二、疫苗生产主要的原辅料

（一）菌毒种

疫苗通常是由细菌或病毒扩增培养后制备而来，菌毒种的抗原结构、免疫原性、毒力、毒性以及在传代过程中的变异都将直接或间接影响疫苗的质量。

为了确保生产用菌毒种的稳定和一致，通常对生产菌毒种采取种子批系统进行管理，由原始种子扩增培养制备出主种子批菌毒种，从主种子批菌毒种中取一支扩增培养制备出一批工作种子批菌毒种。 疫苗生产时复苏或开启一支工作种子批菌毒种，生产结束时将该菌毒种销毁废弃，再次生产时再复苏或开启另一支同一工作种子批的菌毒种。

1.复苏或开启菌毒种

工作种子批菌毒种通常休眠保存在超低温的液氮、-80℃冰箱或冷冻真空干燥保存。 采用适宜的培养基，在适宜的培养条件下将冷冻保存的疫苗生产菌毒种复苏并扩增培养。

2.多级/代放大扩增培养

生产菌毒种复苏后，通常需要经过多级/代放大扩增培养后才能进入疫苗生产规模的扩增培养阶段。

3.疫苗生产规模阶段的扩增培养

目前理想的生产规模培养通常是在大型生物反应器/罐中采用液体培养基培养，而一些疫苗依然采用鸡胚、转瓶（液体）或克氏瓶（固体）培养。

通常减毒活疫苗的生产菌毒种是经过筛选出来的不具备致病力的弱毒菌毒种，而灭活疫苗的生产菌毒种通常毒力较高，对人体具有致病力，因此在生产过程中扩增培养结束后必须彻底灭活。

（二）灭活剂和脱毒剂

灭活指通过物理或化学的方法破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能保持其原有免疫原性的过程。 脱毒是指将毒素与脱毒剂相互作用，并加温处理可以去除毒性而保留免疫原性制成类毒素，如白喉类毒素、破伤风类毒素等。 常用的灭活剂和脱毒剂有甲醛、戊二醛、β-丙内酯、苯酚等。

选择灭活剂时应考虑抗原的特性和灭活剂的活性，选择的灭活剂应能灭活彻底，并保持抗原的免疫原性，不影响疫苗的免疫保护效果，同时对人无毒害作用、无安全性问题。 在成品检定中应建立灭活剂/脱毒剂残留量检测的方法和限度标准。

常用的灭活剂/脱毒剂包括如下几种。

1.甲醛

是应用最广泛的灭活剂，也是毒素脱毒的首选脱毒剂。 甲醛的醛基能破坏微生物蛋白质和核酸的基本结构，导致微生物的死亡而失去感染力，常用于细菌疫苗的杀菌。甲醛脱毒具有使用浓度低、脱毒完全且能保持良好的抗原性和免疫原性的特点。

残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生致畸反应。 《中华人民共和国药典（2020年版）》对使用甲醛的疫苗中残留甲醛的限度规定，一般为不高于0.2g/L。

2.戊二醛

是常用于无细胞百日咳疫苗的脱毒剂，其具有甲醇含量低、无致畸变、无积毒的特点。 对无细胞百日咳疫苗主要组分抗原进行甲醛和戊二醛解毒的比较研究发现：甲醛解毒速度较慢，需采用少量分次加入或一次加入。 且甲醛脱毒后疫苗易发生毒性逆转现象，37℃放置4 周后，毒性试验超过规程要求。 相比较戊二醛其解毒速度较快，解毒后质量稳定，放置37℃处理后，未见有毒性逆转现象的发生。 但戊二醛的解毒也有解毒过程不易控制的缺点。 《中华人民共和国药典（2020年版）》对疫苗中残留戊二醛的限度规定为不高于0.01g/L。

