第二节　卵巢的成长

卵巢从形成后即进入缓慢的生长过程，并在此过程中由髂窝下缘缓慢下降至盆腔，体积逐渐增大。卵巢的生长过程伴随着卵泡的发生过程，始基卵泡持续激活，卵泡数目不断减少，但由于早期缺乏下丘脑、垂体激素的支持，卵泡只能发育到窦前卵泡阶段，少数能发育至排卵前卵泡，但都最终闭锁。此时的卵巢具有一定的激素分泌功能，但水平较低。卵巢由多种细胞成分组成，不同细胞成分的相互作用在卵泡的发育成熟和卵巢的成长过程中发挥重要作用。

卵泡是一个由卵母细胞和其周围的颗粒细胞及卵泡膜细胞共同组成的多细胞功能单元，是卵巢的生命源泉，卵泡的数量和质量直接影响着卵巢的生命力。卵泡中的卵母细胞与周围细胞通过细胞间连接运输代谢产物，并通过一系列细胞因子以旁分泌及自分泌的方式相互调节，主要包括TGF-β家族成员。卵巢中的其他成分对卵泡的存活和生长同样重要，其中卵巢基质为生长卵泡中产生的生长因子和调节因子提供屏障。此外，卵巢上皮细胞、免疫细胞及神经调节因素也在卵巢中发挥重要作用。

卵母细胞是罕见的巨大细胞，其细胞核较大，且具有高转录活性，也被称为“生发泡”。卵母细胞的细胞质含有丰富的细胞器以及蛋白质。在卵泡的生长过程中，卵母细胞的关键任务是产生供排卵、受精以及积蓄着床前胚胎形成新基因并开始转录所需要的所有成分。卵母细胞中基本的细胞质成分包括核糖体、线粒体和母体mRNA，这些成分在卵母细胞生长的过程中不断累积，为卵母细胞成熟和胚胎发育提供必需的蛋白质。由角蛋白、微管蛋白和其他高度丰富的卵母细胞蛋白组成的细胞质中含有丰富的核糖体和母体mRNA。卵母细胞与体细胞线粒体在结构和DNA含量方面具有显著不同。体细胞线粒体是球形的，几乎没有嵴，并且每个细胞只含有1～2个线粒体DNA。卵母细胞含有比体细胞更多的线粒体。在形成原始生殖细胞时大约含有10个线粒体，而每个原始卵母细胞含有高达6 000个线粒体，在生殖细胞迁移到性腺、进入减数分裂和始基卵泡形成的整个过程中，线粒体的数量迅速增加。随着卵母细胞生长的开始，线粒体继续复制，在完全成熟的人卵母细胞中估计有300 000～400 000个线粒体。

卵母细胞特异性基因在卵泡发育成熟、受精及着床前的发育等过程中发挥关键作用。其中Figla、Sohlh1和Lxh8的表达是裸卵母细胞形成卵泡的必要条件，而Nobox是始基卵泡募集为初级卵泡的关键基因。Dazl、Cpeb1和Ybx2（以前称为Msy2）是调节卵母细胞内mRNA表达的DNA或RNA结合蛋白。此外，卵母细胞外基质和透明带（zona pellucida，ZP）的形成伴随着卵母细胞的发育过程。

透明带对发育中的卵母细胞、输卵管中的排卵卵泡以及卵裂期的胚胎均发挥重要的保护作用。透明带保护卵泡中正在发育的卵母细胞、输卵管中的排卵卵泡以及卵裂期胚胎。它作为与精子接触的初始部位，在受精后，成为阻止多精子穿透的屏障。Zp1（Zpa）、Zp2（Zpb）和Zp3（Zpc）是编码透明带主要硫酸化糖蛋白的三个基因。ZP2和ZP3蛋白聚合物形成的花环体被ZP1蛋白贯穿连接，形成透明带的亚单元。Figla调节卵母细胞生长过程中上述基因的协调表达。研究显示，人类和大鼠有第四个ZP1样亚基（ZP4），而小鼠没有。多年来ZP3被认为是小鼠中主要的精子受体，ZP2是次要的受体。然而，现有的证据表明识别ZP2氨基末端的特定区域是小鼠和人的精子成功穿透透明带的必需条件。受精后，从卵子中释放出名为卵黄素的皮质颗粒金属蛋白酶可切割ZP2，阻止其余的精子与ZP结合，以防止多精子受精。缺乏ZP1的小鼠表现为透明带的结构异常和繁殖力的降低；缺乏ZP2的小鼠表现为薄型透明带，缺乏排卵前卵泡，繁殖期小鼠卵巢中窦卵泡数量显著减少，排卵减少并且不能形成两细胞期胚胎。而且对ZP2缺乏的雌性小鼠的卵母细胞进行体外受精，形成的囊胚不能正常发育。缺乏ZP3的小鼠虽然其他透明带蛋白均可正常表达，但不能形成透明带，也几乎不能排卵，且缺乏生育能力。与ZP2突变小鼠一样，ZP3缺陷小鼠的体外受精卵发育不会超过囊胚期。

