初滴度。

（五）预防及治疗

由于该病传染性强、传播快，发病后可在猪群中迅速扩散和蔓延，给养猪业造成的损失较大，因此应严格执行兽医综合性防疫措施加以控制。

（1）通过加强检疫措施，防止国外其他毒株传入国内，或防止养殖场内引入阳性带毒猪只。由于抗体产生后病猪仍然能够较长时间带毒，因此通过检疫发现的阳性猪只应根据本场的流行情况采取合理的处理措施，防止将该病毒带入阴性猪场。在向阴性猪群中引入更新种猪时，应至少隔离3周，并经PRRS抗体检测阴性后才能够混群。

（2）加强饲养管理和环境卫生消毒，降低饲养密度，保持猪舍干燥、通风，创造适宜的养殖环境以减少各种应激因素，并坚持全进全出制饲养。

（3）受威胁的猪群及时进行疫苗免疫接种。国外有弱毒疫苗和灭活疫苗，目前国内已研制出灭活苗，也可根据本地流行的毒株制备灭活苗，猪群接种后能产生一定程度的免疫保护作用。一般认为弱毒苗效果较佳，但只适用于受污染的猪场。后备母猪在配种前进行2次免疫，首免在配种前2个月，间隔1个月进行二免。小猪在母源抗体消失前首免；母源抗体消失后进行再次免疫。公猪和妊娠母猪不能接种弱毒疫苗。

使用弱毒苗时应注意：疫苗毒在猪体内能持续数周至数月；接种疫苗的猪能散毒感染健康猪；疫苗毒能跨越胎盘导致先天感染；有的毒保护性抗体产生较慢；有的免疫往往不产生抗体；疫苗毒持续在公猪体内可通过精液散毒。因此，没有被污染的猪场不能使用弱毒疫苗。

灭活苗很安全，可以单独使用或与弱毒疫苗联合使用。

（4）通过平时的猪群检疫，发现阳性猪群应做好隔离和消毒工作，污染群中的猪只不得留作种用，应全部育肥屠宰。有条件的种猪场可通过清群及重新建群净化该病。

（5）发病猪群可通过合理的药物治疗计划控制细菌继发感染，常用的药物包括金霉素、四环素、恩诺沙星等广谱抗生素；国外有人报道应用阿司匹林结合抗生素对该病有一定的治疗效果。

（六）实验室检测

依据标准：GB/T 18090—2008。

1.范围

本规程规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的分离鉴定、间接荧光试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验和酶联免疫吸附试验等技术要求。本规程适用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断、产地检疫、口岸进出口检疫及流行病学调查等。

2. 病毒分离鉴定

（1）病毒分离

1）病料及处理

① 采取死产或流产胎儿的脑、心、肝、脾、肺。在低温下剪碎、研磨或用匀浆机将组织块捣碎，用灭菌PBS或细胞培养液配成10%～20%组织悬液，加入1000IU/ml的青霉素和1000μg/ml的链霉素（双抗液），于5000～10000r/min在4℃下离心20min。取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，分装，－20℃保存备用。

② 无菌采取血清和胸腔液加入双抗液后，经0.45μm微孔滤膜过滤，分装，－20℃保存备用。

2）细胞制备

① 猪肺泡巨噬细胞（PAM）的制备：取4～8周龄SPF仔猪，宰杀、将血放净后立即进行无菌手术，摘取完整肺脏、气管和喉头。在无菌条件下，用加入1000IU/ml青霉素和1000μg/ml链霉素的灭菌PBS（见附录A）进行气管灌注。轻揉肺脏，于灭菌容器收集肺灌注液。反复灌注5～7次，将所有的灌注液混合，以1000g离心10min。弃上清，沉淀细胞用灭菌PBS悬浮，再进行离心。反复洗5～7次，最后收集沉淀细胞，用含10%胎牛血清和双抗的RPMI1640或DMEM营养液悬浮，计数。将细胞调至（3～5）×1010个/ml，分装于细胞培养瓶，于37℃、5% CO2培养箱培养。因每批PAM对病毒敏感性不同，用前需做预备试验。

