第二节　紫外-可见分光光度计

紫外-可见分光光度计（ultraviolet-visible spectrophotometer）的型号很多，应用广泛。仪器的基本组成可分为光源、单色器、吸收池、检测器、显示系统等五个部分。分光光度计的类型一般根据仪器的结构分为单光束紫外-可见分光光度计、双光束紫外-可见分光光度计、双波长紫外-可见分光光度计等类型。

一、单光束紫外-可见分光光度计

单光束紫外-可见分光光度计的光学系统示意图如图7-2所示。此类仪器只有一束单色光、一个吸收池、一个光电转换元件。从单色器出来的单色光进入吸收池后，透射出来的光进入检测器被检测，所得的电信号经放大后由显示系统显示出来。单光束紫外-可见分光光度计受光源稳定性影响较大，再者杂散光、光度噪声、光谱带宽等对其测定也有影响，因此，分析测定误差较大。

二、双光束紫外-可见分光光度计

双光束紫外-可见分光光度计的光学系统示意图如图7-3所示。由图看出，此类仪器有两个单色器、两个吸收池、一个光电转换元件。从单色器出来的一束单色光通过切光器分解为两束强度相同的光束，交替通过参比池及样品池，其透过光又通过切光器交替照到同一检测器上，然后检测器在不同的瞬间接收和处理参比信号和样品信号，其信号差再通过对数转换变为吸光度，由显示系统显示出来。双光束分光光度计能消除光源强度变化对分析的影响，准确度较高。

三、双波长紫外-可见分光光度计

双波长紫外-可见分光光度计的光学系统示意图如图7-4所示。双波长分光光度计装有两个单色器，光源发出的光被分成两束光，分别经过两个单色器，得到两个波长的单色光，经切光器控制，交替通过同一个装有待测溶液的吸收池，测得待测溶液对两个波长单色光的吸光度差。由于不用参比溶液，因此可以消除因吸收池不匹配及参比溶液与样品溶液基体差异等造成的误差。

四、仪器技术指标的测试方法与仪器评价

（一）仪器技术指标的测试方法

紫外-可见分光光度计的稳定可靠与仪器的技术指标密切相关，在实际工作中，须对新安装仪器的主要技术指标进行全面检测，对已使用过的仪器，也要定期检测其技术指标，以保证仪器在最佳状态下运行。

1.波长准确度

（1）波长准确度的表示方法：

波长准确度是指仪器波长指示器上所指示的波长值与实际输出的波长值间的符合程度，用波长的实际测定值与理论值的差值表示。波长误差主要取决于仪器设计制造误差及仪器搬动后使波长装置部件与出射狭缝间的相对位置发生变化引起的误差，对定性、定量结果影响较大。

（2）波长准确度的测定方法：

波长准确度的测量方法较多，常用的是低压汞灯发射线法和稀土玻璃（如镨钕玻璃、钬玻璃）检查法等。

1）低压汞灯发射线法：

将仪器预热到正常工作温度后，保持室温在一定范围，将汞灯置于靠近单色器的入射狭缝处并将狭缝调至最小，使弧光形成一直线聚焦于入射狭缝，以最慢速度扫描，全部测量按仪器正常扫描方式进行，读出最大透光度波长，依顺序逐一核对谱带的位置。最常用的谱线是579.0nm、576.9nm、546.1nm、435.8nm、404.5nm、364.9nm、253.7nm。对光栅分光光度计，全波段的波长误差一般不应超过±1nm；对棱镜分光光度计，低于400nm时，不大于±1nm，高于400nm时，不大于±2nm，如果超过上述指标，应按说明书规定步骤进行校正。

2）镨钕玻璃检查法：

在可见光区校正波长最简便的方法是绘制镨钕玻璃吸收光谱，如图7-5所示，通常采用573nm和586nm的双峰谱线进行波长校正。

2.光度准确度

（1）光度准确度的表示方法：

光度准确度（photometric accuracy）用吸光度准确度（ΔA）或透射比准确度（ΔT）表示。国际上绝大多数国家用吸光度的准确度表示，是指标准样品在λ_max处吸光度的测定值与真值之间的偏差。偏差越小，准确度越高。