此外，通过小鼠模型鉴定出了一系列卵母细胞特异性的“母体效应”基因，这些基因在卵母细胞中表达，但仅在着床前胚胎发育过程中发挥作用。其中Nlrp5、Khdc3、Ooep和Tle6基因编码的蛋白质在卵母细胞中形成皮层下母源复合体（subcortical maternal complex，SCMC）。此外，基于其在卵母细胞和卵裂期胚胎中的相似定位模式，肽酰基天冬氨酸二硫异构酶Ⅵ型（PADI6）也可在该复合体中发挥作用。缺乏Nrlp5、Padi6或Ooep的小鼠卵母细胞没有细胞质网格（cytoplasmic lattices，CPLs），合成蛋白质的能力缺陷，且受精后不能发育。KHDC3调节卵母细胞和早期胚胎的纺锤体功能；Khdc3敲除的雌性小鼠的胚胎由于非整倍体的发生率高而发育不良。与Nlrp5相关的基因Nlrp2在卵泡发育过程中的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达，也是早期胚胎发育成功所必需的母体蛋白编码基因。小鼠卵母皮层下母源复合体基因与人卵母细胞具有相同的表达模式，且功能相似。TLE6磷酸化位点纯合点突变的女性通常由于受精后胚胎分裂失败而不育。同样，缺乏PADI6的人卵母细胞受精后发育停滞。随着研究的不断深入，逐渐发现了一系列“母体效应基因”，如Zar1（zygote arrest 1）编码的细胞质蛋白决定受精卵向裂解胚胎转变过程，但机制尚不明确；Gclm（glutamate cysteine ligase，modifier subunit）编码调节谷胱甘肽合成的蛋白，是控制细胞氧化还原状态的关键成分，缺乏GCLM的小鼠胚胎不能发育成囊胚；Npm2（nucleoplasmin 2）是卵母细胞成熟前编码产生的一种核蛋白，影响异染色体的重组和组蛋白去乙酰化，缺乏NPM2的卵子可以正常排卵和受精，但往往无法完成着床前胚胎发育；Dppa3除了在原始生殖细胞中发现的作用外，也是着床前胚胎正常发育所需的母体效应基因。

一系列的证据表明卵母细胞决定卵泡的发育进程。卵母细胞对卵泡生长的调控作用主要是通过由卵母细胞产生的卵母细胞选择性或特异性TGF-β超家族成员例如生长分化因子-9（growth differentiation factor-9，GDF-9）和骨形态发生蛋白-15（bone morphogenetic protein-15，BMP-15）介导。通过对小鼠的基因干预和绵羊中编码GDF-9和BMP-15基因自发突变体表型的观察，可明确GDF-9和BMP-15在卵泡发育过程中的重要作用。在人卵母细胞中亦发现高表达的GDF-9和BMP-15与随后卵母细胞和胚胎的整体质量密切相关。

GDF-9由5q31.1染色体上的基因编码，在卵母细胞和灵长类的颗粒细胞中高表达。GDF-9缺陷小鼠的卵泡生长停滞在初级阶段，但卵母细胞以比野生型卵母细胞更快的速度继续发育，并发展成为正常小鼠的窦卵泡时期的卵母细胞。然而，由于颗粒细胞与卵母细胞之间的相互连接的超微结构的异常，最终卵母细胞死亡，仅留下一条透明带。与此同时，GDF-9缺陷小鼠卵泡周围不形成卵泡膜，提示GDF-9参与卵泡膜的组成或细胞增殖的调控。相反地，在大鼠中的研究发现，添加GDF-9可刺激初级卵泡的生长，与缺乏GDF-9的小鼠在初级阶段的阻滞相一致。GDF-9通过与激活素样受体（ALK）-5（TGF-βRI）和2型BMP受体（BMPR-2）受体复合物的相互作用，对颗粒细胞和卵泡膜细胞发挥调控作用，并且具有显著的种属特异性。在啮齿动物中，GDF-9刺激颗粒细胞分化，包括诱导黄体生成素（luteinizing hormone，LH）受体和甾体生成。在卵丘细胞中，GDF-9促进透明质酸合成酶2、五肽3和肿瘤坏死因子诱导基因6（TSG-6）的表达，后者转录的蛋白质参与卵丘复合体的蛋白多糖细胞外基质的形成。GDF-9刺激COX-2和前列腺素的合成和孕酮的分泌，同时还抑制尿激酶的表达，并抑制卵丘细胞LH受体的表达，阻止卵丘细胞黄体化。暴露于最高浓度的GDF-9有助于卵母细胞周围颗粒细胞的独特表型的形成。GDF-9在体外刺激人卵泡膜细胞增殖，抑制其类固醇生成，与小鼠卵巢中GDF-9在调控卵泡膜发育的作用模式一致。

也称为GDF-9b，由X染色体上的基因编码，是卵母细胞产生的TGF-β超家族的另一重要成员。它在结构上与GDF-9相似，并且具有相似的表达模式。小鼠Bmp15基因的靶向性敲除导致卵巢形态异常、排卵和受精率显著降低，从而导致其生育力显著下降。Bmp15和Gdf9突变的杂合子小鼠由于卵泡生成和卵丘细胞功能异常导致生育能力严重受损。然而，绵羊Bmp15基因的自发性突变体（如Inverdale和Hanna绵羊）的表现与Bmp15基因敲除的小鼠完全不同。在杂合状态下，卵泡排卵数量反而增加，从而增加了繁殖力。但在纯合性突变的母羊中观察到与Gdf9敲除的小鼠相似的原发性卵巢衰竭表型。在体外，BMP-15促进颗粒细胞有丝分裂。因此，体内BMP-15的缺乏可能导致与纯合突变绵羊体内类似的卵泡发育障碍。BMP-15的受体是由BMPR1B（ALK6）和BMPRII组成的受体复合物。根据突变等位基因拷贝数的不同，Booroola绵羊BMPR-1B的点突变与排卵率的增加有关。小鼠中Bmpr2基因的靶向性缺失不影响卵泡发育，却因为卵丘细胞膨胀的缺陷阻止了体内受精导致小鼠不孕。

