第二节　始基卵泡发生与发育

卵泡是卵巢的基本结构和功能单位，由位于中间的卵母细胞及围绕在其周围的颗粒细胞和膜细胞组成。始基卵泡是卵泡发育的起点，始基卵泡的形成是卵巢中体细胞（随后的颗粒细胞）侵入生殖细胞合胞体，包绕单个停留在减数第一次分裂双线期的卵母细胞，从而形成卵泡的过程。始基卵泡的形成过程中有多种细胞及小分子的参与和相互作用。在人类，始基卵泡在女性胚胎妊娠早期就开始生成，直到出生后。总体而言，始基卵泡有三种不同的命运，即保持静止、凋亡闭锁及生长发育。

卵泡发育（follicles development）是指始基卵泡被激活，进入生长状态，依次形成初级卵泡、次级卵泡再到三级卵泡，并最终成熟的过程。并且这个过程受到包括生长因子等在内的多种小分子的调控，通过不同的信号通路，维持卵泡池的稳定及发育。

一、始基卵泡的生长过程

哺乳动物卵巢由生殖细胞和多种体细胞组成，其中，卵泡（follicles）是卵巢的基本结构和功能单位。卵泡由一个处于不同发育阶段的卵母细胞以及围绕着卵母细胞的体细胞构成，后者主要包括颗粒细胞（granulosa cells，GCs）和膜细胞（theca cells，TCs）。在卵泡中，卵母细胞及其周围的颗粒细胞和膜细胞相互作用，并在适当的外来分子的作用下共同维持卵泡的持续存在与生长发育。卵母细胞的存在可以预防卵泡的黄素化，也可影响颗粒细胞及膜细胞的包括甾体类激素在内的多种因子的生成并诱发细胞的增殖分化。反过来，颗粒细胞和膜细胞也可以接受外界及卵母细胞的信息，通过自分泌和旁分泌等作用维持卵母细胞的形态功能，以及促进其生长。

随着对卵泡生长发育的不断深入研究，目前多根据卵泡的大小，将其分为始基卵泡（primordial follicles）、中间卵泡（intermediary follicles）、初级卵泡（primary follicles）、次级卵泡（secondary follicles）、三级卵泡（tertiary follicles）及成熟卵泡（mature follicles）。而根据卵泡中是否有卵泡腔（antrum），又可将卵泡分为窦前卵泡（preantrum follicles）和窦卵泡（antrum follicles），前者包括始基卵泡到次级卵泡的过程，后者则包括三级卵泡与成熟卵泡。经典研究认为，窦前卵泡的生长阶段是非促性腺激素依赖性的，窦卵泡的生长发育直至排卵过程依赖促性腺激素的作用（图2-1）。

始基卵泡也称原始卵泡，包括一个停留在减数第一次分裂前期双线期的卵母细胞和包绕着它的单层扁平的颗粒细胞。在人类，始基卵泡在女性胚胎妊娠15~22周开始形成直至出生后。而在啮齿动物中，始基卵泡的发生主要在出生后的前几天，兔在出生后十天左右。始基卵泡体积小、数目多，女性胎儿出生时，卵巢中始基卵泡的数量大约有1×106~2×106，大部分位于卵巢浅层皮质。

