第一节 竞争性和非竞争性免疫测定（含酶联免疫吸附试验）的原理

免疫检测法是利用抗体独特性质的高灵敏分析测试方法，是20世纪对医学和基础生命科学研究最有成效的技术贡献之一。免疫学技术，特别是免疫检测法，为人们提供了一系列精密的生物化学工具，可应用于研究和操控微量的复杂分子。更确切地说，这可能是自然界给予人们研究生物学过程的基础工具。

免疫检测法的特性源自抗体的如下3个重要性质：

（1）抗体具有广泛的结合能力。抗体能够与天然和人造化学物质、生物分子、细胞以及病毒结合。抗体的本质是蛋白质，其结合位点来源于大量潜在的氨基酸序列组合。每一种氨基酸都有其独特的结合和空间取向性质，而氨基酸肽链的扭曲和折叠可以提供多个结合位点。

（2）抗体与底物结合的特异性。这种优异的特异性确保抗体能够在大量类似物中检测出微量的分析物，如常规检测中可以对血液样品中皮摩尔（10-12）级别的激素进行分析。

（3）抗体与其靶标之间结合的强度。在免疫检测中，分析物和抗体通过强非共价作用结合，在后续的检测和信号产生的阶段维持其结合状态。因此，即使对生物体液中浓度很低的物质而言，免疫检测也可以获得准确结果。

自Rosalyn Yalow和Solomon Berson（Yalow和Berson，1959）首次阐述免疫检测原理以来，免疫检测方法适用范围越来越广泛，而且不断涌现出新颖巧妙的实验设计。其中一些设计形成了更灵敏的检测方法，开辟了临床研究和诊断的新视野；另外一些设计聚焦简化对支撑技术的需求，使其适用于自动化。这些技术不仅仅局限于医疗诊断，免疫检测法已广泛应用于药物、兽医、环境、法医、军事和食品科学等领域。在基础生命科学研究中，免疫检测法是阐释基本生物化学现象的重要工具。此外，免疫检测使用程序的简化，使用户能够在家中便捷地进行妊娠和排卵测试，此类产品以电视广告的形式被广泛推广。

一、抗体-抗原反应动力学

免疫检测法涉及分析物与至少一种抗体之间的结合反应。这种结合反应受多种因素影响，可能在几秒到几小时达到平衡。检测方法的设计可能从多种方面对平衡时间产生影响。例如，如果抗体被固定在微粒上而非Microtiter®的孔内，那么分析物分子在接触抗体分子之前的平均移动距离会大幅缩短。此外，pH、离子强度和温度也会影响反应平衡时间。

每种免疫测定方法的核心都是抗体和分析物之间的结合反应。不同检测方法间，结合反应的性质可能存在很大差异，这些性质对开发有效的检测方法具有重要的意义。早期的免疫检测往往需要温育过夜，以达到反应平衡。当前的免疫测定方法只需要相对较短的温育时间，而不要求反应达到平衡状态。在这些检测方法的设计中，更重要的是理解抗体-分析物结合反应动力学的一些简单概念。

抗体和抗原之间的反应以用质量作用定律简单地描述：

式中［Ag］是抗原浓度；［Ab］是抗体浓度；［Ag-Ab］是抗原-抗体复合物；k_a是结合速率常数，也称为k_on；k_d是解离速率常数，也称为k_off。

初看时，人们很难理解为什么动力学由两个速率常数而非一个常数定义。通过监测不同抗体-抗原的结合反应，可以更好地理解这种区别的重要性。利用生物传感器技术，可以实时生成分析物与固定在传感器表面的抗体间的结合信号（参见本部分第九节“表面等离激元共振在结合位点、动力学和浓度分析中的应用”相关内容）。在实验中，大量缓冲液流过包被抗体的传感器表面，然后将分析物加入到设备中，与传感器表面包被的抗体结合。随着结合分析物增多，反应信号增强。几分钟后，以缓冲液取代分析物溶液，便可以观察分析物与抗体结合的稳定性。图2-1-1显示了一种分析物与3种不同单克隆抗体结合过程的信号响应。

3种单克隆抗体与分析物结合速率的差异，表现为三者结合常数的差别。当分析物的供应停止后，会产生不同的后续信号响应。结合速率最高的抗体，其解离速率也最高。如果使用该类抗体进行免疫检测，在分离未结合的标记物时，如使用缓冲液清洗的步骤中，已结合的分析物会与抗体解离，因此这类抗体对大多数免疫检测类型不适用。

上述解释了理解k_a和k_d的重要性。然而，同样重要的是，我们要认识到式（2-1-1）中的模型代表了过度简化的一般情况。该模型基于以下假设：

● 抗原由单一分子组成并且以均相形式存在。

● 抗体也处于均相状态。

● 抗原具有一个可结合的表位。

● 抗体具有单一的结合位点，识别抗原的一个表位。

● 结合应一致，无正或负变构效应（分析物上一个位点与抗体的结合对另一个位点的结合不产生影响）。

● 反应处于平衡状态。

● 必须从游离抗原中完全分离出结合的抗原。

● 不应有非特异性结合（NSB），如与反应孔壁的结合。

尽管所有这些假设在实践中不可能完全成立，但质量作用定律为从理论上理解免疫检测技术的热力学原理提供了一个有效的框架。

两个速率常数的比值称为平衡常数（equilibrium constant，K_eq），表示结合的与未结合的分析物和抗体之间比值，又称为亲和常数（affinity constant）。K_eq是衡量免疫检测中抗体有效结合能力的关键指标。

从式（2-1-1）可以得出，当达到平衡状态时：

式中K_eq=平衡常数。

代入：

公式重排：

式中［Ab_t］是抗体的总浓度，［Ab］+［Ab-Ag］；［Ag_t］是抗原的总浓度，［Ag］+［Ab-Ag］；［B］是结合抗原的浓度；［F］是游离抗原的浓度。

式（2-1-5）表示［结合］/［游离］抗原的比值与结合抗原的浓度呈线性关系。依据这种关系绘制的图形称为斯卡查德图（Scatchard plot）（Scatchard，1949，图2-1-2）。

从图中可以得出两个实用参数：平衡常数K_eq，即直线的斜率，以及抗体结合位点的总浓度［Ab_t］，即x轴上的截距。因此，可以推断：

图2-1-3显示了在保持抗体结合位点浓度不变的情况下增加平衡常数的效果，图2-1-4显示了改变抗体的量但保持平衡常数不变的情况。

需要注意的是，并非所有预估的［B］/［F］和［B］数据点都具有相同的权重。［B］/［F］的比值偏高或者偏低对测量误差的影响程度可能不同。因此，在构建斯卡查德图时需要谨慎，以便合理设置抗原浓度从而确保结果尽可能准确。

结合状态与游离状态抗原不可能100%分离，而一些残余的游离抗原浓度可能被计入结合抗原部分。斯卡查德图中低［B］/［F］比值区域通过结合抗原的截距来估算总抗体的浓度，在这一区域中误差会对结果产生不成比例的影响，因此非特异性结合（non-specific binding，NSB）需要被尽可能准确确定。

图2-1-5显示具有不同平衡常数的多克隆抗体血清的典型斯卡查德图。此例中的曲线，能够简单地将相关抗体分成两类：高亲和力抗体和低亲和力抗体。

有时，使用倒数图（也称为Langmuir或Steward-Petty作图法）能够更加准确地估计抗体浓度。

重新排列式（2-1-3）：

代入：

图2-1-6展示了一个1/［B］对1/［F］的典型倒数关系图。

在游离抗原数量足够多时，抗体完全饱和，即：

在斯卡查德图上确定最准确的曲线以估计K_eq 的值可能比较困难，对于多克隆抗血清（包含亲和力不同的抗体混合物）尤其如此。在这种情况下，平均平衡常数可能是衡量抗体亲和力唯一有效的指标。两种简单的作图方法可以获得抗体平均平衡常数。第一种方法是取抗体结合位点半饱和状态时的值近似为K_eq。

