第三节 免疫检测法的性能指标

免疫检测法是具有以下基本特征指标的分析方法：

● 灵敏度（sensitivity）：定量测量微量浓度分析物的能力。

● 特异性（specificity）：无须预先从复杂样本（如血液）中纯化分析物即可识别分子结构一致的分析物的能力。

● 准确度（accuracy）：通过使用参考标准和校准曲线对测量结果进行有值的量化，可以使不同实验室之间的检测结果具有可比性，且可与先前建立的基于健康人群和临床应用人群的参考值（本书中称为参考区间）进行比较。

● 精密度（precision）：测量值之间最小的差异，因此单个测试或重复测试的结果都是可信的，不同条件下获得的检测结果是一致的。

上述性能指标是相互关联的。对于检测血液样本（特异性）中分析物的微量浓度（灵敏度）来说，精密度和灵敏度是必需的。灵敏度与精密度密切相关，这是因为灵敏度是指分析物浓度，当分析物浓度低于灵敏度时，检测的不精确性将变得不可接受。因此，本节将精密度的相关内容紧排在灵敏度内容之后。尽管人们有时会理所当然地认为免疫检测法应该具有这样的性能，但在实践中想要达到可接受的分析性能仍是一大挑战。为了通过开发、优化从而获得满足其预期用途的免疫检测法，必须对这些基本性能指标进行测试。

一、检测灵敏度

本书第二部分第一节中讨论了灵敏度在实验设计方面的决定因素［参见“竞争性和非竞争性免疫测定（包括ELISA）的原理”］。灵敏度的概念是一种可能性，即检测方法能可靠地检测到样本中分析物浓度不是零时的最低浓度。经典的统计学方法是重复检测低浓度样本和零浓度校准品，并假设样本结果与零浓度无统计学差异，即零假设，并对此假设进行t检验。但是，在这种检验中，由于标准误差与检测次数的平方根成反比，因此“灵敏度”会随着检测的重复次数的增加而降低。显然，这种检验对于评估固有的检测灵敏度是没有用的。

因此，实践中最常见的方法是重复检测零浓度校准品，并将高于平均值2倍或3倍标准差所对应的浓度定为灵敏度极限值。该极限值等于样本的单次测值不会偏离空白值分布的概率，称其为分析灵敏度（analytical sensitivity）。

该极限值不需要很可靠，毕竟，在此浓度下的精密度可能会比我们认为能接受的还要差很多。灵敏度的评估还存在一个更深层次但未被广泛重视的问题。灵敏度总是低于第一个含有分析物的校准品的浓度，在某些情况下，可能会达到数量级上的差异。为了计算分析灵敏度，会使用该浓度校准品拟合一条校准曲线，并假设这条拟合的校准曲线近似反映该浓度校准品以下的真实剂量响应曲线，而真实情况可能并非如此。如图1-3-1所示，在这种情况下，计算所得的灵敏度（S₁）并不能反映真实的灵敏度（S₂）。

正是由于这些原因，引入了功能灵敏度（functional sensitivity）的概念，这一概念具有更大的实用价值。功能灵敏度指检测中变异系数小于一个特定的值，比如20%的最低分析物浓度（20%的数字是随意的数字，可能不适用于某些应用场景）。因此，灵敏度的概念已经从作为一种假设检验转变为一种估计。功能灵敏度源于检测范围内精密度变化的相关知识，即精确度图（precision profile），其衍变的由来将会在以后章节介绍。功能灵敏度浓度通常会但并不一定总是高于分析灵敏度。

功能灵敏度的推导过程比分析灵敏度更为复杂。如果文献或制造商的包装说明书中没有说明灵敏度的测定方法，则更可能引用的是分析灵敏度而不是功能灵敏度。

二、精密度和不精确性

精密度（precision）是描述一种分析技术的可重复性。不精确性（imprecision）则与精密度相反。它是对一种分析技术中误差的估计值，用变异系数百分比（%CV）表示，或者有些时候用特定分析物水平的标准差（SD）表示。“高精密度”与“低不精确性”具有相似的含义。人们普遍推荐使用“不精确性”这一术语，而不是精密度，理由就是实际测量的是不精确性（用%CV或SD表示）。然而，对于（不）灵敏度的使用尚未提出类似的论点，“精密度”这一术语被广泛接受。在本书中，为了使表述更接近于常规做法，更多地使用了“精密度”一词；但当使用“不精确性”能使表达更加清晰的时候，也会选择性地使用这一术语。

检测的不精确性是由几种来源的变异综合作用所导致的，这些变异的来源主要是由抗体特性、分离方法、检测方法和操作误差决定。

（一）抗体对精密度的影响

如果在检测结束时反应能够达到真正的平衡条件，则精密度会大大提高。抗体亲和力越高、反应速率越快，则在给定的时间和温度的条件下越有可能达到反应平衡。

下列参数的变化将会导致不精确性，这是因为它们当中的每一个都可以影响抗体-抗原结合反应的速率。此外，对于检测法来说，如果这些参数未得到正确的优化，那么反应速率也会降低。这些参数是：

（1）抗体浓度。

（2）温度及时间-温度图。

（3）最终反应混合物的pH。

（4）最终反应混合物的离子强度。

（5）固相上有效抗体包被密度的变化（如果使用固相吸附抗体）。

（二）孵育条件或仪器的变化

在孵育温度控制得不够或不均匀的地方，都会出现不精确性的问题。例如，在分析仪的孵育箱中，不同位置之间的温度可能存在细微的差异，这将会导致检测孵育结束时结合力的差异。使用自动分析仪进行检测，检测开始前样本或试剂温度的变化可以改变检测的时间-温度图谱的形状。所谓的“边缘效应”（edge effects）也可能会给微孔板检测法带来问题，这是由于微孔板边缘受热不均导致的。为了避免边缘效应，需要对孵育箱进行仔细地检查，以确保热量分布均匀。在固相微粒检测法中，由于在使用前微粒没有完全悬浮或在孵育期间固相沉降的差异，也可能会出现不精确性增加的问题。