② Marc-145、CL-2621传代细胞的维持和培养：Marc-145和CL-2621细胞用含5%～10%胎牛血清的MEM或DMEM液培养，长成单层后用0.25%胰酶液消化细胞，用上述营养液悬浮消化的细胞，以1∶3分瓶，于37℃、5%CO2培养箱培养。

3）病料接种

① PAM或Marc-145细胞培养好后，将上清液倒掉，用预热至37℃的Hank’s液清洗1～2次。

② 接种1）、①或1）、②处理好的病料组织液，接种量约为生长液的1/10，以使细胞单层都能接触病料为度。

③ 在37℃下吸附60min，倒掉病料组织液，用Hank’s液清洗1～2遍。

④ 加入含2%～4%胎牛血清的MEM或DMEM细胞培养维持液。继续在37℃下培养。

4）结果观察

① 在显微镜下每天观察细胞病变（CPE）。

② 细胞在接种后培养6～8d，如果无细胞病变，将培养物冻融2～3次，进行盲传。盲传3～4代。如存在PRRS病毒，PAM细胞一般在接种后24～48h内即可产生CPE，表现为细胞膨胀、溶解和细胞脱落；接种PRRS病毒的Marc-145细胞一般在接种后48h后产生CPE，主要表现为细胞呈灶状变圆、膨胀、脱落后形成空洞。

5）病毒培养物的收集　当细胞出现50%～80% CPE时，冻融1～2次，1000g离心10min，上清分装，－20℃保存。

（2）病毒鉴定

1）操作方法

① 将细胞培养在24孔培养板上，长成单层。将上清液倒掉，用预热至37℃的Hank’s液清洗1～2次。

② 接种病毒细胞培养物［见（1）、5）］或处理好的病料组织液［见（1）、1）、①或（1）、1）、②］，每孔约50μl。37℃下吸附60min，倒掉病料组织液，用Hank’s液清洗1～2遍，加入维持液［见（1）、3）、④）］，继续在37℃下培养。

③ 出现早期CPE后，收集培养板，将孔中液体甩出，用丙酮或无水乙醇室温固定15min。

④ 去掉固定剂，风干后，用PBS（见附录A）冲洗两次，每次3min。

⑤ 分别加入PRRSV标准阴性、阳性血清（由标准起草单位提供，按说明书使用），每孔100μl，37℃反应60min。

⑥ 取出，去掉血清液，用PBS冲洗4次，每次3min，甩干。

⑦ 加入荧光素标记兔抗猪IgG［见3、（1）、2）］，每孔50μl，37℃反应40min。

⑧ 取出，冲洗同⑥，置于荧光显微镜下观察。

2）判定　当滴加阴性血清孔的细胞质中无特异性草绿色荧光时，滴加阳性血清或单克隆抗体孔的细胞质中有特异性草绿色荧光，则该孔被检病料中含有PRRS病毒，否则无PRRS病毒存在。

3. 间接荧光抗体试验（IFA）

（1）试验材料

1）磷酸盐缓冲液（PBS），配制方法见附录A。

2）96孔抗原板（奇数列为正常细胞抗原孔，标为N孔。偶数列为PRRSV抗原孔，标为P孔），标准阴性血清、阳性血清、荧光素标记兔抗猪IgG，由农业农村部兽医诊断中心提供，按说明书使用。