始基卵泡直径约20~35μm，没有明显的种间差异。停留在双线期的卵母细胞位于卵泡的中央，呈圆形，细胞核大而圆，核仁明显，染色质较细且着色浅，胞质呈嗜酸性。

此阶段围绕在卵母细胞周围的颗粒细胞称为始基卵泡颗粒细胞（primordial follicle granulose cells，pfGCs），也称前颗粒细胞（pregranulosa cells，pGCs）。始基卵泡颗粒细胞较小，呈扁平状，与其周围的结缔组织之间有薄层的基膜。不同物种始基卵泡里，围绕着初级卵母细胞的颗粒细胞数目有较大差异，如啮齿动物约10个、绵羊约28个、人类约13个。前颗粒细胞来源于卵巢表面的上皮样间皮，同一个卵泡周围的颗粒细胞群为寡克隆来源。颗粒细胞无直接血供，从而形成一个相对的血-卵泡屏障（blood follicle barrier），可以限制细胞及大分子物质进入卵泡中。颗粒细胞在卵泡的生长过程中对卵母细胞具有支持、营养和一定的调节作用。而反过来，颗粒细胞自身的增殖与分化也受到卵母细胞及多种小分子的调控，包括促性腺激素、生长因子（如表皮生长因子、胰岛素样生长因子）等，在颗粒细胞的表面也发现了对应的受体。值得一提的是，在发育到窦卵泡之前，颗粒细胞的功能被认为是非促性腺激素依赖性的，其增殖分化主要依赖于生长因子。卵泡发育至窦卵泡时期，颗粒细胞开始在FSH的作用下分泌雌激素，至排卵前阶段，颗粒细胞则获得在LH作用下分泌孕激素的能力。

卵母细胞和周围的颗粒细胞相互交流与作用、共同生长和成熟，形成功能有序的整体单位。在卵泡中，颗粒细胞之间、颗粒细胞与卵母细胞之间，存在大量的缝隙连接（gap junction），这些缝隙连接的存在便于卵泡中细胞之间的小分子物质交换（如葡萄糖、氨基酸等）和信息传递，对卵泡的形成、生长、闭锁，以及卵母细胞减数分裂的停滞与启动等具有重要意义。缝隙连接由连接蛋白（connexin）组成，哺乳动物卵泡中最重要的是连接蛋白-37（Cx-37）和连接蛋白-43（Cx-43）两种。其中Cx-37主要存在于卵母细胞中，Cx-43主要存在于颗粒细胞中，因此颗粒细胞之间的交流依靠的是同源的连接蛋白复合体，而颗粒细胞与卵母细胞之间的则是异源的。研究发现在Cx-37基因敲除的小鼠中，卵泡发育在窦前期停滞，卵母细胞发育停滞，无法恢复减数分裂。而Cx-43基因缺失或抑制的小鼠则表现为卵母细胞数目减少，颗粒细胞增殖障碍，以及受孕能力的减弱。颗粒细胞间的缝隙连接受促性腺激素的影响，FSH在促进颗粒细胞增殖的同时也会促进Cx-43的表达，排卵前的LH则抑制Cx-43，导致颗粒细胞之间、颗粒细胞与卵母细胞之间的连接网络解体，有助于排卵的发生。

二、始基卵泡生成后的三种不同命运

始基卵泡生成之后，总体有三种不同的命运，分别是：

1.终身保持静止状态，不生长也不被募集与选择，其意义是维持始基卵泡池的稳定及女性的卵巢储备能力。

2.在女性胚胎期及生长发育过程中，直接由静止期的卵泡进入凋亡过程及闭锁状态，这类卵泡的存在促进了女性生殖能力的老化。

3.仅有非常小的一部分始基卵泡被多种生长因子及激素类物质激活，进入生长状态，生长为初级卵泡、次级卵泡，甚至有可能被募集、选择与优势化而完成排卵的过程。始基卵泡的这三种命运转归，保持静止、凋亡闭锁及继续发育之间的平衡对于卵巢功能及女性生殖能力的维持具有至关重要的意义。

三、活化发育的调节机制

（一）神经、内分泌及局部调节因子的介绍

雌性哺乳动物的每个月经周期都会有一批始基卵泡被激活并开始生长，然而相对整个始基卵泡池，被激活的卵泡只是很小一部分。始基卵泡被激活的过程是通过神经-内分泌作用，以及卵母细胞和颗粒细胞的自分泌及旁分泌作用实现的，该过程受多种因素的调控，包括神经因子、内分泌因子（促性腺激素等）及卵巢局部的小分子（类固醇激素、生长因子和细胞因子等）。