BMP-15和kit配体之间以负反馈方式相互作用：BMP-15刺激颗粒细胞kit配体的表达，而kit配体抑制BMP-15在卵母细胞中的表达。在卵母细胞的存在下，BMP-15和kit配体促进颗粒细胞的有丝分裂。而kit（kit配体受体）只在卵母细胞表达，并且kit配体抑制卵母细胞BMP-15（颗粒细胞有丝分裂原）的表达，这表明卵母细胞可能产生其他颗粒细胞有丝分裂原。

GDF-9和BMP-15先以二聚体的前体蛋白合成，然后经蛋白水解以产生生物活性分子。值得注意的是，使BMP-15失活的Inverdale绵羊突变极大地损害了突变型BMP-15和野生型GDF-9在共表达细胞内的蛋白质水解过程。因此Inverdale羊表型发生的原因至少一部分是由于突变型BMP-15对野生型GDF-9再修饰的干扰而引起的GDF-9功能的缺乏。相同地，人共表达细胞BMP-15和GDF-9突变可能导致翻译后加工受损，降低功能蛋白的产生，从而导致相关的卵巢早衰的发生。研究发现，不仅GDF-9和BMP-15的同源二聚体具有生物活性。这两种蛋白的异源二聚体在调节颗粒细胞存活、颗粒细胞支持卵母细胞代谢的功能、成熟过程中卵丘细胞的扩张等方面都具有非常强的生物活性。因此，GDF-9：BMP-15异二聚体可能才是卵母细胞分泌的必需功能配体。

颗粒细胞起源于卵巢表面上皮，具有两种形成波。第一波参与卵巢髓质卵泡的形成，第二波参与卵巢皮质中卵泡的形成。颗粒细胞的形成是由GATA结合蛋白4（GATA4）表达细胞驱动的。GATA4、WNT4、R-spondin 1（RSPO1）、β-catenin和FOXL2协同促进胎儿期颗粒细胞的发生并调节卵泡生成。包绕每个卵母细胞的颗粒细胞都具有寡克隆起源，成熟卵泡中的颗粒细胞群是由最初的包绕卵母细胞的3～5个具有颗粒细胞潜能的细胞发育而来。颗粒细胞是卵巢雌二醇、抑制素和激活素的主要来源，并为卵母细胞发育成熟提供必需成分。但由于卵泡基底层将颗粒细胞与卵泡膜的血管分离，形成一个相对的血液屏障，故颗粒细胞不直接接受血液供应，所以限制了白细胞和高分子物质（如低密度脂蛋白）的进入。因此，相邻的颗粒细胞和卵泡细胞间的细胞连接作用尤为重要。

颗粒细胞通过广泛的缝隙连接网络相互连接，为相邻细胞之间的小分子代谢交换和传输提供重要途径。每个颗粒细胞间隙连接的数量随着卵泡的发育而增加，将它们连接成一个功能性整体。此外，颗粒细胞通过细胞质突触穿过透明带，与卵母细胞的细胞膜形成缝隙连接。缝隙连接由称为连接蛋白的六连环蛋白质组成。Connexin-37和Connexin-43是最重要的两种卵泡连接蛋白，它们形成具有不同通透性的间隙连接。

Connexin-37是卵母细胞中的主要连接蛋白，而Connexin-43在颗粒细胞中占优势，然而至少围绕卵母细胞周围的第一层颗粒细胞也表达Connexin-37。颗粒细胞与卵母细胞之间的通信是通过同型Connexin-37缝隙连接而进行的，而颗粒细胞之间的缝隙连接是通过同型Connexin-43复合物进行的。卵丘细胞局部诱导颗粒细胞Connexin-43表达。卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）TGF-β1和卵丘细胞分泌的全反式维甲酸均促进颗粒细胞Connexin-43表达。在窦卵泡中，颗粒细胞通过缝隙连接运输cGMP来抑制卵母细胞恢复减数分裂。LH的排卵高峰抑制Connexin-43 mRNA的表达，并导致丝裂原活化激酶介导的Connexin-43的磷酸化，最终导致缝隙连接关闭，细胞间代谢偶联中断。

Connexin37和Connexin43敲除的小鼠的卵巢表型进一步阐述了连接蛋白对卵泡功能的重要性。在通过靶向Gja4基因构建的Connexin 37缺乏型小鼠卵巢中，卵泡生长停滞在窦前卵泡；卵母细胞的生长虽然开始，却在减数分裂能力恢复之前停滞，导致卵母细胞的丢失和黄体化结构的形成。以Gja1基因为靶点构建的Connexin-43缺陷小鼠具有卵巢功能的异常，特征是生殖细胞数量减少和初级阶段以后卵泡生长受损。其他连接蛋白亦在卵巢中表达，但它们的特异性功能尚不清楚。