（三）分离对精密度的影响

有效的分离应该是在错误分类误差最小且不干扰特异性结合反应的条件下，将游离部分与结合部分完全地分离开。将未结合的物质从微粒或反应孔中有效地分离出来需要包括清洗在内的一系列步骤，其所涉及的过程（如磁分离、重悬浮、抽吸等）可能会受到机械、流体或压力波动的影响。处理溶液与微粒的系统还可能会出现暂时的堵塞。

（四）检测误差对精密度的影响

使用放射性示踪剂的计算误差可能会很大，尤其是在低计数率的情况下。在放射性检测中，标准差等同于累积计数的平方根。每个试管中累积10 000个计数可将计算误差降低至1%。

氚和碳-14这类需要闪烁计数的标签，计数效率是另一种产生不精确性的原因，尽管通过使用内外部标准化可能部分地降低这种影响。在使用碘-125作为标签的检测中，使用的玻璃管的管壁厚度不均匀会进一步增加1%～2%的不精确性，应该避免使用此类玻璃管。

为了增加测试通量，放射性检测法通常会使用多通道伽马计数器来计数，这就需要对每个计数通道进行准确地校准并定期检查每个计数通道的污染情况，否则可能会导致额外的不精确性。类似的问题可能也会在微量滴定板读取器中发生，该类读取器通过多个光纤传输系统来测量所有的反应孔，因此需要定期检查和维护，以确保其保持良好的工作状态。

光学系统可能会受到与样本相关的干扰，如样本混浊或存在荧光团等。灯泡和读数器也会在使用一段时间后出现质量下降的情况。与信号生成有关的试剂也可能随着时间的推移而失去活性，从而增加了信噪比。

（五）操作误差对精密度的影响

移液不良会导致误差，加样时的误差会引入不精确性。盐分的结晶可以阻塞计量探针。免疫检测分析仪最可能出现严重计量错误的时间就是在一段时间不工作之后。

（六）精密度的等级

目前有以下几种指标用以评估精密度的等级。

1.批内精密度

批内精密度（within-run precision）是指在同一测试中多次检测同一样本获得的精密度。样本应进行20次的重复检测，且这些重复的检测在整个测试过程应为等距间隔而不是顺序进行的。可能需要评价数据的离群值，最好使用正规的统计学方法（例如，Healy在1979年的文章中描述的方法）进行评价。（译者注：批内精密度又称为重复性（repeatability），指在一组测量条件下的测量精密度，包括相同测量程序、相同操作者、相同测量系统、相同操作条件和相同地点，并且在短时间段内对同一或相似被测对象的重复测量。相关评估指南详见《CLSI EP05-A3定量测量程序精密度评估批准指南（第三版）》相关章节。）

2.测试间精密度

测试间精密度（between-run precision）是一个指标，用于描述检测法在测试同一样本时，每次测试和每天测试重现相同结果的能力。当以单次常规测定的方式对样本进行测试时，测试间精密度是由测试内和测试间的组合误差造成的。但当对样本进行重复测试时，通常会用结果的平均值来评估精密度。虽然用结果的平均值来评估精密度的方法很有意义，但重要的是要认识到平均结果本质上是更精确的。这就可以解释为什么测试间精密度CV可能会低于批内精密度CV这一自相矛盾的情况。［译者注：between-run precision我国一般称为批间精密度（参考《体外诊断试剂分析性能评估指导原则（征求意见稿）》（2009）］，指在同一实验室，由同一（组）操作员在同一仪器上，使用同一方法和同种、同一批号试剂，在一段时间内（一般为1个月或20个工作日）对同一测试样品（常用质控品）测量结果的精密度。

3.批间精密度

试剂批间精密度（between-lot precision）是使用不同批次试剂对测试结果可变性的评估（译者注：between-lot precision强调试剂的批次间差异，前文between-run precision强调同一批次试剂测试过程中的组合误差）。

4.方法内精密度和组内精密度及全实验室精密度

方法内精密度、组内精密度及全实验室精密度是指实验室间质量评价（能力验证）计划中，诸多实验室测试控制样本得到的精密度估计值；在评估单个检测方法的精密度时，只有方法内精密度与其具有特定的相关性。

（七）精密度的综合评估

通过使用均方根（root mean square，RMS）CV可将多个来源的、不相关的检测的精密度评估值结合起来：

式中CV是单个检测1到n的变异系数；N是每个检测中1到n次测试中数据的数量。

（八）最小可区分浓度差

了解免疫检测的精密度是非常重要的，因为它能够对给定浓度与指定值之间存在差异的概率进行评估。它定义了最小可区分浓度差（minimal distinguishable difference in concentration，MDDC）。

例如，假设一个孕妇血清甲胎蛋白（AFP）的检测结果为50IU/mL，该浓度的精密度CV为10%。那么多高浓度的AFP时，我们可以确信该值与50IU/mL不同呢？55IU/mL（比平均值高1个标准差）与50IU/mL存在差异的概率为84%。而60IU/mL（与平均值相差2个标准差）与50IU/mL存在差异的概率为97.7%。对于正态分布的数据，可以使用Z-得分表（Z-得分是偏离给定值的标准差个数）很容易地推导出其他概率。需要注意的是，单侧统计检验适用于此种情况。95%的概率的Z-得分是1.645。上述案例中，95%置信水平下的MDDC为58.2IU/mL。Sadler等人（1992）描述了MDDC在评估对促甲状腺激素（TSH）检测法性能中的应用。

MDDC为检测法的技术和临床性能之间提供了直接的概念性联系，是一种将分析目标与临床需求联系起来的有用方法。

在评估任何检测方法时，最基本的观念就是考察其是否给出了“正确”的结果。然而遗憾的是，目前没有单一科学术语可以用来描述这种“正确性”。一个理想的、能够给出完全“正确”结果的检测法，应该是那种在下列条件下测试含有相同水平分析物的样本都能得到相同结果的检测法：