（2）光度准确度的测定方法：

选用纯度高、稳定性好的物质作为测试光度准确度的材料，最常用的是铬酸钾（K₂CrO₄，一般在碱性溶液中）、重铬酸钾（K₂Cr₂O₇，一般在酸性溶液中）、硝酸钾、中性滤光片等，其中以铬酸钾溶液应用最普遍。在25℃时，把0.040g铬酸钾溶解在1L 0.05mol/L KOH溶液中，将该溶液盛放在1cm的吸收池内，测定其在不同波长下的吸光度，结果列于表7-1。注意若溶液中含杂质，则对吸光度有影响。这种校正方法适用于紫外-可见光区。

3.光度重复性

（1）光度重复性的表示方法：

光度重复性又称光度精密度，指多次测量（一般3～5次）中的最大值与最小值之差。光度重复性反映紫外-可见分光光度计分析测试结果的可靠性。

（2）光度重复性的测定方法：

仪器冷态开机（即关机后2小时后开机），预热0.5小时，由同一操作者对选择的一个标准样品或自选的其他样品进行光谱扫描3～5次，然后在图谱上选择几个特征吸收峰，计算各峰值的最大值与最小值之差，其中最大的峰-峰差值代表仪器的光度重复性。人们常常将光度准确度和光度重复性的测定在一次操作中完成。

4.杂散光

（1）杂散光的表示方法：

杂散光是指在给定波长的接收光线中混杂有不属于入射线光束或通带外部的光线。杂散光的影响会使分析测试的结果偏离Lambert-Beer定律。当杂散光被试样吸收时，偏离为正值（测量值大于真实值）。当杂散光不被试样吸收时，偏离为负值（测量值小于真实值）。另外，杂散光的影响还与吸光度大小有关。

（2）杂散光的测定方法：

一般采用截止滤光法，选用滤光片或滤光液测定杂散光。其测试方法是：仪器冷态开机，预热0.5小时，如用滤光片法测定，则参比为空气；如用滤光液NaI、NaNO₂水溶液测试，则参比溶液为蒸馏水。设置仪器的横坐标为波长（nm），纵坐标为T%。

测试220nm处的杂光时，国际上采用10g/L的NaI水溶液。该水溶液的光谱特性为：0～258nm处不透光，而从258nm开始，透光率可立即达到90%以上，并且上升坡度很陡。将仪器的波长调到220nm时，仪器的输出应该为0。若仪器有光信号输出，说明220nm处有杂散光。

测试340nm处的杂散光时，国际上采用50g/L NaNO₂水溶液。50g/L NaNO₂水溶液的光谱特征为：0～385nm处不透光，而从385nm处开始，透光率可达90%以上，并且上升坡度很陡。将仪器的波长调到340nm时，仪器的输出应该为0，若仪器有光信号输出，这就是340nm的杂散光。

5.光度噪声

（1）光度噪声的表示方法：

光度噪声是仪器的一种随时间而变化、但又是随机的输出信号。它是紫外可见分光光度计分析误差的主要来源之一，直接影响仪器的信噪比和检出限。目前国际上采用吸光度和透射比表示光度噪声。

（2）光度噪声的测定方法：

目前国际上的测试方法是：仪器冷态开机，预热0.5小时后，试样和参比比色皿均为空气，设置吸光度为0、光谱带宽为2nm、波长为500nm。将仪器从长波到短波，进行1小时的时间扫描。在1小时内，任取10分钟的测试数据，求出峰-峰值，以10分钟内最大的峰-峰值作为500nm处的光度噪声。光度噪声的大小只影响仪器在500nm处的检测下限，它主要作为评价仪器好坏的依据之一。目前国际上高档的紫外-可见分光光度计的光度噪声（吸光度峰-峰值）为±0.0002。

