随着免疫学的发展和免疫学技术的进步，能够用于检测的免疫（生物）标志物不断增加，检测方法推陈出新，这有助于流行病学专家深入研究并揭示疾病的病因。临床免疫检测中，参与免疫应答的细胞、抗体、细胞因子、细胞表面分子等，都能通过相应的方法进行定性或定量。

从机体外周血、骨髓、外周淋巴器官或各种组织分离出来的细胞是多种细胞的混合物，如要研究某种特定细胞及其细胞结构、功能或表面标志等，首先要分离和纯化细胞。

目前分离纯化细胞方法的基本原理：根据所需分离细胞的漂浮密度，选择适宜的不连续密度离心方法；根据所需分离细胞特异性表面标记，应用相应的抗体，通过贴附、分选、免疫磁珠或补体介导的溶解等方法来达到纯化细胞的目的。

用于密度梯度沉降法分离细胞的介质，常用聚蔗糖（ficoll）和Percoll。

常用来分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），包括淋巴细胞和单核细胞。

Percoll能够分离多种细胞，目的细胞可以是上皮细胞、淋巴细胞、星状细胞等。

细胞群或亚群特异性膜表面标记及其单克隆抗体，为应用抗原抗体特异性结合分离纯化细胞提供了基础。把抗体交联或包被在不同的固相载体上，通过贴附、结合，把不同的细胞群分离开，或通过经典的补体激活途径，加入补体，把结合有特异性抗体的细胞群溶解掉，从而纯化或富集某一细胞群。

研究和检测膜表面、胞内及核内标记、细胞周期、增殖、凋亡以及细胞分选（sorting）等。基本的原理是经直接或间接免疫荧光染色的细胞，根据其荧光阳性或阴性，在通过FCM时自动被分选到不同容器里。FCM目前已成为免疫学不可或缺的检测方法。

商品化的免疫磁珠是将特异性的抗体包被在包裹有铁粒的微小塑料球上，通过直接法（包被抗体直接识别某一细胞群表面的膜分子）或间接法（免疫磁珠上包被第二抗体，与预先结合在细胞上的第一抗体结合），在磁力架上把免疫磁珠结合细胞和非结合细胞迅速分开。根据分离纯化的目的，可获取结合有免疫磁株的细胞（阳性分离法），或丢弃结合免疫磁珠细胞，收获非结合细胞（阴性分离法）。

分为直接法和间接法两种。直接法是将识别细胞膜表面的抗体直接包被到塑料平皿上，然后将混合的细胞悬液铺盖于平皿，经孵育后包被抗体识别的阳性细胞贴附在平皿上，其余细胞不贴附，可轻轻吹吸分离两类细胞。间接法是将第二抗体（如羊抗鼠IgG）包被在平皿上，第一抗体（如识别膜分子的小鼠单克隆抗体）先与混合细胞群孵育、洗涤，制备成细胞悬液，然后铺盖于包被有第二抗体的平皿上，经孵育后将贴附和非贴附细胞分开。

先将特异性多抗或单抗结合相应细胞群或亚群，洗涤后加入适当浓度的补体，通过补体激活的经典途径，溶解被抗体结合的细胞群从而达到纯化或富集细胞群的目的；如果单抗用于本法，须选用能固定补体的免疫球蛋白类或亚类。

淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程中一个重要的阶段。检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫功能检测的一类常用方法。

常用的诱导细胞增殖的刺激剂，根据刺激淋巴细胞发生增殖反应的机制不同，可分为：多克隆刺激剂，如植物血凝素、刀豆蛋白A和CD3单克隆抗体，刺激T细胞增殖；脂多糖、含有葡萄球菌A蛋白的金黄色球菌菌体CowonⅠ株和抗-IgM等，刺激B细胞增殖；蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）活化剂，佛波酯，可刺激T、B淋巴细胞发生增殖；超抗原（superantigen, SAg），葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin SE）A、B等；同种异体抗原，主要是MHCⅡ类抗原；特异性抗原刺激T细胞增殖，主要检测机体对某一特定抗原的免疫状态，可用于检测疫苗免疫后特异性T细胞免疫状态；细胞系增殖反应，如细胞因子依赖的细胞系在体外有相应细胞因子存在条件下发生增殖反应。这类细胞系常用来作为指示细胞，检测相应细胞因子的生物学活性。