3.β-丙内酯

是一种酮和甲醛的缩合物，是近些年来常用的疫苗灭活剂，对病毒具有很强的灭活作用，特别在对狂犬病疫苗和出血热疫苗的灭活方面，在保持疫苗免疫原性方面优于甲醛。 β-丙内酯直接作用于DNA 或RNA，改变病毒核酸结构达到灭活目的，而不直接作用于壳蛋白，不破坏病原体的免疫原性，对病毒的灭活能力很强。 由于其能在疫苗液体中完全水解，水解后生成α-羟基丙酸，对人体无害，不必考虑在成品疫苗中的残留。

（三）佐剂

佐剂（adjuvant）是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。 免疫佐剂有诸多优点，如减少免疫针次、减少抗原用量、增强免疫反应等。 在过去的几十年中，至少有上百种物质被研究者尝试用作佐剂，如细菌产物、矿物质、微粒体、核酸、脂质体等，目前获批上市的疫苗佐剂多数集中在微小颗粒或纳米颗粒，包括铝盐、乳剂、脂质体和病毒体。

1926年，Glenny 等发现使用铝剂沉淀的白喉类毒素悬液要比类毒素本身具有更好的免疫原性，这一发现为之后铝佐剂用于疫苗生产奠定了基础。 铝佐剂是迄今为止使用最为广泛的人用疫苗佐剂，在已上市疫苗中显示了普遍的安全性和有效性。 铝佐剂发挥作用的机制目前尚未完全确定，已有的研究结果认为可能的作用方式主要有抗原仓储作用、增强抗原的递呈、增强Th2 细胞介导的适应性免疫应答、增强机体固有免疫应答、激活补体作用等。疫苗中常用的铝佐剂包括氢氧化铝佐剂（羟基氧化铝）、磷酸铝佐剂（羟基磷酸铝）。

不同类型的铝佐剂在结构形态、抗原吸附选择性、体内代谢清除时间等方面存在显著差异。 同时，铝佐剂的质量特性高度依赖于生产工艺，不同工艺制备出的铝佐剂在粒径大小和分布、等电点等方面的质量属性也不同。 氢氧化铝是一种表面只有羟基基团的层状晶体，以纤维粒子形式存在，这种粒子聚集后以松散的形式存在，只有佐剂颗粒的外层可以和抗原结合。 磷酸铝佐剂是羟基磷酸铝复合物，为无定形结构，初级粒子是直径为50nm 的盘状结构，然后形成大约3μm 的松散粒子。 抗原与铝佐剂结合主要是依靠静电引力、疏水作用和配体互换3 种方式。

目前，铝佐剂已被广泛应用于多种疫苗，比如百白破联合疫苗、乙肝疫苗、人乳头瘤病毒疫苗等。

影响铝佐剂效应的主要因素包括如下几点。

1.吸附率

通常情况下，抗原的吸附率越高，免疫效果越好；反之免疫应答的效果越差。 世界卫生组织要求白喉和破伤风类毒素疫苗的吸附率至少要达到80%，美国食品药品管理局要求至少达到75%的吸附率，我国也在《中华人民共和国药典（2020年版）》中将吸附率作为质量控制指标。

2.吸附强度

在吸附度相同的情况下，抗原与铝佐剂之间的作用力大小，即吸附强度不同，其免疫效果也存在差异。 在一定范围内增加铝吸附产物内磷酸根离子的浓度可以降低氢氧化铝佐剂对抗原的吸附强度，从而提高疫苗的免疫抗体滴度。

3.氢氧化铝佐剂颗粒大小及均一度

铝佐剂颗粒的大小及其颗粒均一性均会对疫苗的免疫效果产生一定的影响，特别是注射疫苗后的不良反应发生与铝佐剂的颗粒大小及均一度密切相关。

4.铝佐剂的剂量

每剂疫苗中铝佐剂的含量应适度，过低无法达到有效吸附抗原并刺激免疫反应的目的，虽然小剂量的佐剂就可完全吸附抗原，但尚需考虑诱导较好免疫效果的能力；而过量的铝佐剂则会抑制免疫反应，可能是由于过多的佐剂完全包裹抗原反而抑制了抗原的释放。

