一、化学梯度的影响

由于生物体内细胞受ECM蛋白、生长因子和其他信号分子的梯度作用而发生迁移，因此可以通过在体外构建化学梯度来研究各因素对细胞迁移行为的影响。化学组分的改变可导致表面极性、亲/疏水性、厚度、表面能、介电常数、电荷、生物相容性等性质的改变，进而调节细胞黏附、铺展和增殖。ECM蛋白、多肽和生长因子都可以固定在表面来模拟体内梯度的生理环境。

（一）细胞外基质蛋白分子梯度调控细胞迁移

Meier在微流道内制备了300μm的PI3K激酶梯度，发现细胞可以在短时间内迅速对梯度做出响应并极化（图4-14A）。纤维粘连蛋白和层粘连蛋白介导细胞的通信和运动，它们的分子中有一些结构域可以结合到细胞膜上的受体。例如，人类纤维粘连蛋白包含RGD序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸），它可以特异性结合 α₅/α₈/α_V/α_Ⅱb整合素亚群（如 α₅β₁、α₈β₁、α_Vβ₁、α_Vβ₃、α_Vβ₅、α_Vβ₆、α_Vβ₈和α_Ⅱbβ₃）。纤维粘连蛋白和层粘连蛋白可以与细胞膜上的受体特异性相互作用，进而启动信号转导途径将细胞外部刺激传递到细胞内。Reichert构建了纤维粘连蛋白的梯度，发现该梯度对主动脉内皮细胞的定向迁移有促进作用。Rajagopalan研究了纤维粘连蛋白和RGD肽对成纤维细胞铺展和运动的影响。虽然在两种表面，细胞的迁移速度是相似的，但在纤维粘连蛋白修饰的表面细胞黏着斑更大，细胞黏附力更强。这些结果表明成纤维细胞对纤维粘连蛋白有较高的亲和力。Gunawan等采用微流道技术制备了线性的层粘连蛋白浓度梯度。大鼠IEC-6小肠隐窝细胞迁移的速率不受梯度的斜率影响，但是在蛋白浓度高的区域，细胞迁移的方向性变差。Cai采用微接触印刷的方法在镀金材料表面得到一层羧基自组装的单分子层，进而共价连接了层粘连蛋白的密度梯度，发现内皮细胞集中黏附在层粘连蛋白密度相对较大的区域，且层粘连蛋白的密度梯度对内皮细胞沿梯度方向取向有明显作用，极化率达70%（图4-14B）。胶原蛋白是存在于细胞外基质中的主要蛋白质，它可以促进细胞的黏附和铺展。Cai等研究了内皮细胞在胶原蛋白梯度表面的定向迁移运动。在梯度表面，低和适中的胶原蛋白密度区域，细胞显示出了沿着梯度定向迁移至胶原蛋白密度高的区域的趋势。然而，在高胶原蛋白密度的区域，细胞则沿着胶原蛋白梯度相反的方向迁移，表明细胞的迁移依赖于表面的胶原蛋白密度。生物信号的梯度材料，为细胞提供了逐渐增强的信号刺激，诱导细胞定向极化并定向迁移。梯度对细胞迁移的影响主要取决于梯度的绝对浓度差和梯度的斜率。Smith等研究了牛主动脉内皮细胞在纤维粘连蛋白的浓度梯度上的运动，发现内皮细胞在沿着纤维粘连蛋白浓度增加的方向上迁移的速度增加。他们还报道，在纤维粘连蛋白浓度0.34～1.23ng/mm³范围内，增加纤维粘连蛋白梯度的斜率有利于提高人类微血管内皮细胞的迁移速度。

图4-14　趋化因子影响细胞行为的实例

A.三通道微流道示意图，用于形成交替趋化梯度。在t₀，没有化学诱导（红色）引入细胞部位（虚线框）。细胞肌动蛋白聚合形成随机突起，如绿色所示。在t₁时，SF1引入趋化性刺激，导致细胞沿梯度方向向左迁移。B.通过喷墨印刷在底物上产生层粘连蛋白梯度的示意图及细胞在不同区域的荧光显微镜照片。

（二）生长因子梯度调控细胞迁移

由于其显著的生物功能，生长因子被认为是一类具有潜力的趋化诱导剂，在组织再生中发挥重要作用。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一组被称为成纤维细胞生长因子家族（FGFs）的蛋白质之一。Wu等通过表面肝素分子的密度梯度，制备了bFGF密度梯度，发现在其密度适中时，平滑肌细胞迁移速率最高。DeLong等制备了复合bFGF的梯度水凝胶，主动脉平滑肌细胞朝梯度方向排列，并沿着生长因子浓度增加的区域定向迁移。Liu等发现血管内皮生长因子（VEGF）的梯度能显著促进内皮细胞的定向迁移，在结合了纤维粘连蛋白（Fn）梯度后，细胞迁移的速率增加了2倍（图4-15）。Stefonek-Puccinelli和Masters等发现角质细胞在表皮生长因子梯度上比在均匀表面上迁移速率增加近10倍。固定的胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors，IGF-1）梯度也会促进角质细胞迁移。然而，当表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和 IGF-1 两种因子结合时，梯度对细胞的迁移速率没有太大影响。

图4-15　表面蛋白质密度梯度的构建及其对细胞迁移的影响

A.通过电化学方法构建表面蛋白质密度梯度的示意图。B.在梯度表面，牛主动脉内皮细胞在24小时内向蛋白质密度更高的方向迁移距离统计；Fn.纤维粘连蛋白；VEGF.血管内皮生长因子。*.P<0.05。

（三）衍生多肽梯度调控细胞迁移

当蛋白质和生长因子固定在表面的时候，很容易发生构象转变而失活。由于多肽具有更好的稳定性，所以通常情况下，常用蛋白质分子中具有特定功能的氨基酸序列即功能多肽来代替蛋白质。DeLong和Guarnieri等均发现RGD多肽的密度梯度水凝胶可以诱导成纤维细胞的定向迁移，并能提高细胞的迁移速度（与RGD密度均匀水凝胶相比）。通过微接触印刷的方法可以精确地调控RGD位点的梯度阵列。细胞可以朝RGD位点间距小的区域极化并迁移（图4-16）。亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV）肽是层粘连蛋白中介导黏附的功能序列。Adams等制备IKVAV梯度网格，发现鸡胚背根神经节生长锥与梯度相遇时，会发生转向并沿着梯度方向迁移。精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸（REDV）多肽能够与内皮细胞表面整合素受体α₄β₁结合，特异性识别内皮细胞。Yu等在聚己内酯表面通过多巴胺沉积共价接枝双键改性透明质酸，继而构建了内皮细胞选择性多肽REDV密度梯度。该梯度能够选择性促进内皮细胞黏附。内皮细胞在REDV多肽表面迁移方向性提高（86%）、迁移速率增大（14μm/h），且该REDV 多肽密度梯度具有定向调控细胞集群迁移的能力。Sarvestani基于模型的理论计算预测单个细胞的迁移速度。该模型预测细胞的迁移速度和梯度斜率呈双相依赖，即梯度的斜率太低或太高都会使细胞迁移速率变慢，在适中斜率的梯度表面细胞具有最高的迁移速度。

图4-16　表面图案化对细胞黏附的影响

A、B.成骨细胞MC3T3在接触并感知80nm图案后伸出伪足；C.在基底不同位置细胞投影面积统计。