增殖实验的常用方法有下列几种：

免疫细胞在刺激剂存在条件下发生增殖，按照细胞周期的顺序，进入S期需从周围环境中摄取胸腺嘧啶核苷等合成原料。核素 ³H标记的胸腺嘧啶核苷（TdR）作为标记物被加入后摄入细胞而掺入DNA中。掺入 ³H-TdR量与细胞生长成正比例关系，测定 ³H-TdR的掺入量，可判定细胞的增殖程度。

BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子中。活体注射或细胞培养加入，而后利用抗BrdU单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，显示增殖细胞。同时结合其他细胞标记物如DAPI，双重染色，可判断增殖细胞的种类、增殖速度。

EdU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中。与BrDUBrdU掺入法不同，EdU掺入法用Apollo染料染色，该染料分子小，无需DNA变性，能轻松透过细胞膜结构，与EdU特异性结合，通过对荧光定性或定量来反映细胞增殖。

CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺酯基团（succinimidyl ester）和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团。其含有的琥珀酰亚胺酯基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

MTT是一种噻唑盐，化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide）。外源MTT作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物，当细胞增殖时线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色结晶甲瓒（formazan），二甲基亚砜溶解结晶的formazan，根据所测光密度（optical density, OD）值来反映活细胞的数量和活性。在掌握良好的实验条件下，MTT法的敏感性可接近 ³H-TdR掺入法。由于MTT法可避免核素的污染，实验成本也较低，在测定细胞增殖中较为常用。

该方法是基于WST-8（化学名：2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）的检测。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

可用于NK细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells, LAK）、CTL和ADCC等各种杀伤细胞的杀伤功能检测。但由于放射性实验需要防护和特殊处理废弃材料，所以实验应用受到一定限制。

在进行杀伤实验时，需要确定杀伤性效应细胞及其对应的靶细胞。不同性质、不同种属的效应细胞都有相应的靶细胞，如，常用人NK细胞的靶细胞是髓样白血病细胞系K562，或Jurkat、MOLT-4、JM等；人LAK细胞的靶细胞是对NK细胞不敏感的细胞，Daudi、Raji淋巴瘤细胞和LiBr黑素瘤细胞等；小鼠NK细胞的靶细胞常用莫洛尼病毒诱导的T淋巴瘤YAC-1细胞；小鼠LAK细胞的靶细胞常用苯并芘诱导的EL4淋巴瘤和3-甲基胆蒽诱导的P815肥大细胞瘤。

实验时，先将同位素 ⁵¹Cr掺入到靶细胞内，充分洗涤，除去未进入细胞内的同位素。将一定数量的效应细胞和靶细胞在96孔“V”型或“U”型底培养板中一起孵育4小时，被杀伤后的靶细胞由于胞质膜破坏，胞质内的 ⁵¹Cr即释放到培养上清中，通过测定上清中 ⁵¹Cr的cpm值，根据以下公式即可测得某一效靶比的特异性杀伤率。

公式中最大释放为用无离子去垢剂（如1%TritonX100）处理 ⁵¹Cr掺入的靶细胞上清中的cpm值；自发释放为 ⁵¹Cr单独孵育靶细胞的cpm值。

Alamar Blue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶还原产生荧光及颜色变化，可用于定量。实验时，在靶细胞孔、效应细胞孔、实验孔各加Alamar Blue，共育6～24h后用板式荧光测定仪测定荧光强度，计算后获得效应细胞的杀伤率。该方法能够对培养细胞进行连续检测。

LDH在胞质内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤率。使用96孔板或384孔板，可用于高通量检测。

抗体（antibody, Ab）是由抗原刺激机体免疫系统中的B细胞增殖分化为浆细胞后所产生的一种糖蛋白，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能；是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子。免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）与抗体结构类似，但不一定具有生物学活性。

特异性抗体的检测，是协助临床诊断、观察疾病疗效及预后、预防接种效果的观察，以及传染病流行病学，如结核、HIV、乙肝等调查的重要依据。

将纯化、重组或合成的抗原固定在膜上，可检测液相中的抗体，如全血、血浆、血清等。如商品化的HIV、乙肝抗体检测试纸。

包括酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay；ELISA）、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等。

以ELISA为例，它用特异性抗原包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体（直接法）；或者利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体（间接法）。目前应用ELISA，已获得对多种寄生虫病、病原微生物、病毒等的血清学诊断。