从式（2-1-2）可知，当抗体结合位点为半饱和时：

以［B］对log［F］作图，如图2-1-7所示（使用对数是为了考虑到值的范围）。在100%饱和状态的一半处画一条平行于x轴的直线，过直线与曲线的交点，画一条垂直于x轴的直线，该直线与x轴交点的横坐标即1/K_eq的合理平均估值。

第二种作图方式是Sips图法（Nisonoff and Pressman，1958）。该方法需要利用斯卡查德图或倒数图估计总抗体结合位点。

重新排列公式（2-1-2）：

当：

即处于半饱和状态时，

可以通过如下二变量作图：

当：

同时：

该方法如图2-1-8所示，K_eq表示平均亲和力常数的估计值。

常见的抗体平衡常数范围为106L/mol到1012L/mol。平衡常数小于108L/mol的抗体一般不适用于免疫检测。需要注意，抗体浓度是针对抗体结合位点的总数。对于小分子半抗原，IgG上的两个结合位点都可以与抗原结合，即效价（valence）为二。对于一些大分子蛋白质，位阻效应可能会阻止抗体两个结合位点同时与抗原结合。当抗原是多价时（具有重复表位），分析斯卡查德图会变得困难。在这种情况下，与每个抗原结合的抗体分子的数量服从泊松分布（Poisson distribution），因此需要更复杂的模型来估计K_eq和［Ab_t］的值。

质量作用定律也可用于预测［B］/［F］比值随抗原［Ag］浓度（或剂量（dose））增加而变化的情况，即剂量-响应曲线（dose-response curve）。

根据式（2-1-2），结合抗原与游离抗原的比值［B］/［F］为：

游离［Ag］和［Ab］为：

结合抗原与游离抗原的比例可由式（2-1-20）和式（2-1-21）重新排列获得：

结合式（2-1-2）与式（2-1-19）：

将式（2-1-21）与式（2-1-23）代入式（2-1-24）：

乘以1+［B］/［F］来简化：

化简为熟悉的二次方程，ax2+bx+c=0。x的解为：

因此，在K_eq和［Ab_t］都准确已知时，对于任何给定的［Ag_t］都可以计算出对应的［B］/［F］；或者相反，对给定［B］/［F］可以求解对应的［Ag_t］。换言之，通过确定［B］/［F］的比值，可以计算抗原含量。为了确定［B］/［F］的比值，需要分离结合抗原和游离抗原，并确定两者的相对比例。然而，实际测量结果可以更直接关联为结合抗原相对于总抗原的百分比，因此使用下式更为方便：

图2-1-9显示了典型的结合百分比与［Ag_t］的图。

如图2-1-10所示，抗体浓度增加时，结合百分比（%Bd）曲线向右（即向更高抗原浓度 ［Ag_t］的方向）移动。

如图2-1-11所示，抗体平衡常数K_eq增大时，反应的斜率提升。

二、免疫检测的设计

多年来，人们开发出了不同设计原理和反应模式的免疫检测方法。这些设计主要可分为两大类：第一类设计包含基本原理，主要依据免疫分析技术的基本特性。第二类设计在免疫检测基本原则基础上继续深化，以提高分析精密度，减少孵育时间，简化技术或使方法更易实现自动化。本节仅讨论免疫检测方法的基本设计。本书第七部分将详细介绍建立在这些基本原理基础上的各种设计方案。

（一）竞争法（试剂受限）

由上述可知，在已知平衡常数和抗体浓度的条件下，对于任何给定浓度的抗原，可以计算出结合/游离抗原（B/F）的比值，进而推导出结合百分比。反之，如果测定出结合百分比，可以计算出溶液中的抗原浓度。Yalow和Berson提出的人血清胰岛素测定方法是第一种免疫分析方法（Yalow和Berson，1959），其基于上述原理建立。在本书中，这种免疫检测的模式称为竞争法（competitive assay）。

确定结合/游离抗原比值需要将溶液中的结合抗原与游离抗原分离，并确定两种抗原的相对含量。结合抗原与游离抗原的分离可以简单地通过从反应混合物中分离抗体组分实现；此时抗体-抗原复合物被分离，而游离抗原则被留在溶液中（图2-1-12）。

在Yalow和Berson开发的方法中，微量的、经放射性标记的125I-胰岛素（示踪剂）被加入到反应体系中。随后通过监测放射性物质在结合和游离胰岛素之间的分布可以确定胰岛素在这两部分之间的分配。实际应用中，K_eq或抗体浓度均难以具备足够的准确度，因此难以准确推测抗原的浓度。将已知抗原浓度的样本作为标准品（standards）或校准品（calibrators），根据标准品中抗原浓度可以绘制其结合部分活性占总活性百分比的校准曲线。根据校准曲线可以计算未知样本中的抗原浓度（图2-1-13）。

该类检测方法通常称为竞争法，但是只有在抗体结合位点完全饱和的情况下才会发生竞争性结合，因此该说法某种程度上存在误导。竞争法中，抗体结合位点并非完全饱和，标记抗原仅用于评估结合部分抗原和游离部分抗原之间的分配情况。

Ekins将这种检测方法称为试剂受限（reagent limited），以与后文中的试剂过量（reagent excess）检测方法区分（Ekins，1977）。然而，该术语并未长期流行，竞争法这个术语更为直观，且仅使用一个单词，因而被最终认可和广泛使用；相应地，术语试剂过量被免疫计量检测法（immunometric）代替。

不同的分离和检测系统被用于竞争法的设计。详见第三部分“固相和其他分离系统”、“信号产生及检测系统”两节以及本部分第二节“均相免疫测定”相关内容。

采用标记抗原的检测方法在理论和实际应用均存在一定缺点。首先，这类检测方法的灵敏度主要取决于抗体的平衡常数，但与其他设计方式不同，竞争法难以充分利用抗体的结合潜能。其次，在抗原标记过程中，分析物的关键表位可能会被影响或被掩盖，导致抗体对其识别效果减弱甚至消除。在某些情况下，如果标记位点与半抗原偶联形成免疫原时位点相同，标记后抗原可能增强抗体的识别效果，这种现象称为桥联识别（bridge recognition）。详见第三部分第一节“抗体”。

（二）单位点免疫计量分析法

1968年Miles和Hales使用标记抗体代替标记抗原设计免疫检测方法，这是免疫检测设计中的首个主要进展（Miles和Hales，1968），其基本原理如图2-1-14所示。首先，样本或抗原标准品与标记抗体共同孵育；反应结束后，通过加入过量的固相偶联抗原，将未结合的标记抗体从溶液中除去。

从经验上讲，这种设计有两种主要的变体，两者代表这类设计的极端情况。第一种设计变体中，检测方法与竞争法类似，使用有限浓度的抗体。例如，在游离甲状腺激素的测定中，标记抗体在溶液中的游离激素和固相结合的激素之间分配，这两种反应同时发生。有关此检测方法的配置，请参阅本部分第四节“游离分析物免疫检测”。

第二种设计使用过量的标记抗体。如果仅从经验角度考虑，大量标记抗体的存在将使抗原和抗体结合反应完成度高于竞争法（式2-1-1），从而克服后者设计中平衡常数对检测灵敏度的限制。实际上，检测方法的灵敏度很大程度上取决于测定目标来自哪一部分，即溶液中与样本结合的抗体或是通过固相分离提取的抗体。前者的测定在很大程度上受到无免疫活性的标记示踪剂的影响；后者的测量借助固相分离。当标记抗体浓度较高时，灵敏度取决于能否在两个较大的测量值之间检测出非常小的差异，因此后者难以实现。

在实际应用中，使用高浓度标记抗体的单点免疫测定法在灵敏度方面难以对竞争法形成优势，因此并未广泛普及。

（三）双位点免疫计量分析法（试剂过量）

许多蛋白质具有多个表位，而且这些表位在空间上充分分离，使其可以同时与两种抗体结合。1970年，Addison和Hales依据上述原理最早提出的双位点免疫检测方法（Addison和Hales，1970）。两种抗体的结合可能是依次或同时发生，基本原理如下：首先样本与捕获（capture）抗体温育，捕获抗体与蛋白上的第一个表位反应并与固相结合。然后清洗固相以除去未反应的组分，并进一步与标记的检测（detecting）抗体温育。此时，检测抗体与捕获抗体-抗原复合物结合。最后，再次清洗以除去未反应的过量检测抗体，并最终确定来自固相的信号强度（图2-1-15）。