经过近一个世纪的使用，铝佐剂的制备与使用技术已非常成熟，数以亿计的铝吸附百白破、乙肝疫苗被安全接种于成人和儿童，但是，目前铝佐剂仍存在一些不足之处，最主要的是接种含铝佐剂的疫苗可导致一些局部不良反应，如红斑、皮下结节、肉芽肿等。 此外，铝佐剂引起的过敏反应也是较受关注的问题，铝佐剂可吸引嗜酸性细胞到注射部位，增加总IgE 抗体水平，诱导IgE 介导的变态反应，从而有可能增加易感个体的敏感性。 铝佐剂可作为抗原刺激免疫反应，而与其共同注射的抗原反而可以作为它的“佐剂”。 初次注射可致敏，间隔一段时间后再次注射即发生超敏反应。

由于铝佐剂疫苗通过铝盐形成的特殊结构将抗原成分吸附其中，在疫苗的网格结构中，抗原被铝盐支撑着，在冷冻情况下网格结构即被破坏，不能支撑抗原，因此铝佐剂疫苗不能冷冻保存。

除了传统的氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂外，近些年一些新型铝佐剂也陆续被推出，如AS04 佐剂系统等。 AS04 是新型佐剂，是含MPL 的铝佐剂，主要作用是诱生促炎细胞因子、诱生趋化因子、招募单核细胞/巨噬细胞到达注射部位、协助抗原诱导特异性Th1 免疫应答。2007年，以AS04 为佐剂的人乳头瘤病毒疫苗被批准用于人子宫颈癌的预防，AS04 也被批准用于乙肝疫苗。

MF59，来源于角鲨烯的一种乳剂，1997年，含MF59 的流感疫苗获批上市，迄今已应用于30 多个国家。 与铝佐剂的作用机制不同。 MF59 可在注射部位募集嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，增强抗原提呈细胞（APC）对抗原物质的吞噬及胞饮作用，促进单核细胞向树突状细胞分化。

（四）稳定剂

生物制品中，常需加入作为稳定剂的辅料，以保持其生物学特性和/或免疫原性。 常用的稳定剂包括如下几种。

1.人血白蛋白

来源于健康献血员血浆分离纯化的血清白蛋白产品，主要用作注射用药物处方的辅料，作为处方中蛋白和酶的稳定剂。 也可在冷冻干燥过程中作为防冻剂，以防止表面吸附其他蛋白。 人血白蛋白是最常用的生物制品稳定剂，例如麻疹减毒活疫苗、风疹减毒活疫苗、腮腺炎减毒活疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗、人用狂犬病灭活疫苗等病毒性疫苗和肺炎球菌荚膜多糖等组分疫苗，都常用其作为稳定剂，通常使用1%～5%的浓度。

2.糖类

麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇等糖类常用作生物制品的稳定剂。

3.明胶

由动物胶原水解得到，来源于牛、猪等动物的皮、骨、腱与韧带中的胶原。 由于明胶是过敏原，能引起多种不良反应，现已停止使用。

（五）冷冻干燥保护剂

生物制品中的有效成分主要是活病毒、细菌或这些病原体的蛋白质、多糖等，对温度敏感，易于变性或失活。 冷冻干燥技术为理化性质不稳定的蛋白质药物制剂提供了一种有效的制备方法。 采用冷冻干燥技术有利于维持疫苗的活性和生物学特性，并尽可能延长有效期。 冻干后的蛋白质药物呈疏松状饼块样，不仅有利于保存，而且有利于药物重溶后蛋白质复性。 然而冻干过程是一个复杂的相变过程，在冻结、冻融、干燥和储存过程中，存在着多种诱导药物变性的因素，冻干过程中也会对生物活性物质造成损伤，导致活菌/毒减少、效价降低、溶解度下降等，故常需要用一些保护剂来稳定处方中的蛋白质。 一个优良的蛋白质保护剂，不仅能够在整个过程中对蛋白质药物起到良好的保护作用，而且能够对成品贮藏期内蛋白质药物的变性起到抑制作用。