将纯化的蛋白抗原裂解，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按分子量大小将其分离，再转印至硝酸纤维素薄膜上，并保存于4℃干燥试管内，测定时将割成膜条的硝酸纤维素薄膜与待检样品反应，使其充分接触。若样品中含有待检抗体，将会与膜条上的抗原区带结合，再加上酶标抗人IgG抗体，经过与底物反应显色，即可形成肉眼可见的不同区带。如HIV抗体的确认检测。

在大多数情况下，免疫血清、杂交瘤细胞培养上清以及腹腔积液者中的抗体需经分离纯化后再用于各种免疫学实验。常用的Ig的分离纯化方法主要有沉淀和层析两大类，具体包括如下所述多种方法。这些方法各有优缺点，应根据抗体的特点、纯度要求和实验室具体条件加以选择。

蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有的电荷。如改变这两个因素，蛋白质就容易沉淀析出。引起蛋白质沉淀的方法主要有：

在蛋白质溶液中加入大量中性盐（常用硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）时，高浓度的盐溶液中的异性离子中和了蛋白质颗粒的表面电荷，从而破坏了蛋白质颗粒表面的水化层，失去了蛋白质胶体溶液的稳定因素，降低了溶解度，使蛋白质从水溶液中沉淀出来。

生物碱和某些酸类物质，在pH小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀。例如，辛酸在偏酸条件下能与血清或腹腔积液中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来，IgG则溶于上清中，再用硫酸铵盐析，可分离纯化IgG。

汞、铅、铜、银等重金属离子，在pH大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀。

乙醇、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。

层析法又称色谱法，是利用混合物中各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。其应用十分广泛，几乎可用于各种生物物质的分离纯化，特别是对生物大分子如蛋白质的纯化，已成为目前分离生物大分子最有效的分离手段之一。常用的有以下几种层析法：

凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。将凝胶装入柱子中，作成凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶柱平均孔径小的蛋白质会连续不断地穿入柱子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶柱内部的阻力也大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶柱之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。如用凝胶过滤除去血清中的盐分，应收集首先流过凝胶柱的Ig，不收集后流出的盐分，初步纯化Ig。

以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。在用逐渐增加离子强度的洗脱液（或缓冲液）洗脱时，电荷多的蛋白（电荷性质与洗脱液一致）先被洗下来，相反电荷少的蛋白（与洗脱液相反）后被洗下来，从而分离开各蛋白。例如，血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pI 6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。在pH 7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被弱碱性阴离子交换剂如DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。

亲和层析是利用生物分子之间具有的专一性亲和力而设计的层析技术。将其中一方固定在固相载体上，待分离蛋白的样品经过层析柱时，另一方被结合在柱上，其他不能结合的物质穿柱而过。结合的蛋白质在一定洗脱条件下可从柱上洗脱下来，从而达到分离的目的。例如，葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A, SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-sepharose CL-4B亲和柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹腔积液中的IgG抗体。

免疫细胞的表面标记种类主要包括白细胞分化抗原、黏附分子、免疫球蛋白超家族、主要组织相容性抗原、补体受体以及细胞因子受体等。

细胞悬液经间接或直接免疫荧光染色后，经流式细胞仪进行分析，可获得阳性细胞的百分比及平均荧光强度等参数，后者可相对地表示抗体所识别的膜表面分子的密度。用双色和多色染色和分析技术，可获得同一个细胞表面两种或两种以上分子表达的情况。由于FCM分析效率高，客观性好，已广泛应用于免疫细胞表面标记的研究和临床检测。

用于检测细胞表面标记的免疫组织化学（immuno histochemistry, IHC）方法种类很多，其中碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase, APAAP）在淋巴细胞表面标记的检测中较为常用，如检测CD抗原、MHC抗原、HIV感染病人外周血单个核研究细胞表面标记等。

类似IHC的方法还有免疫荧光、激光共聚焦等。

单克隆抗体与各种标记技术相结合成为酶免疫组化技术外，应用同位素 ¹²⁵I标记单克隆抗体进行竞争结合试验（competitive binding assay）以及Scatchard plot分析，可以获得所研究的表面分子平均在每个细胞表达的数量以及抗原抗体结合的亲和力。同位素标记的竞争结合试验是细胞和分子免疫学中一种十分精确的研究方法。

包括病原微生物在内的环境因素作用于机体，机体相应地会作出免疫应答。大多数疾病都与免疫系统的失调有关。免疫学基础研究和检测技术的深入快速发展，从微观角度为流行病学的群体研究提供了更多的生物学（免疫）标志物，有助于传染病的诊断和流行病学调查。