● 来自不同的患者；

● 在不同的测试批中；

● 在不同的实验室；

● 在不同的条件下；

● 使用不同批次的试剂。

如果“准确度”这一术语是根据其在英语中常用用法来使用的，而不是专门用来描述偏差的话，可能会更好些。对于一种能够始终给出正确结果的检测法来说，它必须既精确又无偏差。一种检测法可能是准确的但不精确，或是精确的但不准确，或者是既不准确也不精确。如图1-3-2所示，A检测是准确但不精确，B检测是精确但不准确，C检测是既不精确也不准确。矛盾的是，尽管按照正式定义来说，A检测为更准确，但是B检测中的个别结果可能比A检测更有可能接近真实值。

（九）精确度图

在评估一个分析技术的精密度时，需要使用特定的质控品来测量不同浓度下的变异情况，这种方法存在一些问题。首先，精密度是在不同的分析物浓度水平下评估的，这些不同的浓度区间之间的精密度必须进行插值计算。其次，商品化的质控品是使用处理过的血液制品（通常是去脂化和去纤维化的血浆，并添加防腐剂）制备的。因此，该商品化质控的基质是经过标准化的，并可能显示出不同于常规样本的基质效应。即使是用常规样本自制的质控血清也要面对这样的事实，即样本混合可使样本之间的基质差异最小化。

因此，理想的解决方案是使用常规样本评估多种浓度下的精密度。通过这种方法，可以在很宽的浓度范围内检测精密度，从而绘制出检测法的精确度图（precision profile）（Ekins，1983）。

精确度图是通过计算重复测量值之间的差异而得来的，这些测量值按照浓度的相似性分成若干组。

式中d是第1到n个重复对之间的差异；N是数据对的数量。标准差除以一组值的平均值，再乘以100，得出%CV。由于精密度随浓度的变化而变化，因此只应汇总相同浓度范围内的数据。

如表1-3-1所示。以检测早期妊娠孕妇血清中游离雌三醇为例，使用电子表格来计算精确度图是一种非常简单的好方法。

A列和B列为重复测试的结果，C列为两次重复测试结果的平均值。D列和E列为单次检测结果占平均结果的百分比。将样本的平均检测结果按升序排列和分组，每组识别出大于20个样本。D列和E列中每组40个重复测量值的标准差就是该平均浓度下的CV。然后计算各组样本均值的平均结果并绘制精确度图，可以通过主观判断或通过拟合合适的多项式回归方程来绘制出这些点的最佳拟合线。许多免疫检测的曲线拟合程序都包含了相应的子程序以测试数据计算精确度图，有些子程序可以将这些数据与以前数据进行组合和比较。

精确度图中包含了检测方法适用范围这一有用信息。可以在适当的可接受的CV处（如10%）画一条线，该线与拟合的精确度图的交点即为浓度限值，在此限值之间的检测精密度判定为是可接受的。如果分析了足够的低浓度样本，则可以累积相关信息来估计功能灵敏度。

典型的精确度图如图1-3-3所示。

传统的精确度图计算方法存在的一个问题即在大量样本的重复测试结果中，仅一个分散的离群样本的存在，就会极大地增加该特定分组数据的表观CV。Raggart在1989年写了一篇关于这些严重误差的影响及如何处理这些误差的优秀的综述性文章。

上述技术的进一步变体可使用电子表格程序很容易地制成表格，即计算第一“组”（如20个样本）的平均值和CV，然后将公式复制到整个数据集中，如表1-3-2所示。这样可以给出浓度范围内的移动平均值。使用移动平均值方法的一个优点是，当离群样本进入入组范围内时，表观精密度会突然升高；当离群样本离开入组范围时，表观精密度会突然下降，从而可以很容易地识别出明显的离群值。理想情况下，应对分组数据采用正式的离群值检验来检查它们的存在。一种简单的方法是使用Healy在1979年提出的Healy检验，它采用整个数据集来检查平均结果的排名百分比差异，通常可以成功地检测出明显的离群值（图1-3-4）。

需要强调的是，精密度评估本身会受到抽样误差的影响，并且只有在样本数量足够的情况下才能对精确度图进行准确的评估。Sadler和Smith在1990年回顾了精确度图的计算及解释方法中存在的一些不足，并介绍了它们的推导方法以及相关的95%置信区间。

就临床实用性而言，最好选用医学决定水平处的精密度。最小可区分浓度差（MDDC）在这些值中最低，因此在临床分类中的误差也最小。

三、特异性和交叉反应

检测特异性（assay specificity）用以描述抗体仅对目标分析物产生可检测性反应的能力。交叉反应性（cross-reactivity）是对分析物以外物质的抗体反应的测量（图1-3-5）。由于抗体独特的特异性使其在分析技术中发挥了重要的作用，因此对特异性和交叉反应性的分析应成为任何免疫分析技术评价的重要组成部分就不足为奇了。许多蛋白质具有与高度保守的表位密切相关的结构，而类固醇激素也具有密切相关的结构，因此对抗体交叉反应性的评估必将成为检测法设计的第一步。在区分药物及其代谢物的过程中也会出现类似的问题。

交叉反应性可通过几种途径进行检测和表述。在竞争性检测法中，最常见的方法是将交叉反应性物质的纯品添加到无分析物的基质中，以获得合适浓度范围的样本。交叉反应性通常定义为信号减少至没有分析物的情况下获得的信号的50%的点（B/B₀为50%）对应的交叉反应物浓度，以此作为能够引起相同程度信号下降的分析物浓度的百分比。

然而，重要的是，我们要认识到交叉反应性百分比可能在整个检测范围内有所不同，这在使用多克隆抗体时尤其如此。在这种情况下，得到的交叉反应性体现的是在该分析物浓度下对结合反应影响最大的特定抗体克隆的交叉反应性。在低分析物浓度下，交叉反应性主要取决于高亲和力抗体；而在高分析物浓度下，亲和力较弱的抗体克隆影响最大。在多克隆类固醇检测法的研发中，一种有效的技术是故意添加少量交叉反应性类固醇，用来“淹没”含量少但具有很强交叉反应的抗体克隆。

在竞争性检测法的设计中，更为重要的是所测量的交叉反应性在剂量-反应曲线上的不同位置处会有所不同。Ekins早在1974年就证明了在竞争性检测法中相对效能（relative potency，RP）可表示为：