颗粒细胞表达大量细胞因子的受体并对这些因子做出反应，这些因子要么来源于卵泡局部，要么从血液进入卵泡腔。这些因素包括卵母细胞衍生因子、颗粒细胞自身产生的自分泌/旁分泌因子、卵泡膜细胞的产物以及来源于垂体和其他组织（如脂肪）的循环因子。除了FSH和LH，已证实体内、外存在众多影响灵长类动物以及其他动物颗粒细胞的信号分子，包括下丘脑因子［如促性腺激素释放激素和吻素（kisspeptin）］、其他垂体激素（如生长激素和催乳素）、大量生长因子［如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）］家族成员、TGF-β家族成员、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）和控制代谢的激素（如胰岛素）、血管张力素、血管生成因子、细胞因子（如TNF-α）和脂肪代谢相关因子（如瘦素、脂联素）等。

根据与人类突变或动物自发或诱发基因突变相关的表型研究中阐述了这些因子的关键作用，如前所述的GDF-9和BMP-15。但这些因子作用的主次和时间顺序还未得到很好的阐述。除了颗粒细胞表面受体的表达，微管系统和外泌体亦参与卵泡内的信号通信，例如以microRNAs为代表的外源性调节因子等。

此外，虽然前文提出颗粒细胞都是寡克隆起源，但根据其在卵泡内的位置而表现出显著的表型差异。主要由于它们与卵母细胞和卵泡膜细胞的距离不同，对其释放的旁分泌物质反应而导致位于基底层附近的壁颗粒细胞、位于窦腔的颗粒细胞和卵丘颗粒细胞各自具有独特的特征。窦卵泡壁颗粒细胞表现出最大的类固醇生成活性。此外，排卵前卵泡壁颗粒细胞LH受体水平最高，最靠近窦腔的颗粒细胞类固醇生成酶的表达较低，而中间区域的颗粒细胞比窦壁颗粒细胞具有更大的有丝分裂活性。

在排卵时随卵母细胞释放的卵丘细胞不表达芳香酶，其LH受体含量和LH反应性水平明显低于壁细胞。在小鼠中发现，卵丘细胞具有独特的基因表达模式，包括编码钠偶联中性氨基酸转运体基因Slc38a3的表达，以及更高水平AMH的表达。在卵母细胞分泌的GDF-9和BMP-15的作用下，靠近窦腔的卵丘细胞和颗粒细胞不表达mTOR信号传导的抑制剂DDIT4L，而壁颗粒细胞表达高水平的该蛋白。因此，卵丘细胞中的细胞代谢调节剂mTOR活性最高，使其更好地为卵母细胞的生长发育提供所需要的营养物质。卵丘细胞在LH峰后增殖，在排卵刺激产生的前列腺素的作用下，产生由透明质酸、蛋白聚糖和蛋白聚糖结合蛋白组成的细胞外基质。这种基质的形成导致卵丘-卵母细胞复合体的排卵前扩张，为排卵做准备。此外，不同颗粒细胞前列腺素E受体的不同表达模式允许颗粒细胞亚群在排卵期间对PGE₂做出独特的反应。黄素化的卵泡颗粒细胞经过终末分化，产生大量的黄体细胞群。由于黄体新生血管化，颗粒-黄体细胞可从循环脂蛋白获取更多胆固醇，合成孕酮的能力显著增加。颗粒-黄体细胞还保留了从卵泡黄素细胞产生的雄激素前体合成雌激素的能力。

卵泡膜和间质细胞被认为是起源于卵巢间质中的成纤维细胞样间质细胞。它们首先出现在具有两层或更多层颗粒细胞的卵泡周围。GDF-9在卵泡膜的发育中起重要作用，在缺乏GDF-9的情况下，卵泡膜细胞可被募集到卵泡周围，但是无法进一步分化。Kit和Kit配体系统在卵巢和睾丸的雄激素产生细胞的早期发育中起着重要作用。卵泡膜细胞表达Kit配体的受体。因此研究人员推测颗粒细胞在卵泡膜细胞的形成过程中发挥重要作用。

此外，通过小鼠模型发现，hedgehog信号通路在卵泡膜细胞系的发育过程中也起着关键作用。在卵母细胞分泌的GDF-9的作用下，颗粒细胞分泌的DHH蛋白和IHH蛋白共同促进卵泡膜细胞的募集和分化。与FSH一样，角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）刺激颗粒细胞产生Kit配体，而Kit配体作用于卵泡膜细胞，促进KGF和HGF的正反馈表达。Kit配体、KGF和HGF在大窦卵泡中浓度最高。卵母细胞表达Kit受体——这种正反馈调节有利于更好地为卵母细胞生长发育提供养分。此外，卵泡膜细胞产生的胰岛素样因子3（insulin-like factor 3，INSL3）促进卵母细胞发育成熟。颗粒细胞产生的TGF-β家族成员在卵泡膜雄激素合成的局部调控中起关键作用。BMP-6抑制卵泡膜细胞基础的激素分泌和LH诱导的雄激素分泌。GDF-9（由颗粒细胞和卵母细胞表达）也抑制人卵泡膜雄激素的合成。排卵后卵泡膜细胞参与黄体的形成，称小黄体细胞，表达类固醇生成活性以产生雄激素前体。颗粒细胞则转化为较大的黄体细胞，表达芳香酶活性，进一步转化雄激素前体。

