一、材料表面官能团对细胞行为的影响

生物材料及组织再生领域近年来的研究表明，材料表面特征官能团不仅能够显著影响材料自身的化学反应特性，亦能对细胞的黏附和分化等行为产生显著影响。关于不同化学成分基底材料（如不同类型的胶原蛋白、不同类型的聚合物等）对细胞行为和功能的影响也存在大量的研究报道，由于未明确到单独的官能团层面，故在此不作详述。

随着自组装材料技术的发展，Curran和Hunt等在2005年利用不同硅烷试剂的自组装技术在洁净的玻片表面构建了一系列不同化学官能团的单分子层表面。所使用硅烷化试剂的不同之处在于端部带有不同的化学官能团，中间的碳链长度相当；官能团种类包括—CH₃、—NH₂、—SH、—OH和—COOH。当他们将人的骨髓基质干细胞（human bone marrow derived mesenchymal stem cell）接种到上述表面，并在基础培养液中经过1周左右的培养后，对比发现—NH₂上的细胞数量最多且该表面上细胞mRNA的表达状况（Ⅱ型胶原蛋白降低、CBFA1升高）提示其可能利于成骨分化；—COOH上的细胞呈现出与—NH₂上不同的形态且Ⅱ型胶原蛋白的表达量提升，提示—COOH表面可能利于干细胞的成软骨分化。为了获得更为准确而深入认识，Curran和Hunt等后续还对不同官能团表面的干细胞进行了长达4周左右的培养观察。培养环境不仅包括基础培养液，还包含了成软骨诱导液和成骨诱导液。不同官能团组间的综合研究结果对比表明：未经接枝处理的玻片（对照组）和—CH₃表面较利于干细胞的表型维持；—NH₂和—SH表面不管是在基础培养液还是诱导液中均更利于成骨分化，不利于成软骨分化；而—OH和—COOH表面则更利于成软骨分化，不利于成骨分化。可见，材料表面的化学官能团能够显著影响细胞黏附和分化等行为。

除上述二维（2D）表面的研究结果外，Benoit和Anseth等通过利用带不同官能团的丙烯酸单体结合聚乙二醇大单体[poly（ethylene glycol）dimethacrylate，PEG-DA]，成功构建了含不同小分子官能团的三维（3D）水凝胶体系并进一步研究了3D环境中的化学官能团对人骨髓基质干细胞功能的影响。该研究使用的丙烯酸单体包括3-氨基丙基甲基丙烯酸酯（3-aminopropyl methylacrylate，带—NH₂）、叔丁基甲基丙烯酸酯（t-butyl methacrylate，带叔丁基结构）、甲基丙烯酸磷酸乙二醇酯（ethylene glycol methacrylate phosphate，带—H₂PO₄）、3，3，4，4-四氟丁基甲基丙烯酸酯（3，3，4，4-tetrafluorobutyl methacrylate，带氟碳结构）和甲基丙烯酸（methacrylic acid，带—COOH）。上述聚乙二醇大单体及各类丙烯酸单体的分子结构式见图2-2。为保证不同水凝胶体系维持相对一致的物理性能，各组水凝胶的合成中混入的相应丙烯酸单体（带相应特征官能团）含量均较低。其研究结果表明，虽然包裹在不同凝胶内部的干细胞具有类似的细胞形态，但在基础培养液中培养3周左右后，干细胞却表现出了显著不同的成骨和成脂分化潜能：例如在带—H₂PO₄基团的水凝胶内部，干细胞较利于成骨基因的表达，而在带—CH₃基团水凝胶内部的干细胞则更利于成脂基因的表达。可见，3D环境内部的特征官能团亦能对细胞行为产生显著影响。

图2-2　聚乙二醇大单体和带不同小分子官能团的丙烯酸单体的分子结构示意图

单体中的特征官能团以红色突出显示。

随后，Ren和Cui等还研究了神经干细胞在不同化学官能团（—OH、—SO₃H、—NH₂、—COOH、—SH和—CH₃）自组装表面的黏附和分化等行为。其实验结果表明：神经干细胞在—SO₃H表面体现出最大的接触和铺展状态，而在—CH₃表面则呈现出最小的接触面积和较圆的铺展状态。此外，他们的研究结果还表明基底表面的化学官能团对神经干细胞的迁移和分化也存在不同程度的影响。

除在玻片表面利用自组装构建不同官能团基底外，Chen和Ye等还通过化学修饰的方法在聚己内酯（PCL）薄膜表面构筑了“悬挂”不同化学基团的表面（PCL—CH₃、PCL—OH、PCL—CH ═O、PCL—NH₂和 PCL—COOH）。各类基底材料的分子结构示意图见图2-3。这些表面能够对人骨髓基质干细胞的黏附、增殖和分化等行为产生调控作用：例如 PCL—NH₂表面最利于成骨分化，而PCL—CH₃表面则最利于成软骨分化。Li和Chen等在金纳米颗粒表面通过接枝引入不同官能团的研究结果同样证实，官能团能够显著影响干细胞的分化行为。

最近，利用特定巯基试剂的自组装并结合独到的微米图案转移技术，复旦大学丁建东课题组在持久抗细胞黏附的聚乙二醇[poly（ethylene glycol），PEG]水凝胶表面成功制备了具备不同官能团（—CH₃、—OH、—COOH 和—NH₂）的微米图案。后续细胞实验结果表明，相比于荷电的—COO^-和—而言，偏中性的—CH₃和—OH能够吸附的蛋白量相对较少，从而导致其表面细胞的铺展面积相对更小，进而更利于干细胞的成软骨分化（图2-4）。

图2-3　PCL及用不同小分子官能团改性基材的分子结构示意图

每组材料中的特征官能团以红色突出显示。

本章作者课题组的进一步研究还发现，在铺展面积相同的情况下（微米岛控制黏附面积一致），不管是偏中性还是带电荷的基团，其成软骨分化程度并无显著性差异（图2-4中部所示）。该研究结果首次揭示：材料表面的官能团和荷电情况并不直接调控干细胞分化，而是通过影响非特异性的蛋白吸附（不同的蛋白吸附能力）来影响骨髓基质干细胞的黏附状态（不同的细胞黏附铺展面积），从而间接地影响了干细胞的分化行为。

图2-4　基底表面官能团对干细胞黏附和成软骨分化行为的影响示意图

与偏中性的表面（—CH₃、—OH）相比，带电荷的表面（—COOH、—NH₂）能够从培养液中吸附更多蛋白质，如图上方所示。与带电荷表面相比，偏中性表面上细胞铺展面积更小，进而利于成软骨分化，如图中“自由表面”情况所示；而当用微米岛固定细胞的铺展面积后（不同官能团、统一铺展面积），带电荷表面与偏中性表面相比成软骨分化不再具有显著性差异，如图中“图案表面不同官能团”情况所示；当用微米岛固定细胞的铺展面积后（不同铺展面积），对任何一种表面来说，始终是小的铺展面积利于成软骨分化，如图中“图案表面不同面积”情况所示。

引自：CAO B，PENG Y M，LIU X N，et al.Effects of functional groups of materials on nonspecific adhesion and chondrogenic induction of mesenchymal stem cells on free and micropatterned surfaces[J].ACS Appl Mater Interfaces，2017，9（28）：23574-23585.