式中B和F分别代表结合部分和游离部分；K_eq和K_cr代表分析物和交叉反应物质的平衡常数。如果分析物的平衡常数为1010L/mol，而交叉反应物的平衡常数为108L/mol，则在剂量-反应曲线上的50%结合点处，观察到的效能为50.5；在10%结合点处，相对效能则降至90.0。

在免疫计量分析法的设计中，在内源性分析物存在下的交叉反应性的评估是必不可少的。如果将交叉反应物质添加到无分析物的基质中，则仅在该物质与两种抗体均结合的情况下才能观察到信号增加，没有信号可能意味着该物质不会发生交叉反应。如果在内源性分析物存在的条件下检测交叉反应，则可能出现完全不同的情况。交叉反应物质可能与捕获抗体、检测抗体相结合，并导致所测量的交叉反应性有显著差异（图1-3-6）。

如果交叉反应物与捕获抗体结合而未与检测抗体结合，则测量浓度会降低，导致负干扰（negative interference）。如果交叉反应物优先与检测抗体结合，在高交叉反应物浓度下也可能发生负干扰。只有当交叉反应物与两种抗体均结合时，信号才会增加，从而导致正干扰（positive interference）。因此，在免疫计量分析法中，真正的交叉反应性只能通过将每种抗体分别设计成竞争性检测法来进行评估，尽管这些单个抗体的测量本身除了作为检测法设计的工具之外，几乎没有实际用途。

无论检测法如何设计，检测交叉反应性（和干扰）的最佳方法是将物质添加到含有内源性分析物的样本中。相比经化学或物理分离处理的无分析物基质，常规样本提供了更为真实的基质，即当交叉反应物质或分析物与蛋白质结合时，在常规样本和经处理的基质中的反应可能会有所不同。交叉反应性应该在交叉反应物的参考上限的若干倍（比如2倍）处进行计算，而不是在剂量-反应曲线上的某个任意点处来计算，并表示为内源分析物浓度的表观百分比变化。这种方法对于评估在日常检测中可能遇到的干扰程度更具临床实用性。

（一）干扰

免疫检测中的干扰是由许多不同的原因导致的，我们将在第四部分第三节“免疫检测中的干扰”中对这些原因进行详述。

干扰（interference）比较实用的定义是：除了存在真正的交叉反应物质以外的、能够引起检测结果偏差的任何因素。大多数干扰的表现形式被归类为是由“基质”效应导致，这个术语在免疫检测领域中的作用与“特发性”在医学领域中一样，都是很有用的。但是，将任何异常结果都倾向于归类为是由基质效应导致的做法，往往对问题的进一步调查和找到可能的解决方案并没有什么促进作用。目前存在以下几种干扰机制。

1.有效分析物浓度的变化

（1）分析物被去除或者被阻断。分析物的去除或者阻断可能是特异性的，如性激素结合蛋白对类固醇的螯合作用。在竞争性检测法中，被去除或阻断的可能是标记的和未标记的激素，或是选择性去除或阻断未标记的激素。为了避免此种影响的发生，通常的做法是在检测中加入非抗体反应性阻断剂来屏蔽掉结合位点。此外，阻断作用可能是非选择性的，如疏水性药物或脂血样本中脂质囊泡中的类固醇的隔离，此种情况通常可以通过在试剂中加入选择性表面活性剂来纠正。对于皮质醇来说，一种巧妙的方法是将检测置于50℃和低pH的条件下进行孵育，在这种条件下，皮质醇与皮质醇结合球蛋白的结合最小，抗体结合相对来说不受影响。

（2）生理结合蛋白中的分析物被置换。在检测小分子（如甲状腺素T₄或三碘甲腺原氨酸T₃）的游离（非蛋白结合）部分时，结合蛋白的置换是一个主要问题。在这两个案例中，绝大多数T₃、T₄都是结合形态，只有很小的部分是游离形态。因此，如果某些物质能够将蛋白质结合的激素从其结合位点置换出来，就会干扰游离激素的检测，如非酯化脂肪酸在样品储存时，容易形成酯化脂肪酸，这类分析物就会使激素与蛋白结合点脱离，从而影响检测。

（3）抗原构象的改变。一些药物和其他半抗原在溶液中与二价阳离子形成复合物。许多蛋白质也含有二价阳离子结合位点。因此，血清中或EDTA血浆中存在镁或钙离子，都可能导致抗原构象的改变。在体内，免疫原是复合态的，正是这种构象激发了免疫应答。由此产生的抗体对复合形式的亲和力可能高于对游离形式的亲和力。虽然罕见，但对于某些分析物来说，应该考虑到这种现象。

2.抗体结合的干扰

（1）抗体的物理掩蔽。抗体的物理掩蔽通常仅出现在固相抗体系统中，在此类系统中，抗体包被在疏水聚合物为主的表面上。某些采血装置中所用的脂质和硅油有时会由于与固相产生非特异性结合，从而导致在固相抗体系统中出现问题。一些非共价结合的固相抗体的丢失也可能是由置换效应所引起的。加入特定的表面活性剂和/或修饰固相表面来使其疏水性降低，可以减少或解决此种问题。然而，表面活性剂的浓度确实需要仔细优化：高浓度可能会导致非共价结合的固相抗体的直接损失。血浆样本中的纤维蛋白是另一种常见的干扰因素。高浓度蛋白质的存在可能导致固相抗体的蛋白质覆盖，尤其是当这是添加到固相检测中的第一个成分的时候，此时检测处于未稀释的蛋白浓度下。几乎普遍用来防止非特异性吸附的做法是，用合适的惰性物质预先阻断固相上的活性位点。

（2）抗体结合位点构象的改变。抗体结合位点构象的改变可能是由于样本引起的反应介质中离子强度或pH的变化，或者是由于经过预提取的样本中残留的有机溶剂。后者对于组织、食物、土壤或法医样本的检测来说可能是一个特殊的问题，因为样本的精确成分可能会有所不同。然而，大多数检测法都具有足够的缓冲能力和离子强度能力，可以尽量减小样本pH和盐浓度差异带来的影响。