卵巢中的闭锁卵泡中有一些过度肥大的卵泡膜内层细胞。这些细胞被认为是去甲肾上腺素能神经调节卵巢类固醇生成活性的靶标。卵巢门间质细胞是具有较大结构的黄素样细胞，具有与睾丸间质细胞相似的结构的功能，像睾丸间质细胞一样，它们含有六角形的间质细胞晶体。门细胞与非髓鞘的交感神经纤维密切相关，这些细胞的内分泌活性被认为与女性青春期、怀孕期间以及围绝经期的类固醇激素分泌显著性相关。

卵巢基质含有表达某些类固醇生成酶的成纤维细胞。基质中也含有产雄激素细胞的前体。由于卵巢基质细胞表达雄激素受体，并可在雄激素刺激下增殖，因此卵巢来源高雄激素血症［例如，多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）和产雄激素的卵巢肿瘤将导致卵巢基质密度增加。基质细胞在卵巢中充当屏障作用，不仅在物理上将卵泡和黄体与相邻结构分离，还分泌大量生长因子和生长因子结合蛋白，发挥生物屏障作用，例如，卵巢基质细胞表达大量Gremlin，可以结合和灭活BMP；分泌卵泡抑素，结合和灭活激活素的卵泡抑素；分泌IGF-结合蛋白（IGF binding proteins，IGFBPs），和分泌结合WNT信号家族成员的卷曲相关蛋白等。

卵巢表面上皮是一种由中胚层细胞衍生来的扁平-立方上皮层，又称卵巢间皮，由于曾被误认为产生生殖细胞，被误称为“生发上皮”。成年卵巢表面上皮以黏蛋白基因MUC1的表达和表面的纤毛和顶端微绒毛为特征性表现。这些细胞位于覆盖致密结缔组织层的基底膜上。卵巢表面上皮在与腹腔的物质交换和排卵导致的表面缺损的修复中起作用。在排卵过程中，覆盖在卵泡上的上皮细胞经历凋亡，随后激活修复过程。这个过程包括在排卵后立即开始的细胞增殖以及细胞外基质成分的重新合成。促炎性细胞因子可能参与上述过程的调节。卵巢表面上皮内陷导致包涵体囊肿形成。这些包涵体囊肿中的卵巢表面上皮可发生化生，并可能发生瘤变。一些研究人员已经指出这些包涵体囊肿是由排卵部位周围内陷形成的，并且据报道，它们也与PCOS的发生密切相关。

卵巢生命周期的不同阶段都有巨噬细胞、淋巴细胞和多形核粒细胞的参与。这些细胞在维持正常的卵巢功能以及卵巢病理学发生方面发挥作用，例如，淋巴细胞浸润，尤其膜间质细胞的浸润，是自身免疫性卵巢功能障碍的主要表现。巨噬细胞是卵巢间质的主要细胞成分，通常出现在卵泡的毛细血管附近。在卵泡发育的早期阶段，在卵巢中很少观察到其他白细胞，但在排卵前期出现大量白细胞浸润，并与卵泡闭锁有关。肥大细胞在卵泡后期逐渐增多，释放组胺可能导致排卵期卵巢充血。排卵后，在趋化因子的作用下，嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞募集迁移到黄体中。这些细胞的侵入和随后的激活发生在黄体退化之前。活化的T细胞产生吸引和激活巨噬细胞的趋化因子。在黄体细胞之间散布的暗星状K淋巴细胞曾被认为是巨噬细胞，它们通过直接的细胞-细胞接触和产生生长因子及细胞因子调节黄体细胞的功能。调节性T细胞，即维持抗原特异性T细胞耐受的淋巴细胞群，在黄体中具有特殊的重要地位。它们在中期黄体中大量存在，发挥抗炎和促稳态的功能。调节性T细胞的丢失与炎症反应的发生有关，促进黄体溶解。T淋巴细胞亚型和巨噬细胞的浸润在黄体溶解过程中发挥重要作用，而妊娠期这种侵入显著延迟。同时，卵巢中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和肥大细胞产生一系列细胞因子，包括多个白细胞介素家族成员、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF和MIP-1α，在卵泡形成和黄体功能发挥着重要作用。

卵巢受到内源性和外源性神经的双重调节。外源性神经主要由交感神经、感觉神经和极少的副交感神经组成，通过血管门周围丛进入卵巢。外源性神经主要参与调节卵巢血供和病理状态的疼痛，如卵巢子宫内膜异位症以及卵巢细胞的内分泌功能。此外，有研究发现，PCOS患者卵巢膜间质细胞间的神经支配显著增强，而肾上腺皮质能受体的过度激活与卵巢高雄激素症的发病有关。