典型的剂量-响应（校准）曲线如图2-1-16所示。如果捕获和检测抗体反应尚未完成，那么剂量-响应曲线将接近直线。许多检测方法都是如此，尤其是低浓度情况。有些检测方法具备足够的线性，可以对标准曲线进行单点校准。

该种设计在增加分析方法特异性上具有明显优势。例如，糖蛋白激素促甲状腺素（TSH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）、促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH）共用一种α-亚基，而各分析物生物特异性是由差别相对较小的β-亚基决定。通过设计特异靶向TSH β-亚基表位的捕获抗体，可以在样本中存在大量具有相同α-亚基的hCG的条件下（如妊娠期），特异性捕获TSH。清洗除去未反应的组分后，采用抗α-亚基的抗体可以检测结合复合物。随着具有单一表位特异性的单克隆抗体（monoclonal antibodies）的出现，这种设计类型才真正呈现出实用性。许多双位点免疫计量分析法采用一步温育模式，在这一过程中，样本中的抗原同时与捕获和检测抗体结合。

免疫计量分析法也常被称为夹心法（三明治法，sandwich）。将抗体或抗原包被在固相上，并使用酶标记物进行检测的免疫计量分析法，也称为酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）。

（四）检测方法灵敏度的决定因素

了解有关分析测定方法设计的基本原则是应用的关键前提条件。但在免疫检测技术的概念出现多年后，人们仍未足够重视其检测原理。

Roger Ekins是主张基于基本原则设计免疫检测方法的最主要倡导者之一。在1979年的著作和后来的许多场合中，他对当时免疫检测设计的实际状态——许多设计方案基于文献中重复的出现的经验概念，以致经验逐渐被公认为理论表达了失望。

早期免疫检测方法的性能受到多种现实因素的制约，如抗原分离、纯化和标记相对困难，而且难以获得足够特异性的抗血清。因此某种程度上，可以理解人们采用经验方式设计免疫检测方法。同时，还有一种普遍的想法，当几个简单的实验能够获得同样的结果时，人们几乎没有动力去求助于看起来相对复杂的数学公式。

大多数关于免疫检测的理论分析聚焦于决定测试灵敏度的因素上。高灵敏度是所有分析技术本身需要的性能。事实上，免疫检测所提供的高灵敏度是（且将持续是）其使用和继续发展的主要原因。对于某些分析物，如果目标浓度范围高于现有的灵敏度，更高的灵敏度可能不是必须追求的性能。选择高灵敏度还应考虑如下因素：

● 更高灵敏度检测方法可能为以前未认识或无法诊断的疾病提供新的诊断机会。例如，第三代促甲状腺激素（TSH）检测方法的发展，为区分甲状腺功能正常和甲状腺功能亢进提供了可能（见第七部分第二节“甲状腺”中“促甲状腺激素”部分）。

● 高灵敏度方法可以分析更小样本量或更容易获得的样本，如从新生儿毛细血管获得的血样或唾液样本。

● 小样本量还有另一个重要优势。很少有免疫测定方法完全不受生物体液中不良因素的干扰。含有等量分析物的不同样本，可能会测定出不同的结果。样本在整个反应体系中所占的比例越小，这些基质效应（matrix effects）对测量准确性的影响就越小。因此，高灵敏度分析的结果可能更加稳健。

尽管各种各样的设计中最佳测定条件和试剂浓度存在差异，但一些结论对于免疫检测方法设计是普遍适用的。

在任何分析技术中，灵敏度定义为分析物能够被可靠判断的最小浓度，或者可以更正式地定义为在没有分析物的情况下，在统计学上不可能成为信号范围一部分的分析物的最低浓度。比如，浓度为零时的信号值加上2倍的标准差所对应的浓度值。这个概念广泛应用于几乎所有测量领域中：在电子学中，其通常被称为信噪比（signal-tonoise ratio）。信噪比是与音乐相关的概念，很适合用于描述灵敏度。与盒式磁带相比，光盘的音质改善并非通过提升音量，而是通过消除背景噪声实现的。因此，灵敏度取决于两个因素：分析物存在时的信号增益幅度和分析物不存在时的测量误差（图2-1-17）。

Yalow和Berson最初认为竞争法分析灵敏度主要由剂量-响应曲线的斜率决定（Berson和Yalow，1970；Berson和Yalow，1973），因此许多工作人员专注于优化这一参数，而未考虑测量误差。

然而，Ekins将注意力集中在测量时的误差上。他驳斥了斜率的影响，认为如果将其绘制在不同的参照系中，如结合物或1/结合物对抗原浓度作图（Ekins，1979；Ekins and Newman，1970），相同的测试方法会得到不同的斜率，因此关于反应物的最佳浓度会得到相反的结论。Yalow和Berson的论点某种程度上是正确的，其基于结合百分比的斜率分析，因此被测信号的变化率，而非添加反应物的总量，决定了两种测量方法之间的差异。

任何理论分析都必须结合热力学和统计学元素，而非单独使用。需要注意的是，在完全没有任何误差的情况下，将不会存在最佳设计。

因此，免疫检测方法优化可被简化为两个步骤：识别误差来源，以及确定将误差最小化的合理试剂浓度。

虽然只有数学模型才能给出试剂最佳浓度的定量判断，但Ekins证明可以通过测量抗体结合位点是否被占用而定性判断试剂最佳浓度：抗体占用原则（Ekins，1991）。

1.抗体占用原则

所有的检测方法，不管哪个组分被标记，基本上可以用如下两种方式之一来描述：测量被抗原占用的抗体结合位点，或间接测量未被占据的结合位点（图2-1-18）。

在竞争法中，标记抗原结合未被样品抗原占据的抗体结合位点。在此体系中加入未标记的（样本）抗原会导致未被占据的抗体结合位点数量减少。

在夹心法中，标记抗体测定被抗原占据的结合位点。因此，从没有分析物的背景信号开始，测量信号随着抗原浓度的增加而上升。一般来说，在低背景下测量强信号要比测量两个强信号之间的差异容易得多。基于这个原因，夹心法理论上具备比竞争法更高的灵敏度。

对于竞争法的设计而言，当标记抗原量相对较少时，加入未标记的样本抗原后引起的信号变化率更大。

相反，在评估被占据的抗体结合位点时，如夹心法设计，标记抗体的浓度高则结合过程导致的信号变化最大。

在竞争法设计中，标记抗原量较少，因此抗体也需要较低的浓度，以最大限度地减少估计未占据位点时的误差。由于结合位点的占有率百分比主要由抗体对抗原的亲和力决定，所以在设计竞争法时，平衡常数是决定方法灵敏度的主要限制因素。

这些定性分析的结论需要在预估的误差范围内判断。

在竞争法中，标记抗原的浓度趋于零，所以测量误差非常大。低浓度标记抗原的测定精密度是一个限制因素。

同时，NSB（非特异性结合，non-specific binding）标记抗原的总浓度有关，标记抗原结合百分比低会使得NSB及其误差与特异性结合相关性加强，因此也值得关注。NSB的变化是造成总体精密度低的主要原因。

总之，竞争法的灵敏度受3个因素的影响：平衡常数、信号测量的精密度和非特异性结合水平（在特异性结合中占很大比例）。在没有其他因素的情况下，每个因素会单独占主导地位。如果NSB和测量标记抗原时的误差不大，可以在初始结合率很低的情况下（如1%或2%）达到最佳灵敏度，这与实践经验大相径庭。在这种情况下，分析的灵敏度仅受残留误差（如移液）和平衡常数的影响。当NSB显著时，需要更高的抗体水平以增加标记抗原结合的百分比，从而提高信噪比。在这种情况下，灵敏度是关于K_eq和非特异性结合水平的函数。最后，如果信号测量时存在显著误差，则需要加入大量标记抗原，在这种情况下灵敏度还取决于检测试剂的比活度（specific activity）。