（3）低剂量钩状效应。低剂量钩状（low-dose hook）效应偶尔会在竞争性检测法中遇到，特别是在那些放射性检测法中，其抗原被标记到一个非常高的比活性。在低浓度的分析物时，抗原抗体的结合可以超过零浓度时的结合（图1-3-7）。这种现象被归因于抗体对抗原的正协同结合。

（4）高剂量钩状效应。高剂量钩状（high-dose hook）效应仅限于一步免疫计量分析法（夹心法），特点是在分析物浓度非常高时信号反而降低（图1-3-8）。这是由于分析物浓度过高，使捕获和检测抗体同时饱和而造成的，阻止了可检测的捕获抗体/分析物/检测抗体复合物的形成。高剂量钩状效应主要影响捕获抗体浓度可能有限的固相检测法和分析物的浓度范围可能非常宽的检测法，如肿瘤标志物的检测。设计这些检测法时必须仔细，以确保捕获和检测抗体的浓度足够高，能够满足整个病理范围内的分析物水平的检测需要。通常的做法是在这样的检测中，会将样本进行不同比例的稀释，重新检测来检查结果的有效性（图1-3-9）。

（5）嗜异性抗体。嗜异性抗体（heterophilic antibodies）是免疫计量分析法中公认的干扰源。在这种情况下，人体样本中的抗动物IgG抗体可能与试剂抗体发生交叉反应，特别是来自相同物种的试剂抗体，如小鼠单克隆抗体。嗜异性抗体与捕获抗体和结合抗体的反应可形成一个稳定的、可检测的抗体复合物，与分析物正常反应形成的抗体复合物相类似。

这种嗜异性抗体的流行率可能比文献报道所建议的还要高，因为这种“捣蛋”样本只有在检测结果与临床情况严重不符时才会被识别出来。少量的内源性抗体会导致分析物浓度在正常范围内变化，不太可能引起怀疑。对于这类抗体的来源有多种猜测。它们在经常接触动物的人身上更为常见，如动物饲养技术人员。这可能是由于初始抗体与最初负责产生内源性抗体的抗原具有相似的抗原表位所导致。接受单克隆抗体治疗或成像的患者在暴露于小鼠IgG 2～3次后，可对其产生抗体应答反应（图1-3-10）。

IgG和IgM嗜异性抗体都有被发现，后者特别容易发生反应，这是因为IgM是多价的，并且与固相结合时空间限制程度更低。Boscato和tuart（1986，1988）发现同时与捕获和检测抗体结合的免疫计量分析法最容易受到嗜异性抗体的干扰。在检测中加入与抗体试剂来源于相同物种的血清或免疫球蛋白，通常能够有效地防止此类干扰的发生。另一种方法是使用IgG的Fab片段而不是整个IgG分子，通常作为检测抗体（Miller &Valdes，1991）。

（6）自身抗体。内源性循环自身抗体已在各种分析物中被发现，特别是T₃和T₄（Bendtzen et al.，1990）。在竞争性检测法中，这种潜在的干扰可导致测量浓度明显升高或降低，这取决于自身抗体-分析物复合物是游离部分还是结合部分。在免疫计量设计的检测法中，所产生的影响几乎总是测量浓度的降低。

（7）补体和类风湿因子。补体（complement）与IgG的某些亚型的Fc片段结合，可通过阻断抗体而引起干扰，导致浓度的有效降低。在多克隆和单克隆抗体的检测中都发现了补体干扰（Masson 等人，1981；Käpyaho等，1989）。

类风湿因子（rheumatoid factor）也与抗原-抗体复合物的Fc片段发生反应。在使用包被了抗原的固相载体来检测抗体的检测中，类风湿因子会导致非反应性IgG的交联，因此当用标记的抗人IgG检测到非反应性IgG的交联物时，信号会增加。

3.捕获抗体与固相结合的干扰

使用生物素化的第一抗体（简称“一抗”）和链霉抗生物素蛋白（又称链霉亲和素）包被的固相载体（或者生物素在固相上，链霉抗生物素蛋白作为连接剂）是目前比较流行的技术。使用这种技术的检测法，检测内源性生物素循环水平高的个体的样本时，可能会发生干扰。

4.分离阶段的干扰

当溶液中的抗原-抗体复合物通过中间连接反应锚定到固相上时，如使用固相吸附的第二抗体（简称“二抗”）来锚定兔IgG的一抗时，在分离过程中可能会发生干扰。样本中的任何内源性嗜异性抗兔抗体都会与结合的第二抗体竞争。与免疫计量分析法中的干扰一样，常用的改进方法是加入相同或相关物种的动物血清来抵消其影响，尽管这样做的代价是降低了一抗的总体结合。

5.检测系统干扰

（1）内源性信号生成物质。内源信号生成物质的存在（比如时间分辨荧光检测中所用的铕）或是内源性颗粒酶（比如基于辣根过氧化物酶的检测中所用的膜结合过氧化物酶）可以在信号检测阶段产生干扰，尽管这些物质可以通过添加合适的阻断剂选择性地抑制。在均相荧光检测法中，荧光药物或代谢产物的干扰可能是一个特殊的但相对不常见的问题。

（2）酶抑制剂。酶抑制剂可以是化学抑制剂，也可以是免疫抑制剂。目前已经报道了能够与辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶发生交叉反应的抗体。在一些使用过氧化物酶作标记的检测设计中，某些质控血清中用作防腐剂的叠氮化物可能导致酶活性的抑制。

（3）酶催化剂或辅因子。酶催化剂或辅酶因子作为污染物存在时，可能会对酶免疫检测产生影响，如在过氧化氢存在的情况下铜离子污染会促进鲁米诺化学发光。

四、准确度和偏倚

当应用于测量领域时，准确度（accurcy）与正常的英语用法的含义不同，换言之就是误差很小。在分析测量领域，准确度的定义是平均测量值与真实值的接近程度。偏倚（bias）是测量值与真实值之间的差距，简言之就是不准确度。偏倚可能是均衡的（proportional），即检测结果高于或低于真实值的百分比是恒定的，偏倚也可能是恒定的（constant），即检测结果高于或低于真实值的浓度值是恒定的。这两种类型的偏倚可以同时发生，因此总体偏倚可能在检测范围内发生变化（图1-3-11）。