1.神经源性因子

卵巢中最先启动生长的卵泡往往是位于卵巢皮质并且紧邻卵巢门处的始基卵泡，有学者通过动物实验发现，卵巢门处有丰富的血管与神经末梢，此处的始基卵泡可以优先接触到大量的神经递质，如血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptides，VIP），可以通过诱导颗粒细胞内cAMP的大量生成，后者增强KitL相关基因的转录，使颗粒细胞分泌大量的KitL与位于卵母细胞表面的c-kit受体结合，激活卵母细胞，从而启动静止期始基卵泡的生长。除血管活性肠肽外，还有大量的神经递质及神经营养因子被证明对于激活始基卵泡的生长有一定的作用，包括神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经营养素 -4（neutrophin-4）等，既可以促进神经纤维在卵巢内的生长，其本身也具有一定的激活始基卵泡的作用。有学者将新生雌性小鼠的交感神经切除，发现其卵泡发育不良及甾体类激素分泌下降。因此，有理由认为，多种神经源性的营养因子及神经递质在始基卵泡启动生长的过程中发挥作用。而具体的作用机制还有待进一步的探究。

2.生长因子

卵巢中存在着多种生长因子（growth factor，GF），在卵巢多种生理过程中发挥作用。生长因子是由不同细胞分泌的小分子多肽，大多全身各处都有分布，也有部分生长因子由卵泡分泌。对始基卵泡生长发育有作用的生长因子主要包括表皮生长因子类（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子超家族（transforming growth factor，TGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、生长激素（growth hormone，GH）、成纤维细胞生长因子 2（fibroblast growth factor 2，FGF2）、角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）等。研究发现在始基卵泡发育的过程中，颗粒细胞生长的启动先于卵母细胞本身，因此认为颗粒细胞的生长和分化对于始基卵泡的激活起到关键的作用。

3.Kit Ligand/c-kit

Kit Ligand（KitL）是第一个被发现的可促进卵泡生长与发育的生长因子，在卵泡的多个过程中起重要作用，包括原始生殖细胞的生成、始基卵泡的激活、卵母细胞的生长、颗粒细胞增殖分化及防止卵泡闭锁等过程。KitL由颗粒细胞合成，通常有KitL1与KitL2两种形式，前者通常为可溶型，后者多为膜结合型，两者作用相似。KitL可与位于卵母细胞表面的受体c-kit结合而发挥作用，c-kit属于酪氨酸激酶受体。卵巢组织培养的实验表明，向培养液中加入KitL后，始基卵泡被激活进入生长的比率明显高于对照组，而加入c-kit抗体以后，又有大量始基卵泡停滞在静止阶段，被激活的数量下降，说明KitL与c-kit的结合可以有效地促进始基卵泡的生长。此外，有学者已经证明KitL与c-kit是通过激活酪氨酸激酶受体下游的蛋白激酶C及MEK通路实现的。

EGF可由卵巢自身分泌，可以使静止期始基卵泡的颗粒细胞表达PCNA，促进其增殖和分化，进一步可促进启动始基卵泡的生长和分泌类固醇激素。因此，EGF被认为是可以调节卵泡生长的重要分子。

IGF家族包括IGF蛋白及6种IGF结合蛋白（IGF-binding protein，IGFBP）。IGF的作用受其结合蛋白的调控，研究证实这6种IGFBP中有5种在人的卵巢中有表达。IGF-Ⅰ由颗粒细胞或卵巢外的体细胞分泌。在IGF-Ⅰ基因敲除的小鼠卵巢中，卵泡在窦前阶段停滞发育。但是学者认为IGF-Ⅰ在卵泡形成与早期发育的过程中的重要性不如IGF-Ⅱ。IGF-ⅡmRNA被发现在所有发育阶段卵泡的卵母细胞中高表达。并且不同于IGF-Ⅰ，女性的卵泡膜细胞及颗粒细胞均可表达IGF-Ⅱ。始基卵泡及窦前卵泡中的卵母细胞表面存在IGF的Ⅰ型和Ⅱ型受体，可与两类IGF结合，通过不同的信号转导途径，激活抗凋亡基因，促进颗粒细胞的增殖和卵母细胞的生长，启动卵泡的生长。IGFBP在初级卵泡和次级卵泡中大量表达，而在窦前卵泡及排卵前卵泡中则显著减少。IGFBP也可与IGF结合，介导抑制信号，可抑制IGF的生物活性，因此认为IGFBP在早期卵泡的生长中主要起到减慢生长速率、维持卵泡池稳定的作用。

