二、材料软硬度对细胞行为的影响

机体内不同组织器官具备不同的软硬度，且跨度范围相对较大，如神经组织较软，而骨组织却很硬，因而考察材料软硬度对细胞行为和功能可能产生的影响成为了一类重要的基础研究课题。借助于材料技术尤其是具备良好生物相容性且软硬度可调范围大的水凝胶合成技术的发展，科学家们逐渐揭示了材料软硬对细胞行为和功能的影响。正如Discher等所描述的那样，“组织细胞能够感受到基底材料的软硬并对其作出反应”。

早在1997年，Pelham和Wang等便报道了正常大鼠肾上皮细胞和3T3成纤维细胞在较硬的基底表面黏附铺展较为明显，而在较软的基底表面铺展却相对较差。他们当时所利用的基材是涂覆有胶原的具备不同软硬的聚丙烯酰胺水凝胶体系。有趣的是，该研究同时还观察到细胞在较软基底表面的运动速率和板状伪足的活性均得到了增强。当将3T3成纤维细胞接种到具有软硬反差的表面后，该课题组后续研究还有趣地发现，较软基底一侧的细胞能够很容易地跨越“软-硬交界”并迁移到基底较硬的一侧，同时细胞铺展面积与应力也相应增加；然而较硬一侧基底上的细胞却很难跨越“硬-软交界”并迁移到较软的一侧，当这部分细胞触及到“硬-软交界”处后往往发生缩回或转向运动（不会迁移到软基底表面）。其他研究小组也报道并证实了类似的基材软硬对细胞黏附和迁移行为的影响。

上述研究暗示基底材料的软硬能够影响细胞的黏附、迁移等行为。此外，科学家还考察了材料软硬对细胞分化行为的影响。2006年，Engler和Discher等首次报道了基底材料的软硬能够显著影响人骨髓基质干细胞的分化行为。经过一段时间的培养后，在软的基底表面，干细胞发生了成神经分化；在中等软硬度的表面发生了成肌分化；而在较硬的表面则发生了成骨分化。

上述先驱报道提示，与机体组织类似软硬的材料利于促进多能干细胞偏向该组织细胞方向进行分化，类似结论也得到了后续基础研究报道的证实和支持。如Saha等的研究报道也发现在与脑组织类似软硬的基底上β-tubulinⅢ的表达量最高，即表明在较软基底表面上的细胞更倾向于朝着神经细胞分化。

有趣的是，凭借利用微米柱测量细胞应力的丰富经验，Fu和Chen等随后想到利用适宜的微米柱阵列（拓扑形貌）来调节基底材料软硬度的方案，进而实现了利用简洁的图案技术来研究细胞对基底软硬的响应行为。实验研究中，他们利用同种材料制备了不同高度的弹性微米柱阵列（柱子直径为2μm，柱子中心间距为4μm，高度范围为1～13μm），然后对人骨髓基质干细胞在这些拓扑图案表面的黏附和分化行为进行了表征。结果表明干细胞在硬的基底表面（柱子高度为0.97μm）铺展较好而在软的基底表面（柱子高度为12.9μm）则缩成圆形。经分化诱导后，他们发现微米柱的软硬（高低）能够显著影响细胞的分化行为：较软微米柱阵列（高柱）上的细胞利于成脂分化，而较硬微米阵列（矮柱）上的细胞却利于成骨分化。

但是，美国学者的研究受到了一部分欧洲学者的质疑。来自英国和德国的部分知名课题组于2012年在Nature Materials上联合撰文，表示按照当初美国学者的实验设计，在材料软硬度发生改变的同时，材料表面的化学性质也有一定的改变，这才是细胞行为发生变化的真正原因。

为了对这个重大基础科学问题给出确切答案，迫切需要有一种十分严格的材料制备手段，可以将基底软硬度与材料的表面化学性质独立调控。而本章作者课题组通过多年研究所发展的一种独到的图案化表面技术在此展现了其魅力。利用浸涂（dip-coating）技术并结合独到的纳米图案转移技术，Ye和Ding等在持久抗细胞黏附的PEG水凝胶表面成功制备得到了可细胞黏附的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）纳米点阵。结合不同分子量PEG-DA的合成等手段，进而制备得到不同软硬的PEG基底材料（但表面含有相同的RGD纳米阵列来促进细胞的黏附）。大鼠骨髓基质干细胞在上述材料表面的黏附和分化结果表明：在相对较硬的基底表面，细胞体现出更大的铺展面积和细胞应力，进而更利于成骨分化；而细胞在较软的基底表面则体现出较小的铺展面积和细胞应力，进而更利于成脂分化，这一趋势在间距为49nm和135nm的RGD点阵基底上均得到了验证（图2-8）。

图2-8　骨髓基质干细胞在不同软硬表面的成骨成脂分化行为

第一行展示了成骨成脂共诱导后的明场染色照片，细胞中的脂肪滴（成脂标记物）被油红标记为红色，碱性磷酸酶（成骨标志物）被固蓝标记为蓝色。第二行展示了对应区域的荧光显微照片，细胞核被4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）标记为蓝色。

引自：YE K，WANG X，CAO L P，et al.Matrix stiffness and nanoscale spatial organization of cell-adhesive ligands direct stem cell fate[J].Nano Lett，2015，15（7）：4720-4729.

本章作者课题组的上述研究报道利于不同的材料手段或细胞种类，从不同角度和侧面证实了较为一致的材料软硬对细胞行为和功能的影响。由于采用特殊的材料技术严格将软硬度和表面化学予以独立调控，这是迄今为止确证材料软硬度影响干细胞分化的最具决定性的实验证据。