6.基线平直度

（1）基线平直度的表示方法：

基线平直度是指仪器在全波长范围内每个波长上的噪声，用最大的峰-峰值表示。

（2）基线平直度的测定方法：

目前国际上对紫外可见分光光度计的基线平直度的测试方法一般是冷态开机，预热0.5小时后，试样和参比比色皿均为空气，光谱带宽为2nm，吸光度值为0，从长波向短波方向对仪器进行全波长慢速（或中速）扫描。而后，在全波长范围内，找出峰-峰值中最大的一点，作为该仪器的基线平直度。基线平直度限制了仪器实际可使用的波长范围，影响仪器波长范围内的检测下限，在低浓度测定时是分析误差的主要来源。

7.光谱带宽

（1）光谱带宽的表示方法：

光谱带宽（spectral band width）以从单色器射出的单色光（实际上是一条光谱带）最大强度的1/2处的谱带宽度表示。它与狭缝宽度、分光元件、准直镜的焦距有关。

（2）光谱带宽的测试方法：

目前国际上对光谱带宽的测试方法一般采用谱线轮廓法。选用某些光源的特征光谱，对其进行光谱扫描，绘出该谱线的轮廓，其半高峰宽度即为光谱带宽。

用于光谱带宽测试的光源一般为线光谱光源。并且要求它在离被测的谱线附近20nm的范围内最好没有其他谱线。一般紫外可见分光光度计的制造者在测试仪器的光谱带宽时，多选用Hg灯；因为它的546.1nm、253.7nm等特征线在其前后20nm以内，都没有其他谱线，是紫外可见分光光度计光谱带宽测试最好的光源。

8.稳定性

一般用基线漂移和光度重复性表示。基线漂移测定法：仪器开机预热30分钟后，设置仪器的参数分别为试样和参比比色皿均为空气，吸光度为0，光谱带宽为2nm，扫描方式为时间扫描，连续测试30分钟；取30分钟内吸光度的最大与最小值之差为基线漂移。光度重复性的测定方法同“3”所述。

（二）仪器的评价

紫外-可见分光光度计是分析仪器的重要组成部分，是使用最多、覆盖面最广的一类分析仪器，目前已是光、机、电、计算机四位一体的技术密集型高科技产品，型号很多。评价和选择一台紫外-可见分光光度计主要从其适用性、可靠性、智能性、经济性、美学性、工艺性等方面考虑。

1.适用性

紫外-可见分光光度计的适用性就是指仪器能满足使用要求的程度。仪器的技术指标决定其使用性。如在一般的相对测量的定量分析中，仪器的波长准确度就不是很重要，而在发表研究论文、对试样进行比较测定时，波长准确度就很重要，以便重复。光度噪声限制分析测定的下限，当仪器的噪声一定时，被分析试样的浓度越低，测定的误差就越大。因此，对于检测试样的浓度比较低的领域应选择噪声小的仪器。对光谱带宽有明确要求（如药检行业要求光谱带宽在2nm以下）的行业，应选择光谱带宽可调的仪器。

2.可靠性

仪器的可靠性通过光度准确度、故障率及稳定性等几方面进行评价。光度准确度是仪器可靠性的重要内容，应重点考察。仪器的故障率越小越好，但仪器的电子元器件不能无限期使用而不出故障，所以仪器使用到一定年限是会出故障的。仪器性能的稳定期一般为8年左右，使用年限较长久的仪器要进行检验和维修。稳定性通过基线漂移指标反映，基线漂移越小，稳定性越好。

3.智能性

指紫外-可见分光光度计的自动化程度。一些高档的仪器，自动化程度很高，仪器开机、自检、数据处理、结果打印等全部由计算机完成。仪器开机后进行全方位的自检，一方面可及时发现故障，便于维修。另一方面，可保证仪器在最佳状态下工作，避免人为操作误差，保证分析测试结果的可靠性。因此，评价和选择紫外-可见分光光度计时，要重视仪器的智能性。

4.经济性

紫外-可见分光光度计的经济性是指仪器要物美价廉。通过性能价格比、功能价格比、使用成本价格比、质量价格比等进行综合考察评价仪器，要物美价廉，经济适用。