（2）操作方法

1）将96孔抗原板从冷藏箱中取出，室温下放置10min。

2）将标准阴性血清、阳性血清、待检血清分别用PBS（见附录A）作1∶20稀释。

3）将稀释好的标准阴性血清、阳性血清、待检血清分别加入96孔板相邻的一个N孔、P孔中，每孔100μl。见表1-11。

4）37℃放置60min。

5）取出96孔板将孔中血清甩出。

6）每孔加入300μl PBS，室温放置3min，甩出孔中PBS。重复3次，最后一次在吸水纸上拍干。

7）用PBS将荧光素标记兔抗猪IgG［见（1）、2）］作1∶250稀释，加入各反应孔中，每孔50μl。

8）37℃放置40min。

9）取出96孔板将孔中液体甩出。

10）重复操作6）。

11）倒置于荧光显微镜下观察。

（3）结果判定

1）标准阴性血清的N孔、P孔细胞质内均无特异性荧光，标准阳性血清的N孔细胞质内无特异性荧光，而P孔细胞质中有明亮草绿色荧光，该试验成立，否则应重做。

2）被检血清的N孔、P孔细胞质内均无特异性荧光，则判为阴性；被检血清的N孔细胞质内无特异性荧光，而P孔细胞质中有明亮草绿色荧光，则判为阳性。

4. 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）

（1）试验材料

1）96孔抗原板（奇数列为正常细胞抗原孔，标为N孔。偶数列为PRRSV抗原孔，标为P孔），标准阴性血清、阳性血清、辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，由农业农村部兽医诊断中心提供，按说明书使用。

2）稀释液、洗涤液、底物溶液，配制方法见附录B。

（2）操作方法

1）将96孔板从冷藏箱中取出，室温下放置10min。

2）将标准阴性血清、阳性血清［见1）］、待检血清用稀释液（见附录B）作1∶20稀释。

3）将稀释好的标准阴性血清、阳性血清、待检血清分别加入96孔板相邻的一个N孔、P孔中，每孔100μl。

4）37℃放置60min。

5）取出96孔板将孔中血清甩出。

6）每孔加入300μl洗涤液（见附录B），室温放置3min，甩出孔中液体。重复3次，最后一次在吸水纸上拍干。

7）用稀释液将酶标记抗体［见（1）、1）］作1∶5000稀释，加入各反应孔中，每孔50μl。

8）37℃放置40min。

9）取出96孔板将孔中液体甩出。

10）重复操作6）。

11）每孔加入50μl底物溶液（见附录B），室温下放置15min。

12）将孔中液体甩出，用洗涤液洗涤一次。

13）倒置于显微镜下观察。

（3）结果判定

1）标准阴性血清的N孔、P孔均无特异性显色，标准阳性血清的N孔无特异性显色，而P孔细胞质呈深棕红色，该试验成立，否则应重做。

2）被检血清的N孔、P孔均无特异性显色，则判为阴性；被检血清的N孔无特异性显色，而P孔细胞质呈深棕红色，则判为阳性。

5.酶联免疫吸附试验（ELISA）

（1）试验材料

1）PRRS病毒抗原，正常Marc-145细胞对照抗原，辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，标准阴、阳性血清，96孔酶标板，由农业农村部兽医诊断中心提供，按说明书使用。

2）包被缓冲液、洗涤液、封闭液（稀释液）、底物溶液、终止液，配制方法见附录C。

（2）操作方法

1）将病毒抗原、正常Marc-145细胞抗原用包被液（见附录C）作1∶800稀释（浓度约为1.5μg/ml），酶标板的奇数孔包被稀释好的病毒抗原（标记为P孔）、偶数孔包被细胞抗原（标记为N孔），每孔100μl，置4℃冰箱24h。

2）取出反应板将孔中液体甩出。

3）每孔加入300μl洗涤液（见附录C），室温放置3min，甩出孔中液体。重复3次，最后一次在吸水纸上拍干。

4）每孔加入封闭液（见附录C）200μl，37℃放置1h。

5）重复2）和3）操作。

6）将被检血清用稀释液（见附录C）作1∶40稀释。

7）将标准阳性血清、标准阴性血清（不作稀释）［见（1）、1）］分别加入两个相邻的P孔和N孔，每孔100μl。将稀释的被检血清分别加入1个相邻的P孔和N孔，每孔100μl。

