第3节　烧伤和脓毒症代谢紊乱机制初探

对严重烧伤和脓毒症中代谢紊乱的发生发展规律和相关机制的研究，大致可划分为糖、蛋白、脂类代谢的细胞和分子机制研究及其对机体整体代谢影响的分析等几个侧面。

一、骨骼肌“有氧糖酵解”

近年来的研究提示，烧伤和脓毒症中组织细胞存在糖酵解增强的现象。基于经典的糖代谢理论，有氧氧化的供能效率（38mol ATP/1mol葡萄糖）远高于糖酵解（2mol ATP/1mol葡萄糖），生物组织细胞在氧供充分的条件下总是利用有氧氧化代谢供能，而不利用低效的糖酵解供能方式。因此，通常认为，高乳酸血症的发生主要机制：①组织缺血缺氧导致糖酵解过程增强；②组织细胞功能紊乱，能量代谢机制障碍。然而，近年来有关脓毒症病理过程的深入研究提示：①脓毒症动物中，组织乳酸生成的增加先于组织缺氧的发生；②充分的复苏治疗，可以维持有效循环和足够的组织氧供，从而防止细胞缺氧，却无法避免高乳酸血症的发生；③应用核素示踪代谢底物监测法，磁共振光谱分析法等对烧伤及脓毒症动物细胞代谢过程的监测和分析显示，在烧伤休克及脓毒症状态下，组织细胞的线粒体功能及有氧氧化过程并无障碍。

据此提出有氧糖酵解的概念，即组织细胞在氧供充分的条件下依然存在糖酵解过程增强、乳酸产生量增加的病理生理状态。

在某些情况下，糖酵解增强有积极的病理意义。例如，创面组织细胞的糖酵解增强所导致的局部乳酸浓度升高是局部酸性环境产生和维持的重要因素，这一方面有利于控制细菌的生长和繁殖；另一方面可刺激胶原代谢，对组织修复和重塑有积极意义。

然而，对有氧糖酵解发生发展过程和机制的研究尚处于起步阶段。国内少见相关报道。国外有关领域的研究，已在多种病理过程导致的脓毒症中，观察到有氧糖酵解增强的现象；而目前研究的焦点则集中于对脓毒症状态糖代谢整体动力学的分析，而对糖代谢机制发生变化的细胞生理学基础研究则很少开展。

我们在这一领域开展了初步的研究。考虑到骨骼肌细胞在机体组织细胞中占有相当大的比重（40%），对机体整体代谢水平影响巨大，因此我们的研究主要以骨骼肌为对象。借助大鼠烧伤和脓毒症模型，建立肌肉的充分供氧离体孵育系统，选择含60%红肌纤维、30%中间肌纤维的比目鱼肌和含45%白肌、45%中间肌纤维的趾长伸肌，进行了较为系统的观察和分析。

1．严重烧伤、脓毒症时不同的肌纤维类型在“有氧糖酵解”中的特点

研究表明，两种骨骼肌在正常、烧伤后和脓毒症状态下，其有氧糖酵解的变化幅度有显著不同（图10-1、图10-2）。这提示不同的肌纤维具有各自不同的糖酵解特点。以红肌为主的比目鱼肌与以白肌为主的趾长伸肌相比，其有氧糖酵解水平偏低，烧伤后有氧糖酵解增强的幅度亦较小，而在脓毒症状态下，两种肌肉组织的有氧糖酵解则均有显著的增强。

2．严重烧伤、脓毒症时骨骼肌“有氧糖酵解”的发生机制

利用特异性Na＋-K＋-ATP酶抑制剂——毒毛旋花苷G，干预细胞膜钠钾泵的活性，观察细胞膜有关能量代谢状态的改变对正常及脓毒症大鼠的不同类型骨骼肌乳酸产生量的影响，结果提示，白肌纤维较多的趾长伸肌，不仅在正常状态下乳酸的产生量仍较比目鱼肌为多，而且对毒毛旋花苷G的反应性亦较为敏感（图10-3、图10-4）。

