二、Notch 1信号通过β1整合素参与低氧诱导的表皮细胞迁移
氧分压是影响表皮发育和功能的重要微环境因素，创伤后细胞的高耗氧量和血管损伤，导致局部低氧微环境的形成，但缺氧对创面愈合是否有利目前仍存在争议。本研究采用组织氧分压监测仪，检测烧伤创面氧分压的时空分布，并且通过免疫组织化学染色，观察到NICD（Notch 1信号通路的激活标志物）和整合素β1（表皮干细胞的生物标志物）在创缘的分布与氧分压的改变具有相关性。通过体外的细胞实验，进一步证实低氧可通过调控Notch 1信号通路，促进整合素β1的高表达，从而促进角质形成细胞的迁移。
采用小鼠皮肤烫伤模型，免疫组织化学染色检测正常皮肤、伤后第4天、伤后第22天创面整合素β1和NICD的表达。创缘Notch 1信号通路活化标志物NICD的表达显著低于正常皮肤；创缘整合素β1的表达则显著高于正常皮肤，两者的表达变化趋势与创缘低氧的变化呈一定关系，可能系创缘氧分压的改变所致（图5-7）。
为了研究低氧对表皮细胞NICD和整合素β1的影响，我们建立细胞低氧模型。实验结果显示：低氧显著抑制NICD的表达，但显著促进整合素β1的表达，这与整体动物实验结果相契合。同时，免疫荧光染色结果表明，低氧不仅抑制NICD的表达，还抑制NICD由细胞核向细胞质的转位，后者也是Notch 1信号通路受抑制的表现，提示低氧（2%O2）增加表皮细胞整合素β1的表达，同时抑制Notch 1信号通路的活化。为进一步明确Notch 1信号通路是否介导了低氧促进的整合素β1高表达，我们使用Notch 1配体（Jagged-1或Dll4），Notch 1抑制剂DAPT及siRNA调控Notch 1信号通路，结果表明，DAPT增加整合素β1的表达，存在浓度依赖性；而使用siRNA有效抑制Notch 1后也显著增加整合素β1的表达。
常氧条件下，Jagged-1和 Dll4均有效激活Notch 1信号通路，并抑制整合素β1的表达。更重要的是，低氧条件下，Jagged-1和Dll4均可重新激活Notch 1信号通路，并抑制低氧对整合素β1表达的促进作用，这说明Notch 1信号通路在低氧介导的整合素β1高表达中发挥重要作用。由于整合素β1对细胞迁移发挥重要作用，并结合低氧微环境贯穿于整个创面愈合过程，我们推测Notch 1信号通路和整合素β1的表达在低氧介导的表皮细胞迁移中发挥重要作用。接下来划痕实验结果表明，抑制Notch 1信号通路和低氧处理均可有效促进HaCaT细胞迁移，而靶向干扰整合素显著抑制细胞迁移（图5-8）。细胞增殖实验表明，各组间细胞增殖无明显差异，这证明，Notch 1信号通路和整合素β1的表达在低氧介导的表皮细胞迁移中发挥重要作用。
既往研究发现，Notch 1信号在异常增生的表皮中被下调，例如在癌症和银屑病中，以及在再上皮化的第一阶段。但在光疗后的银屑病斑块以及在伤口愈合后新生的分层的表皮中，它又恢复到正常水平。Notch 1信号在角质形成细胞系中发挥类似开关的作用，它使细胞分化，减少整合素的表达。以上的这些现象也与我们的实验结果相符。然而，其他研究表明，在CHO（中国仓鼠卵巢）细胞中，NICD激活整合素。在血管内皮细胞和成纤维细胞中，NICD促进细胞迁移。不难发现，Notch信号的激活可引起多样化的细胞生物学效应，并且是以一种细胞类型和环境依赖的方式。在角质形成细胞中，我们发现低氧在一定程度上抑制了Notch 1信号，促进整合素β1的表达，促进细胞迁移，揭示了在创面愈合过程中，低氧使角质形成细胞发生了类似于“逆分化”的过程。Notch 1信号通路参与了低氧诱导的创缘区域整合素β1的上调，并且这种整合素β1的高表达促进了角质形成细胞迁移。虽然人们在几十年前就认识到低氧在伤口愈合中存在，但是，“细胞的氧传感在细胞适应和修复过程中的作用”仍然是一个相对较新的研究领域。这项研究的结果可能会帮助人们拓展对这一领域的认识。
图5-7 整合素β1和Notch 1信号通路参与创面愈合过程
A、C、E.免疫组织化学染色检测正常皮肤、小鼠皮肤烫伤模型伤后第4天、伤后第22天创面NICD的表达；B、D、F.免疫组织化学染色检测正常皮肤、小鼠皮肤烫伤模型伤后第4天、伤后第22天创面整合素β1的表达；G.不同处理组创面NICD表达光密度值统计图；H.不同处理组创面整合素β1表达光密度值统计图（*.P<0.05同正常对照组比较，#.P<0.05同正常对照组比较）。NICD.Notch 1信号通路的激活标志物。
图5-8 Notch 1信号通路和整合素β1在低氧介导的表皮细胞迁移中的作用
A.调控Notch 1信号通路后对表皮细胞迁移影响（DAPT及siRNA ITGB1抑制Notch 1信号通路；Jagged-1和Dll4激活Notch 1信号通路）；B和C.不同处理组创面愈合率（*.P<0.05同对照组比较，#.P<0.05同siRNA con组比较，##.P<0.05同低氧组比较）；D.整合素β1蛋白表达水平；E.CCK8检测不同处理组细胞增殖水平。