四、三维梯度
由于细胞迁移受到细胞外基质和外界环境刺激的影响，因此三维环境下的细胞黏附及迁移与二维平面上有很大区别。细胞周围环境相对平面硬度较低，细胞外基质分泌并包裹在细胞周围（图4-20A），细胞在迁移时可能不依赖伪足，需要对硬度以及化学刺激更加敏感（图4-20B）。同时从分子水平上，细胞在三维环境迁移需要更持久的方向性，小GTP酶具有信号传导开关的作用，表达升高；同时合成板状伪足时高表达的Rac蛋白表达量降低。
图4-20 细胞外基质微环境及阿米巴迁移示意图
A.三维环境对于细胞功能非常重要。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的机械性能取决于其组成、结构和交联程度。ECM能够将信号传递给周围环境中的细胞。B.极化的膜泡由细胞膜从细胞骨架的局部分离或肌动蛋白皮质的局部破裂产生。
细胞在三维环境中主要有两种迁移方式：间充质迁移和阿米巴迁移。间充质迁移与二维平面迁移类似，属于动力依赖型迁移。间充质迁移依赖于整合素介导，肌动蛋白合成后细胞骨架重排，加强细胞与基质间连接，诱导细胞极化，细胞形态呈梭形。阿米巴迁移则类似“blebbing migration”，整合素不聚集，肌动蛋白与胶原蛋白纤维界限模糊，因此与基底黏附力弱。通常情况下细胞呈圆形，依靠挤压自身通过基底间隙从而迁移。大部分组织细胞在三维环境下是间充质迁移，阿米巴迁移方式主要见于肿瘤细胞例如淋巴癌或肺癌细胞，或中性粒细胞等非肿瘤细胞中。在肿瘤细胞迁移中，通常两种迁移方式会相互转换。
Lee构建了RGD修饰的PEG水凝胶，发现人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblast，HDF）能够侵袭到水凝胶内部，以形成触角并不断前进的方式迁移（图4-21A和图4-21B）。Silva等制备了多孔支架，考察急性早幼粒细胞在支架中的迁移行为，发现全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导细胞分化后，能够促进其在支架内部迁移（图4-21C和图4-21D）；再用紫杉醇处理诱导分化后的细胞，能够抑制其在支架内部迁移。Tampieri和Roy等都发现将孔隙率梯度陶瓷支架植入兔股骨/颅骨缺损部位时，在较高的孔隙率支架的部位新骨形成的能力增强。孔径梯度变化的蚕丝蛋白支架可以在体内诱导形成一个形态结构渐变的组织。大孔径和高孔隙率的支架可以促进软骨细胞和成骨细胞的生长，同时孔径较小和孔隙率较低的支架则利于成纤维细胞的增殖。
图4-21 多孔支架内部急性早幼粒细胞迁移行为研究
A.通过已知浓度的FITC-RGDSK-PEG-丙烯酸酯标准曲线校定在水凝胶中结合的RGDS浓度；B.在胶原酶敏感PEG水凝胶内的RGDS图案化区域内，三维迁移的HDF共聚焦图像；C.支架的三维重建；D.共聚焦切片显示支架中不同深度迁移的ATRA分化APL细胞密度，发现紫杉醇处理后细胞在支架内垂直迁移距离减小，即细胞通过支架孔隙的能力被降低了。
细胞也可以响应三维海绵支架和水凝胶中的化学梯度信号而发生迁移。Sundararaghavan等发现复合了RGD的配体密度梯度的透明质酸三维支架上可诱导小鸡主动脉弓移植体的细胞沿着RGD梯度长入支架内部。Lühmann等同样也证明了在二维或三维支架中固定免疫球蛋白样细胞黏附分子L1（TG-L1 Ig6）梯度有利于细胞的排列和定向迁移。Moore等制备了含神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和神经营养因子-3（neurotrophin-3，NT-3）的PHEMA凝胶。在水凝胶表面种植背根神经节细胞时，细胞可以感应两种因子的协同诱导作用，沿着梯度迁移，穿过水凝胶到达浓度高的一端。Musoke-Zawedde和Shoichet等在透明质酸凝胶上制备RGD肽梯度，可以诱导初级神经细胞的突起生长。将层粘连蛋白梯度固定在三维凝胶中，发现鸡胚背根神经节细胞的伸长和迁移受梯度诱导，且与层粘连蛋白的梯度斜率有关（图4-22A）。肿瘤细胞侵袭与氧气浓度相关，因此在含氧量低的明胶凝胶中，外界干预给予氧气浓度梯度刺激，发现肿瘤细胞趋向于向含氧量低的凝胶中侵袭和转移，迁移速率明显增大（图4-22B）。
图4-22 氧气浓度对细胞迁移的影响
A.背根神经节细胞（dorsal root ganglia，DRG）培养的实验示意图及轴突在层粘连蛋白梯度上生长的示意图；B.HI水凝胶中的缺氧和非缺氧O2梯度的示意图，发现缺氧梯度中的细胞迁移速率较非缺氧环境中更快。