夹心法中直接测定被占据的抗体位点，情况与竞争法相反。高浓度的捕获和标记抗体都能保障高比例抗原被结合。因此，随着抗体浓度逐渐增加，检测方法的灵敏度也会提高。然而，标记抗体用量增加时NSB也会升高。NSB是标记抗体添加总量的函数，随着系统中添加更多的标记抗体，NSB及其误差也随之增加，并最终达到NSB水平的增速高于特异性结合速率的程度。换言之，信噪比存在一个最大值。最大灵敏度点取决于NSB的水平和其相关误差，以及低水平信号的测定误差。

综上所述，平衡常数在确定夹心法灵敏度方面影响较低，而主要影响因素是NSB水平和NSB不精密度，以及信号的测量误差。因此，高灵敏分析方法需要与抗原浓度相对应的高浓度抗体、低NSB和高特异性标记。在NSB不显著时，信号测量误差是影响灵敏度最重要的因素。当测量误差和NSB都不显著时，灵敏度限制因素是平衡常数和其他一些实验误差。因此，高灵敏度的免疫分析依赖于实现低NSB和采用高特异性的检测试剂。

当利用固相分离多余标记抗体，以估算未占据的抗体结合位点时，单位点免疫计量检测设计可以被看作为竞争法。相反，如果测定溶液中与分析物结合的标记抗体，进而估算被占据的结合位点，这类设计更类似于夹心法。

2.理论模型和定量预测

（1）任何理论优化模型都需要考虑如下变量：

● 抗体平衡常数。

● 抗体浓度（双位点免疫计量分析法中的两个抗体都需考虑）。

● 标记抗原的添加量（选择竞争法时考虑）。

● 样本和温育体积。

● 检测试剂的活性（如放射性检测中同位素标记试剂的比活度）。

● 检测试剂的非特异性结合水平。

（2）方法优化还需要建立测量误差的模型，这些误差来自于：

● 非特异性结合平均水平的变化。

● 移液器的不精密度。

● 操作误差（离心、分离、洗涤）。

● 最终信号的测量精密度。

（3）最后需要对反应机制做出假设：

● 双分子反应，并遵循质量作用定律。

● 所有试剂是均相的，独立反应且无变构效应。

● 所有反应物在反应混合物中均匀分散。

● 分离过程不会影响平衡。

3.竞争法的设计

两种不同的方法可用于确定理论分析灵敏度和反应物的最佳浓度。第一种方法是分别评估误差和剂量-响应（校准曲线）斜率；第二种方法依赖于将误差与斜率相结合的统一方程。

第一种方法在概念上最简单，并且给出的值与Ekins（Ekins和Newman，1970）使用的相同标准的响应/误差方程得到的值非常接近。将试剂浓度的值代入式（2-1-28），得出结合百分比的估计值。然后使用结合百分比来计算未标记抗原添加剂量为零时的信号，以及由于其测定中的误差之和而产生的标准偏差。以结合百分比计算灵敏度，并将数值代入剂量-响应方程，以确定在极限灵敏度条件下对应的抗原浓度。Borth（1970）和Ezan（1991）提出了类似的方法。

由于移液和其他实验操作造成的误差，通常在宽泛的测定条件和反应物浓度范围内是恒定的。误差的准确值只能通过实验来确定。然而，如果以变异系数（coefficient of variation，CV）表示操作误差，其数值可能处于1%～3%。相反，在低浓度的标记抗原和/或低特异性结合的情况下，结合标记抗原的测量不精密度可能会显著增加。例如，使用放射性检测或发光检测，10 000个累积信号事件的CV将为1%（误差是总计数的平方根占总计数值的百分比，即100/10 000），而100个事件的CV将为10%（10/100）。NSB的误差也可能对整体误差做出很大贡献，尤其是其在整体结合事件中占比很大的情况下。NSB的平均水平处的变化可能相当大。例如，通过离心分离抗体-抗原复合物时，倾析离心管后剩余的游离抗原量可能存在很大差异。这三种误差来源需要分别进行评估，然后根据它们的标准偏差进行合并。

分析过程分为以下几个步骤：

（1）式（2-1-28），如前文所述，可以用来确定任何浓度的反应物的结合部分/游离部分比例。在没有添加未标记抗原的情况下，平衡常数、总抗体和标记抗原浓度的值可代入方程，并确定［B］/［F］比和结合部分（B_f）：

（2）总信号响应（R_t）可以由抗原的总浓度、比活度、反应体积和信号测量时间来确定：

式中Ag_t是标记抗原的总浓度，单位为mol/L；S是标记抗原的比活度，单位为信号/mol/s（放射性标记的比活度，单位为Bq/mol）；V是反应混合物的总体积，单位为L；T是信号测量的时间，单位为s。

（3）计算由特异性抗体-抗原结合（R_o）引起的信号响应：

（4）由非特异性结合（R_nsb）引起的信号响应可以通过游离抗原占比的函数计算：

式中：NSB游离抗原非特异性结合的部分。

（5）在未添加无标记抗原时，特异性结合信号的标准差仅由实验误差（s.d._e）引起：

式中CV_e是由于实验误差引起的变异系数。

（6）计算非特异性结合引起的信号响应的标准差（s.d._nsb）：

式中CV_nsb是非特异性结合的平均水平的变异系数。

（7）放射性信号、化学发光信号和荧光信号遵循泊松分布。在没有未标记抗原的情况下，检测到的总信号响应是特异性结合信号R_o和非特异性结合信号R_nsb的和。测量的标准差（s.d._m）是总信号响应的平方根：

（8）信号的总组合标准偏差（s.d._a）为：

（9）在没有未标记抗原的情况下，对应于信号分布95%置信区间（通过单侧测试）的信号值（R_det）为：

（10）因此，可以估计灵敏度极限（［B］/［F］_det）下的结合部分比例（B_det）和［B］/［F］比值：

（11）方程（2-1-28）可以重新排列，由其他试剂浓度、平衡常数和［B］/［F］比值给出灵敏度极限下存在的总抗原浓度：

（12）在极限灵敏度下代入［B］/［F］_det可以计算存在的总抗原浓度（标记的和未标记的），因此灵敏度可以推导为：

式中［Ag_det］是检测限条件下的标记和未标记抗原的总浓度；［Ag_t］是标记抗原的浓度。

上述灵敏度是针对反应混合物而言。如果测定方法的灵敏度为1pmol/L，但样本被试剂稀释为1/5，则说明实际灵敏度为5pmol/L。

这些简单的方程非常有用，可以通过改变反应物浓度和平衡常数来进行“假设”计算。将相关参数代入式（2-1-28）可以得到理论剂量-响应曲线，求解二次方程即可以得到［B］/［F］，进而得到结合百分比。图2-1-19显示了平均平衡常数为1×1010L/mol的反应体系中，结合抗原的百分比随着抗体稀释倍数变化情况。曲线a、b、c、d和e代表抗原浓度从10-9到10-11范围内递减（对应于10/K_eq到0.1/K_eq）。

结合抗原百分比随抗原浓度的降低而增加。随着抗原浓度的降低，对于任何给定浓度的抗体，结合抗原百分比趋向于更高的上限。在图2-1-20中可以更清楚地看到这种现象，其中抗体浓度范围从10-9到10-11（10/K_eq到0.1/K_eq），而抗原浓度连续变化。

对于任何给定的抗体浓度，增加抗原浓度仅在超过（抗原浓度）临界范围后改变结合抗原百分比。临界值以下的区域，结合比例恒定，抗原浓度的变化对总结合抗体百分比没有显著影响。临界值随着抗体浓度的降低而降低。对于竞争法而言，使用低浓度抗原时需要对应使用低浓度抗体，以保证添加未标记抗原与已结合标记抗原竞争时能产生可检测的信号，即处于临界点右侧。