TGF-β超家族是一组功能不同、结构相关的分泌性异二聚体蛋白。由33个基因所编码，包括TGF-β、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）和激活素/抑制素（activins/inhibins）三大类。广泛存在于体内各种组织器官中，在机体生长发育、物质代谢等多方面具有重要作用。TGF-β超家族中的各个成员在功能上可由一定的重复及协同，互相之间也有调节的作用。与始基卵泡生长发育相关的TGF-β超家族成员包括GDF-9、BMP15、抑制素、激活素及抗米勒管激素等。

GDF-9和BMP-15被认为是TGF-β超家族中对卵泡发育影响最大的因子之一，两者在结构与功能上都十分相似。GDF-9和BMP-15均由卵泡中的卵母细胞在卵泡发育的整个过程中分泌，可以调节颗粒细胞的功能（如调节甾体类激素的分泌）、启动始基卵泡的生长并促进卵泡在不同阶段的发育以及最终的成熟，甚至在排卵、受精及黄素化过程中有着不可替代的作用。GDF-9是第一个被发现的调剂卵泡中多种关键分子作用的卵母细胞特异性分子，通过旁分泌的方式对早期卵泡的激活与生长发挥作用。在GDF-9基因缺失的小鼠模型中，始基卵泡的生成无异常，但卵泡停滞在早期发育的各个阶段，并且颗粒细胞的增殖及随后卵泡膜细胞的生成受到明显的影响。在利用GDF-9对新生小鼠处理后，始基卵泡相比对照组大量减少，初级卵泡和次级卵泡增多，都说明GDF-9对始基卵泡生长的激活有作用，并可进一步影响随后卵泡的募集。BMP-15又称GDF-9β，可与GDF-9协同作用于颗粒细胞，促进后者的增殖分化，并可以刺激KITL基因的表达，共同对卵泡的生长及发育起到调剂的作用。实验证明，BMP-15基因敲除的小鼠出现排卵及受精障碍，并认为BMP-15在初级卵泡向次级卵泡发育的过程中有较为关键的作用。研究表明，GDF-9和BMP-15均可与位于颗粒细胞表面的骨形成蛋白受体-Ⅰ、Ⅱ作用，通过TGF-β经典的Smad信号通路而发挥作用。

抗米勒管激素（AMH），由次级卵泡、窦前卵泡和窦卵泡的颗粒细胞产生，在始基卵泡中没有表达，但可以对始基卵泡向初级卵泡的转化过程起到抑制的作用，是目前唯一一种对早期卵泡激活与生长进行负调节的分子。AMH敲除小鼠始基卵泡的形成与对照组无明显差异，但出生后大量始基卵泡迅速启动生长，成年鼠的卵巢内甚至看不到静止期的始基卵泡。此外，AMH可以负向调节哺乳动物卵巢中芳香化酶的活性，抑制雌激素的合成。AMH是实现卵泡之间相互调节的重要分子，生长期卵泡通过AMH对静止期卵泡进行负反馈调节，对卵泡池平衡的维持，以及随后优势卵泡的选择与成熟具有重要意义。

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）主要由始基卵泡、初级卵泡颗粒细胞及所有腔前卵泡的卵母细胞分泌，可与特异性糖蛋白130受体结合，通过JAK-STAT通路来调节体内多种组织细胞的生长、分化与凋亡。在卵泡的生长阶段，卵泡液中LIF含量相对其他时期最高。体内与体外实验均发现LIF可以在早期促进始基卵泡向初级卵泡的生长，并可以诱导KitL的表达，推测LIF是通过间接作用调节卵泡生长的。另外，有研究认为胰岛素的存在可以增强LIF在始基卵泡生长过程中的促进作用，具体机制还有待进一步研究。

碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）定位于哺乳动物始基卵泡及初级卵泡，主要在早期促进卵泡的生长。在人类，bFGF主要由卵母细胞合成分泌，通过旁分泌作用与颗粒细胞、膜细胞表面的受体结合，参与卵泡生长中多个过程的调控，包括调节颗粒细胞的有丝分裂、甾体类激素的合成等。实验发现bFGF具有与KitL相似的作用，可大幅减少静止期的始基卵泡，增加生长中卵泡的比率，因此被认为是激活始基卵泡生长的分子之一，与KitL具有协同作用。

