二、CD4+和CD8+T淋巴细胞检测实验室要求

1.人员

实验室人员应接受与工作相关的技术培训。实验室工作人员应经过HIV检测技术和省级以上艾滋病检测实验室安全培训、淋巴细胞检测上岗培训，并接受实验室生物安全责任人和实验室管理人员的监督。所有实验室工作人员都有责任保护自己和他人的安全。

2.功能分区

理想情况下淋巴细胞检测应该有专用的实验室，空间有限可与HIV初筛和确证实验室共用。

实验室原则上应分为样本准备区和样本检测区。样本准备区应符合生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样本制备。样本检测区用于制备好的样本在流式细胞仪上检测、分析和报告。

3.样本采集处理要求

（1）样本采集、运输和接收：

参照本章第二节的样本采集与处理。

（2）样本处理：

样本的处理应遵循有关标准操作程序（SOP），处理时注意一般要求样本在48h内染色，染色后6h内分析。如采血后24h内染色，则可在染色后24h内分析。如果利用CD45单克隆抗体和侧向光设淋巴细胞门，可检测放置72h的样本。处理后若不能即刻检测，应将染色样本储存于4～10℃冰箱。已经加入荧光微球的样本应在6h内上机检测。如不能按时上机检测，荧光微球须在检测前加入。

4.CD4+和CD8+T淋巴细胞检测方法和程序

CD4+和CD8+T 淋巴细胞计数的方法目前分为两大类，分别为应用流式细胞仪测定法和非流式细胞仪测定法。常用的检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪（主要分为双平台法和单平台法）和专门的细胞计数仪。

（1）流式细胞仪检测方法

1）双平台方法：

是一种对细胞群体的绝对计数方法。该方法需要两种仪器，利用血细胞分析仪检测淋巴细胞总数，再根据流式细胞仪测得的各细胞群体百分比，计算每微升各细胞群体的淋巴细胞数。由于仪器有系统误差，计算结果的重复性和准确性影响因素较多，对结果的影响较大。用这种方法进行CD4+和CD8+ T 淋巴细胞计数时，室间差异很大。该方法最大的缺点在于操作复杂，操作人员相对多、费时，很难将变异水平降到最低。

2）单平台方法：

相对于双平台法而言，即应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球，直接通过流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件，一步获得T细胞亚群的相对数（百分比）和绝对数。该方法最大限度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，淋巴细胞绝对计数结果的准确性和重复性都得到了保证。

（2）非流式细胞仪测定法

1）Cyto-Spheres：

该方法的原理是人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，红细胞可以黏附到T淋巴细胞的周围形成玫瑰花样细胞团。CD4+计数试剂盒中包含CD4+微球试剂，该CD4+微球试剂为包被有单克隆抗体的惰性乳胶微球，可以通过光学显微镜鉴别并手工计数新鲜全血中CD4+T 淋巴细胞的绝对数。

2）Dynabeads：

方法使用包被CD4+和CD8+抗体的Dynabeads磁珠，从全血样本中捕获分离CD4+和CD8+T 淋巴细胞；用另一种CD14 微球用来阻隔单核细胞。用胎盘蓝和龙胆紫染色分离CD4+T 淋巴细胞，在自动细胞计数仪或光学显微镜下计数。

3）荧光免疫成像技术：

用不同荧光染料标记的CD3+和CD4+等抗体与血液中相应的受体结合，通过软件及成像系统，仪器自动分析并计数样本中的CD4+T 淋巴细胞绝对值。

5.实验资料的记录

（1）对实验活动进行及时、准确地记录。

（2）实验记录主要包括以下内容：操作者、审核者、有无不合格样本、实验内容、过程（步骤）、结果及有无事故、室内质控情况等。

（3）所有实验资料应统一由专人负责，按固定格式记录在案。

（4）计算机生成的实验结果，存档备案；定期将计算机结果文档备份并备案保存。

6.结果报告

（1）双平台法：用淋巴细胞总数（数据来源于血细胞分析仪WBC检测及分类）乘以淋巴细胞亚群百分率（数据来源于流式细胞仪检测数据），计算绝对数值。

（2）单平台法：由流式细胞仪及计算机软件直接出结果，报告单内容包括CD45+ Abs Cnt、CD3+ Abs Cnt、CD3+CD4+%T Lym、CD45+CD4+ Abs Cnt、CD3+CD8+%TLym、CD3+CD8+ Abs Cnt、Th/Ts 及其正常参考值范围。

（3）报告单经检测者和审核者以及复核者签字，报告应在检测后及时发出。

7.质量控制

（1）CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的质量控制包括室内质量控制和外部质量控制。

（2）室内质控包括仪器质控和过程质控。

1）仪器质控是应用仪器生产厂家的质控品对仪器进行校准，每次开机先进行质控品检测，质控品通过测试后再进行样本检测。

2）过程质控主要包括试剂质控、样本质控和数据质控。

试剂质控：所用试剂应在有效期内等。

样本质控：包括正确的样本采集、运输、接收、保存、处理、分析方法以及室内质控的应用。通过每日绘制质控图对实验的质量进行监测，帮助分析和判断样本处理、仪器的准备和分析是否均处于最佳状态。

数据质控：包括正确的数据分析、结果报告、数据储存及对数据的可靠性分析。

（3）外部质控：进行外部质控的目的是提高实验室之间CD4+T 淋巴细胞检测结果的可比性，确保实验室之间检测结果具有良好一致性。国家艾滋病参比实验室负责制订和发展外部质控相关技术标准，并负责组织检验能力验证（PT）计划的实施。