图2-1-21显示了当抗体浓度为1×1010（1/K_eq）时，平衡常数对结合百分比的影响。高平衡常数下抗体结合位点的占据比率增加，因此随着未标记抗原的加入，信号响应的变化率提升。

对于一个给定的平衡常数，标记抗原和抗体浓度降低到何种程度能增加检测灵敏度，与低信号响应下的测量误差有关。随着这些误差降低，最佳结合百分比降低，最终非特异结合产生的误差会影响信号测量的精密度。因此，任何给定特异性和非特异性结合的组合都可以确定特定的标记抗原浓度和抗体浓度，以达到最大灵敏度。

通过一个例子可以很好地理解上述结论。假设反应体系的终体积为1ml，抗体平衡常数为1×1010L/mol，其中125I为标记物，计数时长1min，抗原通过1mol/mol 125I标记，比活度为8.02×1016/s（Bq/mol；假定计数器效率为100%）。图2-1-22由抗体和标记抗原浓度函数绘制，其预测了检测体系的灵敏度。对该检测体系而言，最大灵敏度为4.1×10-12mol/L。其一方面与测量不精密度有关，另一方面与质量反应有关。图2-1-23和图2-1-24显示了在平均非特异性结合水平附近5%变异系数的条件下，对应1%或者5%游离标记抗原非特异性结合的效果。降低标记抗原的浓度和增加抗体浓度可以提高特异性结合，并部分弥补非特异性结合增加的影响，从而获得最佳的灵敏度。即便是试剂浓度进行了调整，当非特异性结合为1%或5%时，检测灵敏度也会分别降低到4.3×10-12mol/L或5.8×10-12mol/L。

类似地，图2-1-25到图2-1-27显示了在标记抗原特异性更高（1×1023/s个信号事件，即每秒每6个分子中大约有1个可给出检测信号）的条件下，非特异性结合分别为0%、1%和5%的影响。

如前所述，试剂浓度的重新优化只能部分弥补非特异性结合增加造成的影响：当非特异性结合水平分别为0%、1%和5%时，对应的预测灵敏度分别为2.1×10-12、2.8×10-12和4.5×10-12mol/L。

表2-1-1总结了上述示例中的最优试剂浓度、结合百分比和信号检测误差。还显示了一个基于更“传统”检测设计的计算结果，其中标记抗原浓度基于可接受的125I标记信号响应［每分钟40 000次分裂（dpm）］进行选择，抗体浓度调整到50%百分比结合的水平（检测d）。同时，假定非特异性结合为5%。在文献和市售产品中可以找到许多类似检测方法设计的案例。

值得注意的是，在没有任何非特异性结合的情况下，标记抗原和抗体的最佳浓度比传统上认为的浓度要低得多。事实上，对于某种具备无限比活度的标记，抗体和标记抗原的最佳浓度趋于零，Jackson和Ekins（1983）从理论上证明了此情况下灵敏度为：

式中CV_e是实验误差。

在上述的例子中，在没有非特异性结合的条件下，最大灵敏度是2.06×10-12mol/L，与无限比活度模型下灵敏度预测值2.0×10-12mol/L相近。

如此低浓度的抗原和抗体对应的结合水平远低于正常水平（通常结合水平需要30%～60%），尤其是在非特异性结合水平可忽略不计的情况下。例如，在不存在非特异性结合（检测a）的情况下，预测的最佳结合百分比约为11%。

上述的例子可以用来阐释检测方法设计中的两个常见误区。其一是对剂量-响应曲线归一化表达式斜率的过度关注，而忽略了实际测量的结果，即信号响应本身。其二是未考虑剂量-响应关系中的误差。图2-1-28显示了检测c（优化）和检测d（未优化）的剂量-响应曲线，以熟悉的结合百分比的形式展示剂量-响应关系。

基于传统的检测方法设计理念，未优化的检测d剂量-响应曲线的初始斜率较大，因此可能被认为更敏感。而根据实际测量的数据重新绘制图形会得到相反的结论（图2-1-29）。

两种剂量-响应曲线如图2-1-30所示，归一化为结合/零浓度下的结合（B/B₀）形式，并在零剂量下预估出信号响应误差和灵敏度（优化测定条件下为5.8×10-12mol/L而未优化条件下为10.3×10-12mol/L）。

对于竞争法，信号测量误差和非特异性结合影响均不显著，影响灵敏度的主要因素来自实验残余误差和平衡常数。抗体的最大平衡常数约为1012L/mol，假设实验误差控制在CV为1%，如果标记物的比活度无限高，那么检测方法的试剂灵敏度上限为2×10-14mol/L（2×0.01/10-12mol/L）。图2-1-31显示了一系列抗体平衡常数下使用3H（1.07×1015Bq/mol）标记，125I（8.02×1016Bq/mol）标记，或其他非无限比活度的标记能达到的最佳灵敏度。

对于K_eq小于1010L/mol的抗体，标记方式从125I变为非同位素标记，对检测灵敏度而言几乎没有优势。然而，3H标记抗原（过去曾用于类固醇测定）的比活度要低的多。在这种情况下，选择125I或更高活性的非同位素进行标记将会获得显著优势。上述计算结果强调，对竞争法的优化需要重点关注非特异性结合和实验误差，而非检测试剂。

需要谨慎对待Ekins关于计算竞争法灵敏度的解释。这些内容经常被文献引用，但人们并未充分理解其推导过程中使用到的基本假设（Ekins，1991；Gosling，1990）。第一，应当注意，原始计算（Ekins等，1968，1970；Ekins和Newman，1970）针对零剂量时误差的1倍标准偏差，而非95%的置信区间（2倍标准偏差）。第二，这一理论假定没有非特定的结合。第三，灵敏度表现在测定反应中，而非样本中（虽然对样本而言更有实际意义）。第四，它假定实验误差控制在CV为1%内。计算还基于如下假设：标记和未标记抗原处于均相，反应存在单一平衡常数，以及反应保持平衡状态。在实践中，几乎没有免疫检测方法符合所有上述假设。

4.夹心法的设计

与竞争法设计一致，两种方式可应用于建立夹心法灵敏度预测和优化的理论模型。Ekins和他的同事们根据与竞争法相同的反应/误差之间的关系的概念，推导出了这些检测方法的剂量-响应关系和误差的统一模型（Jackson等，1983）。

统一的数学模型复杂，需要简化假设以得到代数解。另一种方法是上文介绍的用于竞争性检测的相关方法，其中误差需单独考虑，并用于估算与灵敏度相对应的剂量-响应曲线上的信号。然后将信号代入剂量-响应方程，可以确定相应的试剂剂量。在这个模型和Jackson 等人开发的模型中，使用基于两个结合反应相继发生的最简设计而进行计算，其假设如下：

● 第一个抗体连接到固相载体上，与抗原温育使两者结合反应达到平衡，然后清洗除去未反应的抗原。

● 将上述完成第一步结合的固相复合物与标记抗体温育并达到平衡，洗涤除去未结合的标记抗体并测定结合的标记抗体产生的信号。

在理想情况下，夹心法免疫检测在没有抗原的情况下就不会检测到信号。然而，实际上夹心法检测时仍会有背景信号产生，主要来自：

● 测量仪器本身，假定在给定的信号测量时间内信号值恒定。

● 由于标记抗体的非特异性吸附而产生的信号，假定为总标记抗体的一部分。

因此，在没有抗原的情况下，检测体系的总信号R₀可以表示为：

式中M是来自仪器的背景信号，单位为信号事件/s；T是信号测量时间，单位为s；NSB是第二轮温育中标记抗体的非特异性结合比例。例如0.01代表总标记抗体的1%的结合量；［Ab2_t］是第二轮温育中标记抗体的总浓度，单位为mol/L；S是标记抗体的比活度，单位为信号事件/mol/s；V是第二轮温育的体积，单位为L；此外，需要考虑变量中的误差。

