二、自组装多肽水凝胶材料的种类

1.离子互补类自组装多肽（ionic-complementary self-assembling peptides）

根据电荷分布，离子互补类自组装多肽可以分为以下四类：Ⅰ类（-+-+-+-+），如 RADA16-Ⅰ（Ac-RADARADARADARADA-CONH₂）；Ⅱ类（--++--++），如 RADA16-Ⅱ（Ac-RARADADARARADADA-CONH₂）；Ⅲ类（---+++）和Ⅳ类（----++++）。

RADA16-Ⅰ和 RADA16-Ⅱ是用精氨酸（arginine，R）和天门冬氨酸（aspartic acid，D）替代 EAKA16中的赖氨酸和谷氨酸而得。在水溶液中，丙氨酸之间形成疏水相互作用，而带正电荷的精氨酸和带负电荷的天门冬氨酸通过分子间的静电离子作用结合在一起。它们自组装形成直径约10nm的纳米纤维，纳米纤维相互交织形成支架，支架孔径在5～200nm，含水量在99%以上（1～10mg/ml，w/v）。 RADA16-Ⅰ可以促进细胞增殖和组织再生，已经商业化应用于科研，商品名PuraMatrix^TM。RADA16-Ⅰ水凝胶的存储模量只有 5Pa，比 Matrigel（80Pa）、胶原和纤维蛋白水凝胶（385～510Pa）更加柔软。支架形成及其机械性能受以下4个因素影响：①氨基酸序列；②疏水性；③多肽链的长度；④自组装时间。疏水残基（丙氨酸A、缬氨酸V、异亮氨酸I、亮氨酸L、酪氨酸Y、苯丙氨酸F和色氨酸W）的含量与自组装的速度和支架的机械性能关系密切。一般，疏水成分含量越高，支架越易形成，机械性能也越强（图11-1）。

图11-1　多肽分子模型和自组装多肽纳米纤维支架示意图

RADA16-Ⅰβ-折叠的一侧为疏水的丙氨酸，另一侧分布着交替排列的带正电荷精氨酸和负电荷的天门冬氨酸。PRG和KLT中的功能域在纳米纤维主架外侧。AFM和SEM图显示了自组装多肽典型的纳米纤维结构。 （译自 Xi Liu，et al，Nanoscale，2012）

MAX1（VKVKVKVK-VDPPT-KVKVKVKV-CONH₂）和 MAX8（VKVKVK VK-VDPPT-KVEVKVEV-CONH₂）是由Darrin J.Pochan、Joel P.Schneider及其合作者们开发。MAX1不会引起人红细胞溶血，NIH 3T3细胞可以在支架上黏附。但是，由于MAX1凝胶过慢，它并不适合包埋细胞，而MAX8可以均匀地包埋细胞。在体外，MAX1和MAX8均不激活巨噬细胞。这类多肽可以剪切变稀，通过施加剪切力，凝胶可以变为流动的液体，去除剪切力后，材料恢复到凝胶状态。

Amalia Aggeli开发了一系列P₁₁自组装多肽，它由11个氨基酸组成，典型组分是几个谷氨酰胺残基Q和交替排列的极性和芳香氨基酸残基。其中，比较出名的是 P₁₁-2（Ac-QQRFQWQFEQQCONH₂），早期报道也称之为DN1。P₁₁-2采取β-股构型，可以自组装成高度有序的β-折叠带和纤维等。通过在关键位置引入突变，P₁₁-2具有了对pH敏感的性能。P₁₁-3，其与P₁₁-2的区别是将第9个氨基酸E换成Q，它可以作为二氧化硅纳米管的纤维模板。P₁₁-4（Ac-QQRFEWEFEQQ-CONH₂）表面上4个谷氨酸残基组成负电荷簇，成为了Ca²⁺的潜在结合位点。大量实验证明，P₁₁-4可以对早期龋齿进行再矿化，相关产品（Curodont^TM Repair）正在临床试验中。更重要的是，P₁₁-4可以通过大肠埃希菌合成，这种方法比固相合成更经济适用。研究还发现P₁₁多肽对鼠细胞是无毒性的，且在鼠内不引起任何免疫反应。P₁₁多肽在注射前是液态的，注射到目标位置后会自发自组装形成水凝胶。

2.补偿共自组装类多肽（complementary coassembling peptide）

上面提到的自组装多肽需要改变pH才能形成水凝胶，这个过程会刺激细胞。研究者们开发了补偿共自组装类多肽水凝胶，即两个带相反电荷的多肽序列，利用两者之间的吸引和排斥作用形成水凝胶，避免了pH改变。典型例子如带正电荷的Ac-LKLKLKLKLKLK-CONH₂和带负电荷的Ac-LDLDLDLDLDLD-CONH₂。多肽序列之间的自我排斥性能阻止了不可控的自发组装，而两个链之间的静电相互作用又驱使它们可以共自组装形成纳米纤维的结构。

对于RADA类和补偿共自组装类多肽，其形成的纳米纤维进一步组装成3D结构。根据多肽的浓度和聚集成的纳米结构，其含水量在95%～99%，水凝胶的孔径在5～200nm。

3.两亲类自组装多肽（peptide amphiphiles, PA）

PA包含了一大类分子，作为一种新型材料，这类分子在再生医学领域也显示了强大的潜力。Samuel I.Stupp实验室开发了一系列PA，PA通常由四部分组成：①疏水区，多是烷基长链，软脂酸是最常用的一种烷基长链，是含16个碳原子的饱和脂肪酸，它存在于天然植物油和蛋白质中；②β-折叠区，也叫短肽序列区，用于调节PA的机械性能和凝胶性能，同时，β-折叠区也影响着纳米结构形貌，纳米结构可以是圆柱、螺旋条以及更大的纳米带；③带电荷氨基酸区，通常包含1～3个带电荷的氨基酸，目的是增加水溶解性和调节凝胶性能；④生物活性区，这个区域在结构上来说不是必须的，通常包含一个生物活性的信号表位，分布在纳米纤维的表面，如层粘连蛋白的IKVAV片段（图11-2）。

水介质中，PA在烷基尾巴之间的疏水作用和β-折叠区的氢键作用的驱使下完成自组装。典型的PA组装的纤维，宽约6～12nm，最大可达几微米。改变溶液pH或加入盐会屏蔽带电氨基酸的电荷，引起PA凝胶化，这个过程甚至在PA质量分数小于1%时也可以发生。PA水凝胶的机械强度可以通过调整三个结构域而改变，典型存储模量位于10kPa级别。高度水化的PA纳米纤维水凝胶表面上具有高密度的表位，使其成为细胞培养和组织工程的理想基质。

4.其他类多肽

除了上面提到的，还有通过其他非共价键作用形成的多肽。二苯胺多肽利用氢键和芳香基的π-π键，形成长度100μm的管状纳米结构。其他可形成管状结构的多肽还有环多肽等。

图11-2　两亲类自组装多肽（PA）

A.PA的典型结构，其含有4个部分：疏水尾巴区域、β-折叠区域、带电荷区域和活性区域。B.含IKVAV活性域的PA的分子示意图，白色代表疏水尾巴，红色代表β-折叠区域，绿色代表带电荷氨基酸区域，黄色代表活性区域。C.含IKVAV 活性域的PA水凝胶的SEM图。（译自Linlin Sun，et al，Int J Nanomed，2017）