角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）属于成纤维细胞生长因子的一种（FGF7），由卵巢中的早期卵泡周围部分间质细胞（即早期被募集的前体膜细胞）以及窦卵泡的膜细胞合成，是一种28kDa的有丝分裂原，其受体为FGF受体的一种。KGF可与早期卵泡中在生长中的颗粒细胞相互作用，促进后者的增殖，并可以显著促进始基卵泡向初级卵泡的生长。

（二）涉及的通路介绍

静止期始基卵泡的激活包括始基卵泡颗粒细胞的增殖分化及静止的卵母细胞进入生长状态，颗粒细胞数目增多，形态由扁平状变为立方状。而卵母细胞不仅是体积的改变，多数研究认为其本身也对卵泡整体启动生长的过程有关键作用。以下介绍始基卵泡激活过程中卵母细胞内的调节通路。

1.PI3K信号通路

PI3K信号通路是目前为止关于始基卵泡激活过程中研究最多的信号通路。其主要过程是PI3K-PTEN-AKT，最终底物是叉头蛋白O3（FOXO3）。PTEN是PI3K的负反馈调节因子，可以抑制此通路的活性，Pten缺失的小鼠卵泡中卵母细胞过度并持续生长。FOXO3属于叉头转录因子超家族，是第一个被发现的PI3K作用靶点，可以调节始基卵泡生长的激活。研究表明在Foxo3基因缺失的小鼠，所有静止期的卵泡均会在青春期进入生长，而Foxo3基因过表达时，卵巢储备则一直被维持在稳定状态，成年至老年鼠卵巢内依然存在大量始基卵泡，远远超过对照组。因此认为，FOXO3是一种维持卵泡静止状态的转录因子，PI3K-PTEN-AKT-FOXO3信号通路在调节始基卵泡激活过程中有重要意义，主要是通过负向作用、抑制激活、维持静止而实现的。

2.mTORC1信号

mTORC1是一种序列保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，主要是在生长因子的作用下，调节机体多种细胞的生长和代谢过程，包括蛋白合成、核糖体生成调节等。在静止期的始基卵泡中，过表达的mTORC1及其下游蛋白可以促使卵泡的过度激活。而随后的研究发现，敲除mTORC1下游的蛋白则对始基卵泡的生长没有明显影响。目前认为mTORC1信号可以促进卵泡的激活，但对这一过程并不是必需的。

3.p27-CDK系统

p27蛋白是一种细胞周期的抑制蛋白，属于CDK抑制物的Kip家族，存在于静止的卵母细胞核中，对于维持始基卵泡的静止状态有重要意义。在对其他细胞的研究中发现，p27蛋白也受PI3K信号通路的调节，在卵母细胞中也发现，p27蛋白与FOXO3的表达无明显的相关性，但同时敲除p27和Foxo3基因则会导致始基卵泡大量快速的激活与生长，认为p27-CDK系统和PI3K信号通路在始基卵泡激活的调节过程中并非完全独立，具有协同作用。

4.其他

Nobox基因即新生卵巢Homebox基因（newborn ovary homebox gene，NOBOX），是最早报道的特异性表达于卵母细胞的调控始基卵泡激活的基因。随后发现在卵巢中，无论是原始生殖细胞还是静止期、生长中卵泡的卵母细胞中，都发现有Nobox的表达。Nobox缺失小鼠卵泡的生成正常但生长严重受影响，并发现Foxo3基因的下调，被认为是FOXO3及PI3K通路的调节因子。其他研究发现，Nobox敲除后多种卵母细胞基因的表达都受影响，包括Gdf9、Bmp15等。因此，Nobox基因可以通过直接或间接的途径调节卵泡的生长。Sohlh1（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix 1）为另一种生殖细胞特异性的可以调节静止卵泡激活的基因，具有上调Nobox基因的作用。Sohlh1基因缺失的小鼠不能完成始基卵泡到初级卵泡的生长过程。另外，有研究发现WT1、pRb、myc基因等也参与了这个过程的调控。