假定信号符合泊松分布，信号的标准差（s.d._m）由累积信号的平方根得出。

分类错误会产生误差，因此实际非特异性结合的部分也会发生一些变化。假定这些满足正态分布，即：

式中s.d._nsb是分类错误产生误差的标准差；CV_nsb是由于移液和操作错误导致的错误分类造成的NSB的变异系数。

根据R_o的标准差，可以估计整体误差：

式中s.d._a是不存在抗原时信号的整体标准差；s.d._e是实验误差的标准差。

因此，在灵敏度极限（R_det）下信号水平的增加被定义为：

换言之，信号必须高于仪器背景和非特异性结合总和至少R_det，以提供抗原存在的可靠信号（95%置信区间）。

假设质量作用定律可以应用于固相免疫检测，已结合标记抗体的浓度［Ab2_b］（这一概念可能并不严谨）可以由灵敏度极限下的信号响应、比活度、反应体积和信号测量周期来计算：

从总抗体浓度中减去结合的标记抗体［Ab2_b］的浓度可以得到游离的标记抗体浓度［Ab2_f］：

重新排列式（2-1-2），可以根据平衡常数、结合抗体和游离抗体的浓度获得总抗原浓度：

代入：

式中［Ag2_t］是第二次温育中与固相结合的抗原的总浓度；K2_eq是标记抗体的平衡常数。

在检测的第一阶段，通过以上公式可以计算第一个结合反应中所需的抗原浓度，以计算出在第二次温育中灵敏度极限处的抗原浓度。第一个反应中结合抗原浓度［Ag1_b］与占据的捕获抗体结合位点的浓度［Ab1_b］相同，并且等于第二个反应中抗原的总浓度［Ag2_t］：

捕获抗体的总浓度减去结合的捕获抗体浓度可以获得第一次温育中未结合的捕获抗体浓度：

所以在使用式（2-1-52）之前，需要已知第一次温育中的抗原浓度，以获得先前在第二次温育计算中的抗原浓度。这与测定的灵敏度相对应：

式中［Ag1_t］是第一次温育中产生特异性信号R_det所需的总抗原浓度，即灵敏度。K1_eq是第一次温育中捕获抗体的平衡常数。

将典型数据代入上述公式，可以基于“假设（的数据）”建立模型，从而考察试剂成分和检测误差的影响。

夹心法分两个阶段进行，其反应体积通常为0.2ml，因此微量滴定板反应孔的体积也通常选择0.2ml。

假设捕获抗体和标记抗体的平衡常数都是1×1010L/mol，信号响应在1min之内检测，仪器的背景是每秒检测一个信号事件。同时，对此类检测而言，根据实际情况，假设非特异性结合占比为0.1%，而由于实验操作或错误分类造成平均水平附近的波动占5%。图2-1-32显示了基于检测抗体和捕获抗体浓度的方程计算得到的灵敏度，其中检测抗体用1mol /mol 125I标记（比活度8.02×1016Bq）。

夹心法免疫检测有两个主要特征。首先，最高的灵敏度对应于标记抗体的最适浓度。抗体浓度过高时，非特异性结合增加的程度高于特异性结合增加的程度，即信噪比（signal-to-noise ratio）降低。与此相反，低浓度的标记抗体对应的信号测量和质量作用因素都会增大误差，限制反应的灵敏度。其次，反应灵敏度取决于标记抗体浓度而非捕获抗体浓度，所以在上述假设中捕获抗体浓度大于1×10-9mol/L时几乎不会影响灵敏度。对于上述测定条件，最适标记抗体浓度为1.24×10-10mol/L时，最高灵敏度趋近于5.5×10-14mol/L，比灵敏度极限的抗原浓度高2 000倍。为简单起见，在随后的实验中假定捕获抗体的浓度为1×10-6mol/L，该浓度下捕获抗体足以在第一次温育过程中结合几乎全部的抗原。Jackson等（Jackson等，1983；Jackson和Ekins，1983）做出了类似的假设，以简化统一的剂量-响应/误差关系模型。

下面依次分析能够影响灵敏度的限制因素。图2-1-33显示了达到最高灵敏度时，标记抗体的平衡常数对所需标记抗体浓度的影响。

对于任何给定的标记抗体浓度，增加平衡常数会增加剂量-响应曲线的初始斜率，因此灵敏度也随之增加。

当K_eq从1×1012L/mol降至1×108L/mol时，最适标记抗体浓度从1.1×10-11mol/L增加到1.3×10-9mol/L，伴随着相应灵敏度从1.9×10-14mol/L降低到1.3×10-12mol/L。

对竞争法的理论分析表明，增加标记试剂的比活度对提高检测灵敏度具有一定局限性，特别是在平衡常数低于1×1010L /mol的情况下更加明显。对于夹心法来说情况相反（图2-1-34），当比活性从1016增加到1021，夹心法的灵敏度从大约2.2×10-13增加到1.0×10-14。可见，夹心法中标记抗体的最适浓度随着比活性的增加而降低。

图2-1-35显示使用125I标记抗体，将非特异性结合水平从1%改变至0.000 01%时的情况。可见，夹心法标记抗体的最适浓度随非特异性结合的降低而增加。

Jackson和Ekins证明（Jackson和Ekins，1983）在没有信号测量误差（无限比活度）的情况下，夹心法的灵敏度极限可用以下关系来描述：

式中K₃是非特异性结合分数（上文使用的术语NSB表示）；CV_nsb是零抗原浓度下反应的相对误差；K₂是标记抗体的平衡常数。

例如，给定抗体亲和力为1×1012L/mol，非特异性结合为0.1%和信号响应的误差为1%，代入方程可计算最高灵敏度约为2×10-17mol/L，比具有同等条件下竞争法的最高灵敏度高3个数量级。

图2-1-36（a）和图2-1-36（b）总结了夹心法设计中涉及决定灵敏度中的各种影响因素，与竞争法的呈现形式类似。图2-1-36（a）显示了使用125I标记抗体，在最大结合量为1mol/mol时，不同平衡常数下非特异性结合水平与灵敏度的关系。图2-1-36（b）展示了是在1×1023信号事件/（mol·s）比活度时，不同非特异性结合水平下标记抗体平衡常数与灵敏度的关系。

与竞争法不同，夹心法中使用比125I活性更高的检测系统，特别是与高亲和力抗体同时使用时，具有明显优势。因此为寻找更灵敏的标记和检测系统提供了主要的动力。

5.理论模型的适用性

抗体-抗原反应的热力学理论模型可以用于确定合适的反应条件和试剂浓度以达到最高灵敏度，但这些模型依赖于相关反应遵循一阶质量作用定律的假设，以及关于误差来源和强度的其他假设。因此，尽管可以将通过理论计算得到的试剂浓度作为起始浓度，但任何免疫测定技术的最终优化结果都必须通过实验来确定。

理论建模的主要成功之处在于确定了在每种检测设计类型中影响灵敏度的关键因素，并因此重点聚焦于最有利于提升灵敏度的组分和测定过程优化中。深入理解相关原理可以推动新型检测设计的开发和发展，如Ekins（1991）提出的环境温度分析物免疫测定（ambient analyte immunoassay）（参照“环境温度分析物免疫测定”，该部分未译，有兴趣的读者可参考原书——译者注）概念，该方法通过在“微量测定盘”上使用小体积、离散抗体点来同时测定多种分析物，实现对环境浓度下分析物的采样和分析。

另一方面，理论建模可以作为培训和教育的手段。希望本节中给出的方程和模型足够详细，以便用于演示免疫检测设计的一些基本原理。许多公式的推导更加巧妙但相对复杂。选用相对简单的公式有两方面原因：第一是为了让读者更容易理解推导逻辑和数学处理过程，第二是相比于复杂方程，简单的公式更容易正确地放置于电子表格中。通过构建简单的模型，读者对不同组分的浓度和抗体亲和力的影响可以进行“假设”性测试，并且很容易得到结果，如绘制剂量-响应曲线。以本人（译者注：原章节作者Chris Davies）的经验来看，这种用电子表格模型进行的训练或实验具有很高价值，它们可以补充并强化免疫检测方法优化的理论，此外也可以有效应用于实际方法设计中。