虽然概念简单，但准确度和偏倚解释起来还是很困难的。对于许多分析物来说，没有能够测量其真实值的参考方法。在这种情形下，准确度和偏倚可能只是相对没有意义的两个概念，而偏倚通常在这种情况下是通过与其他检测方法的一致结果进行比较来评估的，因此这是一个有明显缺陷的概念。回收率是对分析准确度最直接的评估方法，其中分析物可以以均匀的纯品形式获得，但该技术可能与阐述的其他问题有关（参见回收率部分）。

（一）回收

最常用于证明检测准确度的测试方法是评估回收。将精确量的分析物添加到样本中，并确定实测浓度的增量，其中回收正确表示为：

有些检验人员将回收表示为测量浓度除以预期浓度，这是不正确的：在这种情况下，计算的回收是基础样本中测量浓度和添加量的函数。

回收评估的不仅仅是检测是否得到正确校准。校准取决于无分析物基础基质的准备，已知浓度分析物添加到该基质中。这个基础基质通常经过化学或免疫处理，以除去内源性分析物，这种处理可能导致该基质与正常样本完全不同，从而导致检测产生基质效应。因此，回收评估了检测的校准以及样本和校准品基质间差异的影响。

回收通常使用3个或3个以上基础样本添加3种浓度分析物来进行评估。样本和添加样本浓度应该覆盖检测的临床范围。回收的计算受3个独立测量误差的影响：基础基质浓度误差、添加浓度误差以及回收添加物的制备及添加误差。与基础样本浓度相比，回收添加物浓度越小，计算回收的潜在误差就越大。因此，需要重复多次检测，并计算各检测的平均值，以尽量减少测量误差。

使用重复多次检测及不同水平的回收添加物评估回收需要用到相对大量的基础样本试样，因此常见的做法是混合患者样本来提供足够数量的实验材料。但这种方式并不理想，因为校准程序本身可能使用混合血清作为基质。因此，如果样本间存在基质差异，使用相对均匀的混合样本进行回收实验，可能无法发现任何差异。

将回收作为评价准确度的客观标准存在一些缺陷。首先，测量的计算过程容易产生较大误差，如果没有相应的95%置信区间，就不能客观地评估回收的计算。其次，回收只检测均衡偏差的存在，恒定偏差是被从基质样本和回收的测量值中等量扣除的。恒定偏差的评估可以使用由于生理或病理过程导致的分析物水平较低或缺乏的样本（以TSH为例，可以使用T₄抑制的志愿者样本或原发性甲状腺功能亢进患者样本）；或者是，如果有参考方法，可以通过与参考方法进行比较来评估恒定偏倚。

评价血清抗体检测回收的意义还有待商榷，即使是在有国际标准物质的情况下，所观察到的浓度增加也是样本中和回收添加物中已经存在的抗体的浓度和亲和力的函数。这种检测的准确度是相对的而不是绝对的，最好根据临床灵敏度和特异性的偏倚而非技术标准来确定准确度。

（二）稀释

稀释（dilution）是另一种检查检测准确度的有效方法，它提供的信息比回收更有实用价值。因为它回答了这样一个问题：如果一个样本被稀释，当稀释过程是正确的时候，会给出相同的结果吗？如果不是，哪个结果最准确？稀释实验通常称为平行性（parallelism）研究，因为实际上稀释实验是为了判断样本的稀释曲线是否平行于校准曲线。平行性是通过检测稀释于适当的无分析物基质中的样本来评估的。应该评估多个样本，并选取浓度均匀分布于检测工作范围内的初始样本及稀释样本。稀释通常是连续进行的，然而这不是最好的方法，因为每次稀释所产生的误差都会被累加到稀释评估中。

稀释的结果可以通过几种方法来表示，其中最简单的方法是通过乘以适当的稀释因子来计算最终浓度，并将最终浓度与稀释度做图。形式统计检验方法可以用来检验测量值与稀释度之间的最小二乘相关显著性。然而，这种方法的一个陷阱是，如果稀释因子是以定序型分布的，那么最低稀释度将严重影响结果。例如，1/16稀释的统计权重会比1/2稀释大得多，但这可能是对校准曲线中该区域浓度的不够精确的一种评估。

更好的评估稀释的方法是，制备部分稀释而不是倍比稀释的样本（例如，100、90、80、70、60、50、40、30、20、10µL，而不是100、50、25、12.5µL），将稀释样本的测值与检测中初始血清的体积进行最小二乘法回归，并检验直线斜率的95%置信区间。

稀释实验不仅受到测量误差的影响，而且还受到加样误差的影响，后者可能导致稀释过程中的系统误差和累积误差。测量分析过程中，独立稀释比连续稀释更受欢迎。

抗体的检测只有在样本中抗体的亲和力与检测校准品中抗体的亲和力完全一致才会显示出平行性，这是因为此类检测既反映抗体浓度又反映抗体亲和力。但上述说法并不可行，含有高亲和力抗体样本的稀释表现是过度回收，即测值明显升高；含有低亲和力抗体样本的稀释表现是不成比例的偏低。这种非线性会导致临床解释的困难，因为在临床中需要对抗体滴度进行连续监测，且在这种临床场景下，不同监测点的抗体活性需要进行不同程度的稀释，从而保证稀释后的结果在检测的测量范围之内。

这类检测的校准取决于是否有合适的标准参考物质可用。最好是这种参考物质所含的抗体具有代表性（平均）的亲和力。这样可以确保患者样本从总体来看得到了正确稀释，即大约一半样本的稀释表现是回收不足，一半样本的稀释表现过度回收。

（三）相关性和方法对比

已发表的关于新检测方法的论文几乎都无法摆脱这样一个历史悠久的传统，就是论文中需要包括与另一种方法的相关性研究，通常引用皮尔森相关系数r作为一致性程度的指标。严格地说，这个统计数据并不是特别有用。相关性检查的是两个参数是否存在相关性，只有确定了参数间是否有统计学相关性，相关系数才能够评价它们之间相关性的强度。对于评估参数间的一致程度来说，这是一个很差的指标。如果r是显著的，这也只是意味着存在一种可检测的关系，其实最简单的确定这一点的方法就是看试剂盒上的标签，这是因为两种检测同一种物质的方法，如果说它们之间没有任何关系，也太不可思议了。