1.冷冻保护剂

可使制品在冷冻时不形成晶体，保持无定型状态，保护活性物质免受晶体所形成的应力作用而变形失活。 牛血清白蛋白、聚乙二醇、氯化钙等均是良好的冷冻保护剂。

2.干燥保护剂

可保护蛋白质在干燥时不因失水而改变二级或三级结构。 而这些改变将会使蛋白质失去了原有的立体结构，发生变性而沉淀。 葡萄糖、麦芽糊精、山梨醇加明胶等均是良好的干燥保护剂。

有许多糖类化合物如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和葡聚糖等，既是冷冻保护剂又是干燥保护剂。

（六）防腐剂

防腐剂是指用于抑制无生命有机物内的微生物，防止其腐败的化学物质。 疫苗类生物制品在制造过程中为了脱毒、灭活，或为避免在储运期间微量污染的细菌繁殖，保证制品使用安全，需加入适宜的防腐剂，这是国际上通用的做法。 生物制品的防腐剂的选用应以抑菌作用强，性能稳定，对制品质量无损害，对人体毒性低为原则。 目前常用的防腐剂有：硫柳汞、二苯氧乙醇等。

《中华人民共和国药典（2020年版）》中明确规定：应尽可能避免在中间品和成品中添加防腐剂，尤其是含汞类的防腐剂。 注射用冻干制剂和单剂量注射液中不得添加任何防腐剂，静脉注射液不得添加任何防腐剂。 对于多人份制剂，根据使用时可能发生的污染与开盖后推荐的最长使用时间来判断是否使用防腐剂。 如需使用防腐剂，应进行抑菌能力的研究，应在有效抑菌范围内采用最小加量，并考虑定量测定各成分或防腐剂残余量控制限度。

1.硫柳汞

别名硫汞柳酸钠，是一种含汞的有机化合物，应用已有几十年的历史，主要为预防单瓶多剂量生物制品在开瓶使用过程中微生物污染所致的潜在危害，也用于生产过程中间产品的防腐，是目前国内外使用最普遍的一种生物制品防腐剂，许多灭活疫苗、类毒素和一些血液制品都用其作为防腐剂使用。

硫柳汞为广谱抑菌剂，对革兰阳性菌和阴性菌都有很强的抑菌力，而且其对革兰阳性细菌抑菌作用比对阴性细菌更强。 硫柳汞在酸性条件下具有杀菌活性，在碱性或中性条件下具有抑制细菌和真菌活性。 对于能形成芽孢的细菌无任何作用。 其作用机制为重金属离子与菌体中酶蛋白的巯基结合而使酶失去活性。 极低（0.01%）浓度的硫柳汞对人体毒性很低，对疫苗抗原和血清蛋白损害很弱。 与硫柳汞相关的不良反应报道，最多的是过敏反应。世界卫生组织强调，接种疫苗是预防许多疾病的重要手段，疫苗中硫柳汞的不良反应与疾病的危害相比，仍是极其轻微的，因此，世界卫生组织支持继续使用现有疫苗，同时希望各国加紧研制无防腐剂疫苗和联合疫苗，尽可能减少儿童汞接触量，确保儿童健康。

2.2-苯氧乙醇

毒性较低，LD50（半数致死量）大鼠口服约为3 000mg/kg，小鼠口服约为4 000mg/kg，在化学上对铜及铅并不活跃，是在进口疫苗中常用的防腐剂，替代硫柳汞。

（七）抗生素

生物制品生产的大规模细胞培养中允许加入一定剂量的抗生素以抑制可能存在的微量细菌污染。 原则上预防用疫苗在生产过程中不得添加青霉素或其他β 内酰胺类抗生素，应选择对活细胞无毒性、对人体安全的抗生素。 可用庆大霉素、卡那霉素、新霉素等，其质量要求应不低于药用级所用抗生素。

在生物制品生产过程可以通过纯化、超滤等工艺将抗生素去除，在成品中严格控制疫苗中抗生素的残留，建立相应的检测方法确保抗生素残留量符合要求。

（中国食品药品检定研究院　叶强　马霄　范行良　王佑春）