通过上述模型可以计算出没有未标记抗原时信号响应的误差，并由此得出零剂量时的精密度。在上述方程中简单地添加一个未标记的抗原项，便可在剂量-响应曲线上预测不同点的误差，由此可以分析检测方法在整个抗原浓度范围内的理论精密度情况（Ekins，1983；Jackson et al.，1983）。

（五）抗体的定性检测和定量分析

以上大部分讨论都集中在使用抗体来测量抗原。抗原分析基于抗体是否与抗原相连，抗体分析同样如此，只是描述变为抗原是否与抗体相连，因此免疫检测法也可以用来分析抗体。抗原检测设计时相应的热力学和统计学概念同样可以应用于抗体检测的设计中。然而，在抗体检测设计和结果解释方面仍有一些重要事项值得关注。

● 与抗原检测不同的是，抗体检测评估的并非抗体浓度，而是抗体活性，即功能结合位点的浓度及其亲和力的组合。从临床角度来看，生物活性可能比质量浓度更重要。不同的抗体检测设计中，亲和力和浓度对方法性能贡献不一致，增加了结果解释的难度。例如，使用夹心法设计时，可以添加足量的抗原来结合大部分抗体。在这种情况下，剂量-响应更多地反映抗体的浓度而非亲和力。与之相反，竞争法中结合的程度更多的受到抗体亲和力的影响。因此，对同一样本使用不同设计类型的方法进行分析时，即使每个检测方法都采取相同的国际参考制剂进行标准化，也很少能得到相同的定量结果。

● 在表位识别和亲和力方面，循环抗体具有高度的异质性。与细菌或病毒的裂解物相比，使用纯化或重组的抗原进行测定通常会得到不同的定量结果，偶尔也会有不同的定性结论。此类检测结果并没有很好地与基于整体裂解物的临床资料进行关联，因此其检测特异性的增加是否无用，或者临床解释是否应该为了此类检测提供的微特异性而改变，均存在争议。对于诊断检测产品的制造商来说，有时改变测定方法以反映既定的结论比试图改变（有可能改善）临床解释更容易。

● 一定比例的循环抗体，特别是在感染的急性期，可能已经与抗原结合。因此，另一个需要考虑的因素是抗体的预饱和程度。

● 交叉反应性可能是检测特定同型抗体的一个主要问题。特别是在过敏测试中，IgG可能干扰IgE的结合。

常规抗体检测使用如下设计方式。

1.液相检测

液相检测（liquid-phase assays）是最早应用于抗体活性测量的定量检测形式，它与液相竞争法测定类似。标记抗原与稀释后的患者血清抗体结合，由此产生的免疫复合物或总抗体通过物理或免疫技术沉淀。然后，测定沉淀复合物的信号。在早期的检测中，沉淀复合物通过放射性信号进行检测。与竞争法不同，抗体液相检测的剂量-响应曲线随抗体活性的增加而升高。

液相检测方法现在很少使用，绝大多数免疫检测方法通过某些种类的固相载体对结合和游离抗体进行分离，而后进行分析。

2.固相免疫测定

抗体固相免疫检测通常包含四种主要类型。第一种是在竞争法抗体检测中，样本中的抗体与标记抗体竞争性结合吸附在固相上的抗原。与竞争法抗原检测类似，这种方法的剂量-响应曲线会随着样本中抗体活性的增加而下降（图2-1-37）。

这类检测方法的一个主要缺点是需要保持固相表面抗原数量均匀，但某些抗原与固相的组合可能难以实现。针对这一问题，人们通常选择中间体将抗原和固相进行连接。这种技术通常选择特异性抗体包被在固相表面，并通过抗体作为桥连分子识别抗原的非关键表位，从而将抗原均匀固定在固相载体上。该方法可以对纯度有限的抗原进行有效纯化。此外，还可以通过生物素化抗原和链霉亲和素包被的反应板进行桥连。此时，该方法只需要一种被包被的固相载体，而且生物素化抗原可以在温育开始时添加而不需要预包被。

第二种设计基于夹心法，即捕获桥接法（capture bridge assay），可以利用抗体的多价特性来进行检测。该方法利用样本中的抗体将固相表面包被的抗原与溶液中标记的抗原连接起来（图2-1-38），从而进行检测。

在同步温育的情况下，过多的抗体会掩盖固相抗原和标记抗原的表位，并影响两者之间的连接，即高剂量钩状效应（high-dose hook effects）（参见第四部分第三节“免疫检测中的干扰”）。在连续温育的情况下，微量的抗体浓度可能与固相抗原发生双价结合，因此结果可能被低估。

与抗原检测类似，这两种检测方法的灵敏度是由抗体亲和力决定的。如果抗体亲和力较低（常见情况），那么只有很少量的抗体会与固相结合。如果用新的固相重新测定这种方法的上清液，难以确定新情况下信号更高或更低，即其摄取量太小，无法与样本中所含的样本量比较。因此，这些技术虽然确实在简易性和通量方面有一定优势，但可能不具有应用所需的灵敏度。此外，这些设计都不是同种型特异的。

第三种是最常用的夹心法抗体检测形式，首先将样本抗体与包被在固相上的抗原结合，洗涤去除未反应的组分，然后在第二次温育时用同型特异性的标记二抗检测被结合的抗体。如果将固相抗原作为捕获试剂（图2-1-39），这种设计可类比为抗原的双位点夹心法（ELISA）。

当免疫球蛋白的某种亚型活性占主导地位时，可能会抵消或增强其他亚型的活性，如在过敏检测中IgE是占主导地位的亚型。通常，过敏的患者对相同抗原会产生IgG抗体。IgG的数量可能远高于IgE，并且伴随着亲和力成熟的过程，IgG对抗原亲和力通常比IgE更高。当试图区分急性感染（检测IgM）和既往感染（检测IgG）时，也需要考虑类似的因素。

第四种设计为捕获法（class-capture assay），可以满足同型特异性的要求（即使存在大量的具有交叉反应活性的同型抗体）。在捕获法中，包被在固相上的同型特异性抗体首先捕获目标的抗体类型。清洗后，通常采用两种方法进行检测，即直接法和间接法。在直接法中，加入标记抗原进行定量测定结合抗体。在间接法中，加入未标记抗原，然后用特异性标记抗体检测对应抗原。后一种方法更为复杂，但具备一定程度的免疫纯化，这对于抗原纯度不足情况尤为重要（图2-1-40和图2-1-41）。

与抗原夹心法免疫检测类似，抗体夹心法检测的灵敏度主要受抗体亲和力和非特异性结合量的影响。然而，在抗体检测中，决定灵敏度的主要因素之一是固相表面功能表位的密度。

统一的热力学和统计学模型对抗原免疫检测设计有很大的帮助，而在抗体免疫检测领域的应用却很少得到重视。抗体免疫检测的设计通常以经验判断和实验优化相结合。这是因为抗体检测中还需要考虑下列更加实际的因素：

● 临床需求，即该检测方法主要用于定性检出还是定量测量抑或是监测浓度变化。

● 抗原的可用性、纯度、稳定性和批间差。

● 抗原是否能直接标记，而不影响抗原关键表位。

● 抗原直接或间接与固相结合的难易程度，以及结合时是否会影响抗原表位的呈现。

有关抗体免疫检测方法的深入介绍，请参阅本部分第六节“传染病相关抗体的检测”相关内容。

（六）固相免疫检测的考量要点

固相免疫检测法的普遍使用引入额外的复杂性，尤其是在理解抗原-抗体相互作用的热力学方面。固相分析与液相分析在两个方面存在差异，一是抗原或抗体包被在固相表面时的反应性；二是液相反应和固相反应的动力学差异。