方法学比较研究通常将考虑的重点放在线性回归得出的斜率和截距以及r与1.000的值的接近程度上。简单的最小二乘回归计算方法和相关分析具有很大的误导性，原因有很多。

（1）最小二乘法假设这种关系是线性的——但实际上可能不是。

（2）最小二乘法假设x变量没有误差。但是当两种免疫分析方法进行比较时，情况并非如此。相比较而言Deming在1943年提出的Deming回归法更为合适，本节将对Deming回归法进行详细叙述。

（3）相关性分析假设两组数据都是正态分布的。这种情况很少发生，因为大多数方法比较研究都包含不成比例的更多数量的高值和低值样本，以便能够在整个检测范围进行检测。极值的存在会严重影响斜率、截距和回归系数。宽泛的分析范围的确会产生更好的相关性，但不一定会产生更好的一致性。即使所使用的样本分布代表了正常人群，即使已知正常人群结果是呈对数正态分布的（就如同许多生物物质一样），样本对实际值的回归分析的影响几乎是普遍存在的。

（4）高的r值可以保证方法间的一致性，然而实际上在一些临床上重要的范围内，新方法可能是临床无效的，并且这种对方法学比较研究中相关性的误用是特别令人担忧的。

（5）可以用斜率和截距根据旧方法的结果预测新方法的结果。反之则不然：旧方法的结果可能无法从新方法的结果中预测出来。调转数据并使用新方法作为x数据来重复最小二乘法相关，会得到不同的斜率和截距的估计值，虽然回归系数保持不变。值得注意的是，不管选采用哪个检测方法作为x数据，Deming回归方法给出的斜率和截距的值是相同的。

最不可能发生的情况是，两种方法完全一致，所有测试的样本结果完全相同。原因就跟使用同一方法检测同一样本两次不会得到相同的结果一样。因此，方法学比较研究的主要目的是判断一种新方法所得到的结果与原方法有多大差异时才会导致对临床问题的解释存在差异的可能性。值得注意的是，这个问题不是一种假设检验，而是一种估计。

所需要的是对两种方法的一致性成对进行评估：这是一个完全不同的问题，需要单独的分析技术。首选的方法是Bland和Altman在1986年提出的方法，该方法的优化点在于使用的是测量值之间的百分比而不是绝对差异，这是因为在大多数免疫检测系统中，标准偏差是与浓度相关的。计算过程如下所述，可以简单地使用电子表格（Excel）来进行，如表1-3-3所示，其中部分数据取自用两种方法测定220名孕中期妇女血清甲胎蛋白（AFP）的比对结果。

● 应该使用多批次试剂和至少100例常规样本来进行检测。其中还应包括一些“存储入库”的样本，用来评估诊断异常范围内的结果。样本应至少重复两次或更多（增加重复的次数就会提高平均值的精密度，从而能够提升可信度，这种可信度体现在不同方法间的差异是真实存在的，而不仅仅是由一种或两种方法不精确性所造成的）。

● A列是参考（当前）方法A的数据，B列是新方法B的数据，C列是两种结果的均值，D列是新方法与参考方法的差值。在E列中，用平均结果的百分比表示差异。使用这种方法，结果之间10%的差异就意味着其中一个结果大约是另一个结果的1.1倍。类似地，66%的差异意味着其中一个结果是另一个的2倍，而100%的差异则意味着其中一个结果是另一个的3倍。

● 根据实验数据可以生成百分比差异与平均（mean）结果（E列与C列）的散点图。根据其中任何一个单独的结果绘制差异百分比图是不正确的，因为差异来源于每个结果，这就是著名的统计伪影。

● 方法B与方法A的散点图让人们能够对两者的关系及离群值一目了然。

图1-3-12显示的是数据的散点图。通过对数据进行最小二乘法回归得出如下关系：

方法 B = 1.012×方法 A + 2.704（r = 0.978）

由图1-3-12可知，两种方法的一致性非常好，斜率接近一致，但实际上还会有一点正偏倚。由其他已发表的方法学比较研究中引用的相关系数来判断，该相关系数将被认为是可以接受的。

然而，差值图展示了在AFP低浓度水平下偏倚的真实程度（图1-3-13）。这两种方法都适用于神经管缺陷的筛查，其中高值需要进一步调查研究。但对于唐氏综合征的筛查，AFP低值更具有临床意义，两种检测法将会出现明显的临床差异。Knight等人在1986年报道了当这样一种检测法用于唐氏综合征筛查时，由低浓度偏倚导致的后果，在这种情况下，被认为患有唐氏综合征风险增加的女性人数增加了3倍。该案例还强调了有必要根据不同诊断目的来检查现有检测方法的适用性。

最小二乘回归仅适用于模型Ⅰ回归问题，即其中自变量x不存在测量误差，因变量y受随机误差的影响。最小二乘回归应只用于两种特定情况下的方法比较研究。首先，x变量是个精确的参考方法或“金标准”，其结果可被认为是正确的；其次，在所谓的Berkson案例（Sokal 和Rohlf 1969年提出）中，x变量是目标值，如分析物已经添加到校准基质中，即使此类的添加可能也会产生误差。

实际上，两种方法都可能产生误差，并且通常不能将其中一种方法作为参考方法。在这种模型Ⅱ的回归问题中使用最小二乘法会导致对斜率的估计结果存在差异，这种差异取决于x或y变量是否是被当成独立变量。而实际上，定义x和y之间真实关系的斜率介于两者之间。

Deming回归（有时称为函数关系）与更常见的最小二乘法之间的差异在于：后者在假定x数据没有误差情况下，使y方向的方差最小，而Deming回归会使y轴向和x轴向的平方和最小。计算公式如下所示。首先，为了判断方法的相对不精确性，两种分析都需要对标准差或CV的比值λ进行评估：