人卵巢内源性神经包括儿茶酚胺能神经元，表达酪氨酸羟化酶（儿茶酚胺合成中的限速酶）。这些神经元大多表达神经营养素受体。神经营养素（neurotrophin，NT）是一类参与调节神经存活和分化的细胞因子，主要作用于TRK原癌基因家族的高亲和力受体和低亲和力p75神经生长因子（NGF）受体。一系列研究显示，NGF在早期卵泡的发育中至关重要，NGF或者NGF受体NTRK1缺乏的小鼠始基卵泡的形成显著减少，卵巢中未形成卵泡结构的卵母细胞数量增加。神经营养因子4（neurotrophin-4，NTN4）受体也被称为NT-5和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF），其表达缺乏亦与始基卵泡形成的减少有关。基因敲除的小鼠的研究进一步发现，NTRK1和NTRK2受体的表达是始基卵泡的发生和早期卵泡发育的必需条件，并且NGF的作用部分通过诱导FSH受体在卵泡发育中的表达而介导。小鼠颗粒细胞在LH和NT-4/5（不是NT-3）作用下表达BDNF，卵母细胞表达BDNF受体TRK-B，从而促进小鼠卵母细胞成熟，包括排出第一极体，并促进体外早期胚胎发育。总体来说，现有的研究提示卵巢内神经营养因子系统可能对卵泡的早期发育和卵母细胞成熟有重要作用。神经营养素及其受体也在人胎儿卵巢中表达，TRK-B受体定位于生殖细胞基质中。从接受促排卵的妇女抽取的人卵泡液中可检测到p75、NGF受体、BDNF、NT-4/5和NT-3。除神经营养素及其受体外，包括P物质、血红素-1、截短受体NTK1R-Tr和NTK2R在内的速激肽系统也在人颗粒细胞中表达。

胚胎干细胞具有多能性，在体外可产生卵母细胞样结构，提示卵巢干细胞群在成年后可能产生生殖细胞。虽然仍存在争议，但已有研究显示可以通过用DDX4 N端抗体进行免疫标记流式分选分离得到小鼠和人卵巢中少量的卵巢生殖干细胞。但该研究中使用的DDX4抗体的特异性受到质疑，以及与它们反应的抗原仍待确定。用上述方法分离的细胞在培养中具有分裂潜能，并根据其形态和卵母细胞特异性标记（包括DDX4和LHX8）的表达形成卵母细胞样结构。这些来自小鼠卵巢的卵母细胞样细胞在体外和体内能够发育成能完成受精和胚胎发育的卵母细胞，从而产生存活的子代。由人卵巢皮质分离的人卵巢皮质干细胞具有相似的表型。用绿色荧光蛋白（GFP）标记的谱系标记物转染卵巢干细胞，注射后5～6个月注入成年小鼠卵巢，形成表达GFP的卵母细胞。部分GFP标记的卵母细胞可以成功受精，并在特定条件下发展到囊胚阶段。

将从成人卵巢皮质组织中分离并标记有GFP的卵母细胞注射到人皮质中，或与来自皮质的游离细胞重新聚集，并移植到免疫缺陷小鼠体内。移植后7～14天，移植物内可见到具有减数分裂标志的卵母细胞样细胞，周围有体细胞。虽然这些卵母细胞样细胞的特性尚不完整，但这些研究确实提供了卵巢中罕见的多能干细胞群体存在的证据。但这些细胞在数量上并不能达到生产卵泡以防止卵巢自然老化的作用。卵巢干细胞对正常女性或卵泡池大小不同的卵巢功能障碍女性（如原发性卵巢功能不全或多囊卵巢综合征）的卵泡数量的影响尚待确定。不同类型的干细胞也同样可以被诱导发育成生殖细胞前体。例如，如果提供适当的转录因子和/或生长因子，人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞将在培养中分化成原始生殖细胞样细胞。该类细胞目前正被用于人类生殖细胞特异性分化和发育机制的基础研究。

总体而言，成年卵巢中多能干细胞数量非常少，如果将其移植到卵巢组织中，在体外处理后可产生功能性卵母细胞。在生理条件下，这些罕见的干细胞对卵泡池可能并无显著补充。但在体外可以将不同类型的人干细胞诱导发育成与原始生殖细胞非常相似的细胞，最终可能在临床应用上有较大的前景。

卵泡的生长开始于始基卵泡脱离静息状态，从人胚胎第4～6个月卵巢形成一直持续到卵巢功能的终末期。虽然一些研究人员已经提出，先形成的卵泡先发生排卵，但更多的研究提示静息卵泡过渡到生长阶段更可能是一个随机事件，与卵泡发育过程中形成的时序无关。

卵泡生长的开始以形态学的变化为特征，包括颗粒细胞形状从扁平变为立方形，颗粒细胞增殖，卵母细胞增大以及透明带的形成。扁平颗粒细胞向立方形的转化促使其功能的转变，包括某些功能mRNA（如卵泡抑素mRNA）的表达。颗粒细胞增殖与立方化进一步促进卵母细胞直径的增加。人类卵母细胞直径的第一次显著增加时发现最大卵泡截面上有15个颗粒细胞。卵母细胞的生长伴随着透明带的形成。随后，卵母细胞的生长和卵泡直径的增加呈正相关，直到卵母细胞形成平均直径达到80µm的次级卵泡为止。此时卵泡直径110～120µm，并具有大约600个颗粒细胞。卵泡增长至这一大小时，卵母细胞的生发泡达到平均26～27μm的最大直径。当卵泡继续扩张并压缩周围基质形成卵泡外膜，前卵泡膜细胞在颗粒细胞分泌信号的募集下向卵泡外的基质迁移，颗粒细胞分泌的信号包括Kit配体和IGF-1等，从卵母细胞分泌的信号包括FGF2、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、GDF-9和BMP-15也促进卵泡膜细胞迁移和增殖。随着次级卵泡的形成，颗粒细胞表达FSH、雌激素和雄激素受体，并通过缝隙连接紧密相连。卵泡膜的形成与卵泡的血液供应的发展相关，来自动脉的血供在邻近卵泡基底膜处形成环状毛细血管网络。同时，卵泡膜细胞表达LH受体并获得合成类固醇激素的能力。此后次级卵泡组成窦前卵泡池，FSH依赖的卵泡从窦前卵泡池中募集进入下一阶段，大部分卵泡通过闭锁而丢失。

