五、三维梯度的制备方法

相比于平面二维梯度，三维梯度能更有效、更直接地模拟生物体内真实环境。因此，三维梯度材料的制备技术非常重要。通常情况下，三维梯度可以分为以下两种：物理梯度，例如孔径大小和孔隙率的梯度；化学梯度，例如固定在三维支架或水凝胶内部的生物活性分子例如多肽、生长因子等的密度梯度（图4-12A）。

对于大孔支架，由离心衍生出来的一系列方法能够得到孔隙率或孔径大小的梯度（图4-13）。例如离心-加热烧结和离心-冻干的方法，能够制备孔径梯度分布的大孔支架，得到的孔径大小与离心转速密切相关。利用相分离（温度梯度驱动的冷冻处理）-再冻干的方法，能够获得孔径范围更大的梯度。

三维打印是一种快速成型技术，可以运用逐层打印的方式来构建材料，是制备三维梯度的重要手段之一。通过三维打印，可以打印出孔隙率的梯度，还能够打印出孔隙率和组成均为渐变结构的三维梯度。

三维空间上的化学梯度大致可以分为可溶分子梯度及固定分子梯度，制备方法较为单一，通常采取扩散或对流的方式。Boyden小室或其类似物经常被用做研究可溶分子梯度（例如细胞培养基中）的辅助工具。然而其缺陷在于只能单纯模拟可溶分子梯度，并不能提供一个真实的三维培养环境。因此，需要在细胞相容的大孔水凝胶（例如琼脂糖、纤维蛋白以及胶原蛋白）内引入可溶分子梯度，要么提供单一来源或双侧来源的可溶分子信号，或者将信号直接传递到凝胶内部的不同位置。

三维空间固定分子的梯度通常以大孔支架为基底，辅以梯度的表面修饰，与二维平面的修饰方法类似。例如聚合物支架表面通过氢键作用梯度固定肝素后结合生长因子构成梯度，将生长因子包裹在可降解微球中复合在支架材料中，控制微球的降解得到生长因子浓度梯度，以及微流道器械辅助在水凝胶表面构建梯度（图4-12B）。

图4-12　三维化学梯度材料的制备方法

A.PCL/F127三维支架上通过肝素结合形成生长因子梯度的示意图；B.微流体装置示意图，信号源和趋化因子溶液能够在装置内形成稳定线性梯度。

图4-13　三维多孔支架的制备方法

A.通过离心法制备孔径梯度的PCL支架示意图；B.纺丝装置示意图；C.层压工艺（TheriForm）示意图，其中薄层的粉末扩散，用液体黏合剂在所需区域中黏合在一起。