式中CV_x和CV_y分别是代表x和y两种方法的变异系数。

U的定义如下：

式中x_i和y_i代表从1到N的单个结果；x和y分别是代表x和y数据的平均值。

回归线的斜率为Deming b_yx 由下式给出：

由式（1-3-8）可以计算出来y轴向回归残差的标准差为s_yx，并可以用该式来估计回归线附近点的离散程度：

截距为Deming a_yx，常规的计算方法如下：

回归系数r的计算方法及测值与最小二乘回归法相同：

1993年Linnet发表了一篇优秀的综述，对方法比较研究中的各种回归过程进行了回顾，并对数据点的权重进行了进一步的修正。

可惜的是，许多常见的统计程序并没有将Deming回归分析作为常规操作。但是，使用之前介绍的AFP方法比较数据相同的数据，可以很容易地将回归做成如表1-3-4的表格。为了简单起见，我们假定两种方法的方差是相当的，对于大多数免疫分析方法来说，这种假设是合理的。

图1-3-14展示了之前的数据，并覆盖了最小二乘法的斜率和Deming回归的斜率，Deming回归与最小二乘得出的斜率和截距略有不同：

方法B（y）=1.050×方法A（x）+1.087（r=0.978）

Passing和Bablock（1983，1984年）进一步介绍了一种以结构关系模型为基础的稳健程序，它无须对与样本相关的期望值或误差项的分布类型进行特别的假设。但计算过程是复杂的，依赖于对连接每个可能的数据对组合的回归线的中位斜率的评价。

需要进一步考量的因素与检测的相对准确性有关。如果参考方法极不精确，那么就不会有新方法会显示出与之具有良好的一致性，由于此种限制，即使使用参考方法将同一个样本检测两次，也不能与其自身结果有很好的一致性（偶尔开展这个实验会很有用，结果是令人惊讶的）。如果不精确性水平很高，对于某些检测来说这可能是一种固有的特性，且是不太可能得到改进的特性，那么我们有理由相信，重复检测同一样本，并使用平均结果，可以把不精确性的影响降到最低。

最后，即使方法间的一致性看起来很好，这本身也不能证明在不重新评估参考区间的情况下从一种检测方法直接更换为另一种检测方法是正确的。即便良好的实验设计与合适的样品入组可以使两种方法能够在相同的检测中进行评估，但如上所述相关性或直接方法比较的做法并不能替代该分析过程。

（四）检测漂移

检测漂移是指被测分析物浓度的系统变化，而不是随机变化，其大小取决于检测中的测试顺序。除非在整个检测过程中定期测试质控血清或混合的患者样本，否则不太可能检测到漂移。常见的评估不精确性水平的做法是连续重复测试，当存在漂移时，这种做法低估了不精确性（偏差）的真实水平。类似的争议也发生在重复测试零浓度校准品来评估灵敏度的情况。漂移引起的一个重要的问题可能是在二次校准中，通常校准品或质控血清都是在一系列的参考物质之后被当成未知量来进行检测，当按照常规方法测试校准品和质控品的时候，它们在检测中的位置发生变化，一旦校准成功，就会导致样品结果出现系统偏倚，并且偏倚方向会与之前检测偏倚相同，因此偏倚就会发生叠加。

检测漂移有以下几种可能的机制：

（1）检测设计中固有的漂移。在许多检测中，免疫反应还不能达到从始至终完全包容各种试剂添加量变化的程度。在某种程度上，这个问题可以通过适当推迟其他试剂的加入来得到缓解。然而，情况可能并非总是如此，尤其是对于那些分离是物理的，且需要同时对所有的样本同时进行处理（如按批清洗、离心或倾析）的检测。

（2）孵育温度变化。大多数免疫检测试剂是需要在2～8℃条件下保存，但很少有检测是在这个温度下开展的。如果直接用从冰箱中拿出来的试剂来进行检测，那么当随后检测进行孵育的时候，那些首先加试剂的试管的温度要高于最后进行检测的试管。考虑到温度每升高10℃，反应速率可能会翻倍，因此孵育温度的变化会导致漂移也就不足为奇了。

（3）固相沉淀。很少有固相悬浮液能在静止状态下保持悬浮状态，添加试剂的所用时间越长，沉淀就会越多，从而导致固相试剂浓度的改变。建议在添加的过程中轻轻搅拌固相成分，不建议使用磁力搅拌器混合磁性颗粒，显然有很多人曾不止一次的这样做过。

（4）信号生成。许多检测依赖最后一步添加的试剂来产生信号，虽然向100个孔中加试剂可能仅需要1min，但是许多读数器测量所有反应孔的信号所用时间远比这短得多。如果信号发展的时间是5min，那么相当于第一个孔的信号发展的周期比最后一个孔长20%。正因为这个原因，比色法检测通常会使用终止剂，有些实验室为节省开支会忽略掉这一步。

在整个检测过程中，通常会选用固定浓度间隔的质控血清来评估漂移。应该进行多次检测，并对加样位置和加样时间的检测数据进行线性回归分析。因为漂移总是与浓度相关，因此应该检测多个浓度水平的质控。取多次检测结果的平均值可以提升检测结果的可信度，并保证任何可见差异都是由于漂移而不是由不精确性造成的。在极端条件下开展检测会有所帮助，如低于或高于常规温度、减慢试剂或样本的加样时间以及缩短孵育时间。如果漂移存在，这些极端条件通常会将其引诱出来，这不仅为实验提供了阳性对照，还能够为试剂添加和孵育时间、检测规模、环境温度等方面提供合理的边界范围，超出这些边界范围，检测的表现便会不尽如人意。此外，正漂移和负漂移都有可能发生。

检测的孵育时间有越来越短的趋势，这种趋势加剧了漂移的问题，这就需要检测设计者有相当大的独创性来尽量减少此问题。

因为全自动仪器对试剂的添加、孵育时间和温度的控制程度更高，所以很少出现检测漂移的问题。然而，在由手工检测转换到半自动化取样设备的过程中所发现的问题并不少，在这种情况下应该自觉地重新评估漂移。试剂添加的用时几乎肯定是不同的。例如，在一分钟内使用重复分配器向100个反应管手工添加100µl的抗体试剂是很简单的事情，而一些自动化仪器完成相同的任务可能需要几分钟的时间。

五、参考文献

（张义、刘兴党　译，何建文　审）