次级卵泡生长的一个重要组成部分在于卵母细胞的分化和生长。生长中的卵母细胞代谢活跃，可以合成丰富的mRNA和蛋白质以支持早期胚胎着床前的生长和发育。周围颗粒细胞直接通过跨透明带突触与卵母细胞表面形成缝隙连接，进行营养素、生长因子和其他分子的双向转运，精密调节卵母细胞的生长。卵母细胞的生长过程中，通过透明带蛋白的积极合成、分泌、组装，逐渐形成成熟的透明带；部分细胞器的数量逐渐增加，特别是线粒体，在完全成熟的人卵母细胞中线粒体数量可达到大约有40万个；相反，部分细胞器在卵母细胞成熟过程中逐渐丢失，包括在卵原细胞中存在的中心粒。除了数量的变化，细胞器的分布随着卵母细胞发育成熟过程而发生变化，例如线粒体、内质网和高尔基复合体在紧邻生发泡区域逐渐聚集。卵母细胞在生长过程中逐渐获得减数分裂的能力，虽然具体机制尚不清楚，但只有在卵母细胞体积达到临界大小后才获得此能力。具有减数分裂能力的卵母细胞具有某些确切的属性，包括细胞周期蛋白CDK1、细胞周期蛋白B和CDC25水平的增加，这些蛋白的调控阈值很可能是细胞周期恢复的先决条件。此外，卵母细胞发育成熟的过程需要大量的能量，这些能量主要来自由颗粒细胞通过间隙连接转运的ATP和能量底物以及卵母细胞内丙酮酸的氧化磷酸化。缺乏丙酮酸脱氢酶的亚单位PDH1A的小鼠卵母细胞由于不能进行丙酮酸的氧化磷酸化，降低了ATP和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的水平。这些卵母细胞可以生长并排卵，但不能成功地完成减数分裂。在老年妇女的卵巢中，类似的过程可能导致胚胎染色体的不分离、错误分离和非整倍体的形成。基因组印迹的重建开始于卵母细胞的生长期——直到植入前胚胎发育后才完成，由包括DNA甲基化在内的多种机制参与调控。在缺失KDM1B（组蛋白H3赖氨酸-4-脱甲基酶）的小鼠中发现，组蛋白甲基化也有助于母系印迹的建立。母本或父本等位基因的异常表达会导致卵母细胞或雄性生殖细胞中印迹重建过程的失败。这些基因表达的改变与几种人类遗传性疾病有关，包括Beckwith-Wiedemann、Prader-Willi和Angelman综合征。卵母细胞中母系印迹的全部丧失会导致完全性葡萄胎的形成。

除了获得恢复减数分裂能力，生长过程中的卵母细胞逐渐获得胚胎的发育潜能，包括支持着床前的胚胎发育和发育成熟的能力，以及产生高度稳定的母体mRNA库。在卵母细胞生长完成时，母体mRNA库转录主动沉默，蛋白质翻译受到抑制，显著减慢直到卵母细胞成熟或受精。转录沉默需要卵母细胞与卵丘颗粒细胞通过缝隙连接进行特殊通信，并伴随大规模染色质结构的改变，这对于正在生长的卵母细胞获得恢复减数分裂和发育成熟的能力至关重要。在转录沉默后，排卵前卵母细胞中的母源蛋白和mRNA储存，除了用来支持减数分裂的恢复和受精后的第一次分裂，还包括卵母细胞质重塑精子DNA的能力和产生增强的钙振荡的能力。此外还有很多发育潜能有待进一步阐述。

卵巢内一系列细胞因子作为激活剂或抑制剂在调节卵泡生长的早期阶段起关键调节作用。卵泡生长和发育的激活因子包括LIF、碱性FGF和kit配体。卵泡颗粒细胞产生的kit配体和作用于卵母细胞和卵泡膜细胞上的kit受体，是卵泡生长和卵母细胞生长的启动所必需的。给新生小鼠注射抑制kit配体相互作用的kit抗体，可干扰卵泡发育的原始阶段。相反，注入重组kit配体，即扩散型和膜结合型，加速了新生大鼠卵巢从始基卵泡向初级卵泡的转变。而抗米勒管激素、激活素A和趋化因子SDF-1/CXCL12通过其受体CXCR4抑制早期卵泡生长。通过探究Gdf9敲除的小鼠和Bmp15基因纯合突变绵羊的卵巢表型发现卵母细胞来源的蛋白GDF-9和BMP-15对颗粒细胞增殖具有物种特异性。两种基因缺陷的情况下，颗粒细胞大约两次加倍后都停止增殖，卵母细胞继续增长。然而，大卵母细胞最终退化，并被单层颗粒细胞包围。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路是目前发现的在始基卵泡的激活中起着关键作用的信号通路。当这两种通路被破坏时，都会导致小鼠卵泡生长的异常激活和始基卵泡的最终耗竭。PI3激酶催化3，4，5-磷酸肌醇磷酸盐（PIP3）磷酸化，激活蛋白激酶PDK1，而蛋白激酶PDK1又磷酸化激酶Akt，最后导致FOXO3的磷酸化。由颗粒细胞产生的Kit配体作用于卵母细胞上表达的Kit，通过一系列的信号传导最终导致FOXO3的磷酸化和失活（从细胞核排出），导致卵泡生长启动所需的基因表达被抑制。Foxo3基因无效突变的小鼠不能抑制始基卵泡的激活，导致出生后不久始基卵泡全部激活，表现为随后的始基卵泡耗竭和卵巢早衰。