8）37℃放置1.5h。

9）取出反应板将孔中液体甩出，用吸水纸拍干。

10）每孔加入300μl洗涤液，室温放置3min，甩出孔中液体。重复5次，最后一次在吸水纸上拍干。

11）每孔加入100μl酶标抗体。

12）重复8）、9）、10）操作。

13）每孔加入100μl底物溶液（见附录C），室温（25℃）静置15min。

14）每孔加入100μl终止液（见附录C）。

15）用酶联检测仪于450nm波长测定各孔吸光度（OD450）。

（3）结果判定

1）分别计算标准阳性血清两个P孔的平均OD450值（记为P）和两个N孔的平均OD450值（记为N），计算公式为：［OD450（1）+OD450（2）］/2。

2）计算各被检血清的S/P值：

S/P=（样品P孔OD450值－样品N孔OD450值）/（P－N）

3）阳性血清P孔减去阴性血清P孔的OD450值≥0.150，且标准阴性血清S/P值小于0.4，试验成立。如被检血清S/P值大于（等于）0.4，该血清为PRRSV抗体阳性；如被检血清S/P值小于0.4，该血清为PRRSV抗体阴性。

附录A

0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）的配制

将下列试剂（分析纯）加入约500ml的蒸馏水中溶解，然后用蒸馏水定容至1000ml。

氯化钠　　　　　　　　　　　　　　 　8.0g

氯化钾　　　　　　　　　　　　　 　　0.2g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）　　　　2.89g

磷酸二氢钾（KH2PO4）　　　　　　　   0.2g

附录B

溶液的配制

B.1　稀释液的配制

取5ml灭活小牛血清、50μl吐温-80加入100ml容量瓶中，用0.02mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液（见附录A）定容至100ml。

B.2　洗涤液的配制

取50μl吐温-80，加入100ml 0.02mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液（见附录A）中。

B.3　底物溶液的配制

甲液：N，N-二甲基甲酰胺（DMF） 　　　　20ml

3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）　　                　　80mg

混匀。

乙液：冰醋酸　　                                         　　0.9ml

乙酸钠　　                                                     　　2.9g

加蒸馏水至1000ml。

上述化学试剂均为分析纯。

底物溶液：甲液　　                                     　　1.0ml

乙液　　　                                                         　19ml

30%过氧化氢　　　                                         　10μl

混匀。

附录C

溶液的配制

C.1　包被缓冲液的配制

0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液：

将下列试剂（分析纯）加入1000ml容量瓶中，用去离子水溶解并定容至1000ml。

碳酸钠（Na2CO3）　　　　　　　　　　　　1.59g

碳酸氢钠（NaHCO3）　　　　　　　　　　　2.93g

C.2　洗涤液的配制

取50μl吐温-20加入100ml 0.02mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液（见附录A）中，混匀。

C.3　封闭液（稀释液）的配制

取10ml灭活犊牛血清、50μl吐温-20加入100ml容量瓶中，用0.02mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液（见附录A）定容至100ml。

C.4　底物溶液的配制

TMB储存液：三甲基联苯胺（TMB）　　　　   10mg

N，N-二甲基甲亚砜（DMSO）　　　　　　　1.0ml

混匀。

0.1mol/L柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠　　　　     　27.22g

去离子水　　　                                               　　200ml

混匀，用饱和柠檬酸水溶液调pH至5.6，加去离子水至2000ml。

上述化学试剂均为分析纯。

底物溶液：TMB储存液　　　　　　　　　　   100μl

0.1mol/L柠檬酸缓冲液　　　　　　                　100ml

1%过氧化氢　　　　　　　　　　             　　25μl

混匀。该溶液现配现用。

C.5　终止液的配制

2mol/L硫酸溶液：于500ml去离子水中，在不断搅拌下缓慢加入76ml浓硫酸（98%），混匀，冷却。