1.表面固定化的影响

在抗原与抗体吸附或偶联的过程中，固相不应被视为被动组分。虽然蛋白质可能与固相进行化学偶联，但许多固相免疫检测仍依赖于非共价吸附。尽管人们对吸附过程不甚了解，但几乎可以确定固相吸附主要由疏水作用驱动。考虑到天然状态下，大多数亲水基团趋向位于蛋白质的外部，疏水基团趋向位于蛋白质的内部，因此疏水基团结合到聚合物表面时会不可避免的导致吸附蛋白质的构象发生改变。这种现象可能是有益的。在吸附前将抗体短暂地暴露于低pH甘氨酸缓冲液中，会使抗体的疏水性增加，增强其在聚合物表面的吸附率。

抗原在固相表面包被时可能会因为吸附过程构象变化（空间结构隐藏）或者关键表位偏疏水（关键表位吸附在固相表面），而导致关键表位的丢失。构象的变化也有可能会暴露之前被隐藏的表位。微观上，聚合物表面并不像图片中呈现的那样光滑，空间的限制可能在确定反应动力学时起主要作用。

抗体也会产生构象变化，这不仅影响活性结合位点的数量，还影响其对抗原的亲和力。在溶液中与抗原结合良好，但固定化后与抗原结合变差的抗体并不罕见；单克隆抗体比多克隆抗体更易受到影响，这可能由于后者中抗体多样性更高所造成。

2.动力学上的约束

免疫检测设计理论模型中，通过多种假设保持质量作用定律的简化。大多数假设对液相免疫检测的影响并不大；相比之下，许多假设对于固相免疫检测不适用，如浓度的概念。所以对于固相免疫检测而言，需要应用新的约束条件，并提出不同的假设。

对于多数固相检测来说扩散是一个限制因素。结合速率常数取决于周围介质的黏度和对于反应物（大小相同且具有一致反应性）而言的最小几何因子。扩散不受抗体结合位点与抗原表位之间结合强度的影响。当反应物大小不同时，结合速率常数会增加；对于结合位点数量有限的反应物，结合速率常数会降低。没有持续混匀时，扩散仅受分子大小及溶液黏度的影响，抗体与半抗原分子之间的结合速率常数通常为1×109/（mol·s）数量级（Stenberg和Nygren，1988）。大多数结合速率常数小于这一数值。Stenberg和Nygren提出在方程式中引入附加项，即黏附系数（sticking coefficient），以此来反映抗原和抗体仅在两者取向正确时才能够结合。当其中一个组分与固相结合时，黏附系数可能会彻底变化，使得结合速率常数显著降低。

固相边界层（boundary layer）会抑制正向反应速率，从而限制达到平衡的时间。在固相表面，抗原会被结合的抗体快速消耗，而抗原的补充受扩散的限制。因此需要在本体溶液、边界层和固相结合抗原之间形成近似的稳态（图2-1-42）。

在边界层中，抗体的局部浓度非常高。因此，固相解离动力学与在游离溶液中建立的解离动力学可能完全不同。已有研究表明，固相表面吸附抗体上的结合反应基本上是不可逆的。这并不意味着平衡常数本身增加；相反，它反映了解离的抗原从局部高浓度抗体“逃逸”的概率低。

另一个有趣的效应与抗体分子吸附到固相时的空间取向有关。通常，人们认为固相表面是均匀的，因此结合的抗体也会均匀地随机分布在固相表面。然而事实并不完全如此，有证据表明抗体可能形成分形簇（fractal clusters），即固相表面形成高度有序的抗体“岛”，这个过程类似于晶体结构形成和生长的过程（图2-1-43）。

在物理化学领域，新近发展的异相分形动力学理论（theories of heterogeneous fractal kinetics）在展示固相表面的复杂反应动力学方面发挥了重要作用，并发现了一些非常规现象，如基本双分子反应的分形排列、反应物的自排序和自离析、双分子速率系数的时间依赖性等（Kopelman，1988）。同样的复杂的动力学在固相免疫检测中也可能起作用。抗体分形簇的紧密排列性质可能导致明显的正协同效应：的确有证据表明固相免疫分析中的结合速率常数是可变的（Werthen等，1990）。抗体簇极高浓度的抗体可以有效地防止解离的抗原离开局部环境。因此，观察到的分形簇中的抗原解离速率常数将远低于游离在溶液中的解离速率常数，这在一定程度上解释了固相吸附抗体与抗原的结合所表现出基本不可逆的现象。

（七）实验和理论免疫检测性能的比较

免疫检测相关文献中一个主要的问题是，比较各种检测设计类型的性能特征，尤其是评估灵敏度时，缺乏标准化的术语和实践。体积、温育时间、重复次数、信号检测的整合时间等区别都可能导致同一检测中宣称灵敏度的显著差异。因此，很难基于文字报道对不同检测方法进行比较。

然而，确定理论预测是否可以定量地转化到实践中十分重要。如果理论和实践有本质的区别，那么理论的基本假设很可能是错误的。如果理论和实践存在定量差异，那么可以对理论模型进行数值优化。

对于如下条件：平衡常数为109～1011L/mol的抗体、比活度高标记抗原、1%实验误差，理论模型［式（2-1-44）］预测其灵敏度范围为0.2～20pmol/L。Gosling（1990）回顾了一些最灵敏的类固醇检测方法。这些方法全部使用125I或过氧化物酶进行标记，而最灵敏的方法采用固相结合抗体，其非特异性结合的误差可以最小化。这些检测方法宣称的灵敏度范围为4～9pmol/L，处于在理论预测的范围内。

在竞争法设计中，理论与实践之间在一定程度上保持一致。这可能由于使用固相和非同位素检测系统，一方面在于它们具有低检测误差和低非特异性结合的内在优势，另一方面在于它们对更“传统”的分析优化方法的限制。许多种竞争性放射免疫检测法，由于传统原因以及客户对诊断公司的期望和要求，可以达到30%～50%的零剂量结合率和高信号。对固相、非同位素检测中的结合百分比难以估计：它们对研发专家和客户都是未知的。摆脱了这些心理上的约束，检测方法的优化可以专注于其他方面，比如误差最小化，这正是Ekins在理论基础上提倡的路线。

夹心法免疫检测的最高灵敏度主要由实验误差决定，而实验误差又会有一定程度的变化，因此其无法估计。目前从已发表的文献中很难获得关于误差的详细细节，以估计实际灵敏度与理论灵敏度的一致性。然而，对于常见的抗体，可以假设非特异性结合最低为0.1%，非特异性结合中的误差最低为1%，并且使用无限高比活性的标记物，那么检测方法的最高灵敏度为0.20～20fmol/L，抗体亲和力范围为109～1011L/mol［来自式（2-1-56）］。应用该理论开发超敏免疫检测的示例请参见“数字ELISA测定单个蛋白质分子”一节。

精确测定极低浓度的TSH具有重要的临床意义。因此，如此多的关注都集中在提高TSH检测的灵敏度上就不足为奇了。Thonnart（Thonnart et al.，1988）和McConway（McConway et al.，1989）等回顾了14种市售高灵敏TSH检测方法的性能：各TSH检测方法宣称的灵敏度为0.005～0.1mIU/L，其中最灵敏的是非同位素分析方法。人类TSH的活性为5IU/mg，相对分子质量为28 000Da，因此上述灵敏度范围可转换为35～714fmol/L。Cook和Self（1993）介绍了一种使用酶放大和荧光检测技术的胰岛素原检测方法，灵敏度为17fmol/L。假设非特异性结合率为0.1%，报道的灵敏度可能处于理论预测值的数量级之内。Rissin和Walt（2006）以及Rissin等（2010）最近证实，数字ELISA免疫检测的灵敏度能够达到阿摩尔（attomole）级别，（参见第二部分第十节“数字ELISA方法测定单个蛋白质分子”）。

目前已经开发出极其灵敏的检测系统，所以为了获得更高密度的活性抗体和更低的非特异性结合率，了解和优化这些系统的表面化学结构可能大有益处。此外，更复杂的理论模型，尤其是考虑到固相反应动力学和液相反应动力学之间差异的模型，可以使人们更好地理解固相界面动力学的基本性质，并可能有助于设计更加灵敏的检测形式。

三、参考文献

四、进一步阅读

（黄晶、杨广民　译，何建文　审）