PDK1和PTEN是目前发现调节FOXO3磷酸化的主要成分。卵母细胞特异性PDK1缺失导致始基卵泡耗尽从而继发不育。PTEN是PIP3磷酸酶，因此是PI3K的负调控因子。卵母细胞中PTEN的缺失，消除了对PDK1和AKT激活的抑制，也导致始基卵泡生长激活和早期卵泡耗竭。

mTOR是PI3K家族的成员，包含两个功能不同的mTOR复合体，通过下游靶点调控转录、翻译和代谢，在始基卵泡激活过程中发挥重要调控作用。此外，mTOR通路受到TSC1/TSC2复合物的负调控。研究显示，敲除的小鼠的卵母细胞中Tsc1和Tsc2，虽然始基卵泡池仍能建立，但是始基卵泡被过早地激活，卵泡加速耗竭最终导致不育。而mTOR抑制剂雷帕霉素可抑制Tsc1敲除的小鼠的卵泡激活。此外，丝氨酸/苏氨酸激酶LKB1可通过抑制mTOR途径来抑制始基卵泡的激活。尽管以上研究证实mTOR信号通路在卵泡生长调控中的重要性，但其上游启动因子仍待进一步阐述，具体的信号传导途径尚未阐明。

Hippo信号通路在抑制生长、决定器官大小和组织稳态中起关键作用。Hippo信号通路的转导途径涉及一系列蛋白激酶，包括MST1和MST2，其通过磷酸化适配子蛋白SAV，并与之结合形成复合物，磷酸化LATS1和LATS2，后者与适配子蛋白MOB1A/B结合并磷酸化转录共激活子YAP1和TAZ。磷酸化的YAP1/TAZ保留在细胞质中。Hippo信号通路的失活导致YAP1和TAZ的低磷酸化，被转移到细胞核内，与TEAD1-4结合调节转录，导致细胞增殖和/或存活。该通路与AKT和mTOR通路在卵泡发育中具有相同的作用。

Hippo途径mRNA和蛋白质存在于卵巢中，随着卵泡从始基卵泡阶段进入窦状卵泡阶段，其表达量减少。在AKT激活的情况下，Hippo信号通路的失活可诱导卵泡向窦状卵泡发育。敲除Hippo通路组分编码基因的小鼠表现为生育缺陷和卵巢形态异常，包括卵巢囊肿的发生，全基因组关联分析研究发现编码YAP1的位点是PCOS候选基因之一，进一步验证Hippo通路在卵巢中的重要作用。

因此，有学者建议使用PTEN抑制剂、PI3K激活剂或mTOR激活剂对AKT、mTOR和Hippo通路进行干预以治疗卵巢早衰。而现有的研究已经验证，通过针对上述通路药物的干预，可以实现人类和小鼠卵巢中始基卵泡的体外激活，更有研究报道了对卵巢早衰妇女卵巢组织的体外激活并进行辅助生殖获得活产胎儿的案例。

除了上述信号通路外，根据小鼠的功能基因组研究，已明确了一些在始基卵泡向初级卵泡的转变过程中起作用的转录因子，包括NOBOX、SOHLH1和SOHLH2。Nobox、Sohlh1或Sohlh2基因突变的小鼠在始基卵泡过渡到初级卵泡的过程中有缺陷而不育。此外，细胞周期调节因子CDKN1B在始基卵母细胞的核内起作用，以抑制卵泡的早期激活。

此外，垂体切除的动物卵巢中仍有早期卵泡的发育，提示了卵泡生长的起始不需要FSH。在FSHβ亚基或FSH受体基因失活突变的人和小鼠中，卵泡可发育至次级卵泡和早期窦状卵泡阶段，但比FSH活性正常水平存在时更缓慢且频率显著降低。并且通过观察恒河猴胎儿垂体切除发现卵母细胞耗竭，说明了垂体衍生因子（不一定是FSH）在灵长类胎儿卵泡生长和生存中发挥重要作用。此外，对啮齿类动物卵巢的研究表明，窦前卵泡是促性腺激素的反应器官。对免疫缺陷和性腺功能低下的小鼠进行人类卵巢移植，发现FSH是超过两颗粒层阶段的卵泡生长所必需的。因此，没有促性腺激素的情况下卵泡可发育至窦前卵泡阶段，但是FSH可能促进卵泡的生长。

卵泡的发育成熟是卵巢功能建立的基础，从始基卵泡发育成熟为优势卵泡大约要经过一年的时间。在相当长的一段时期（大约300天）中，卵泡的成长不依赖促性腺激素，卵泡的发育过程由体细胞和生殖细胞之间的旁分泌和自分泌的局部因素调控。同一批募集的卵泡在该过程中持续闭锁而减少，直至青春期在促性腺激素作用下，通过激活相关基因转录、转录后机制（包括微RNA）和蛋白质翻译后修饰的信号途径等方式促进卵泡成熟。

（沈　薇）

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