这提示与红肌纤维相比，白肌纤维的有氧糖酵解过程在其细胞生理活动中具有更为重要的意义。同时，脓毒症肌肉组织的乳酸产生量显著高于正常对照，而脓毒症对肌肉细胞有氧糖酵解的这种刺激作用能明显地被Na＋- K＋-ATP酶抑制剂所阻断。这表明Na＋-K＋-ATP酶活性的增加以及与之相关的细胞生理活动的增强是脓毒症刺激肌肉细胞有氧糖酵解增强的重要原因。

利用钠离子载体——莫能霉素（monensin）干预细胞内外的钠离子分布状态，我们分析和观察了细胞内钠离子浓度变化对正常及脓毒症大鼠的不同类型骨骼肌乳酸产生量的影响（表10-11、图10-5）。

研究显示，肌肉组织细胞膜Na＋通透性的改变以及细胞内Na＋浓度的增加可诱导肌肉组织有氧糖酵解过程的增强。这一机制在脓毒症所导致的肌肉组织有氧糖酵解过程的增强中有重要意义。同时，含白肌纤维较多的趾长伸肌对莫能霉素的敏感性高于比目鱼肌。而且，在正常孵育状态和高浓度的莫能霉素环境下，趾长伸肌的乳酸产生量均高于比目鱼肌。这提示白肌纤维的有氧糖酵解水平和潜力均高于红肌纤维（图10-6、图10-7）。

二、严重烧伤、脓毒症骨骼肌蛋白分解代谢的机制及意义

高代谢或高分解代谢是严重创伤、烧伤、大手术等应激病理状态下物质与能量代谢改变的显著特点，这种高分解代谢在脓毒症时具有“自噬性”和“强制性”特点，因为这种强烈的促体内蛋白分解，抑制糖和脂类利用的高代谢反应，可使机体迅速陷入负氮平衡和营养不良，导致并发症的发生。针对高度应激病理状态下的高分解代谢，临床上主要采取的措施是营养支持、促进合成代谢等，虽然这些措施改善了营养代谢状态，但在严重烧伤脓毒症状态下单纯支持、促合成措施有其片面性，临床效果往往不佳。随着研究的深入，人们逐渐意识到分解代谢在这一病理过程中的重要性，尤其是严重烧伤脓毒症等病理应激状态下的高分解代谢，特别是占机体细胞总重量50%的骨骼肌，可能对整体代谢产生深远影响。骨骼肌蛋白分解机制的阐明有可能使人们不仅仅认识到，氨基酸从骨骼肌蛋白中释放有益于急性期患者，提供机体用于糖异生、新蛋白合成和产生能量所必需的氨基酸，支持了重要器官的结构和功能等，同时更重要的是将有助于人们从理论上阐明，高度应激状态下骨骼肌蛋白高分解代谢的机制，以便于在疾病的某阶段进行干预或调控，获得降低其高分解消耗的“自噬性”和“强制性”突破性措施。

（一）骨骼肌蛋白高分解代谢的危害性

蛋白质是细胞组织的主要成分之一。正常的氮平衡是维持组织细胞生长、更新的前提。此外，体内有多种特殊功能的蛋白质，例如酶、多肽类激素、抗体和调节蛋白等。肌肉收缩、氧气运输、血液凝固等均由功能蛋白来实现。氨基酸代谢还可产生胺类、神经介质等含氮化合物。蛋白质降解成氨基酸后，经脱氨基作用生成的α-酮酸可以直接或间接参加三羧酸循环氧化分解、供能。一般来说，成人每日约有18%的能量来自蛋白质，但是供能是蛋白质的次要功能。严重烧伤和脓毒症早期，机体抗脂解激素的分泌导致脂类的利用受到限制。烧伤脓毒症时骨骼肌细胞内有氧糖酵解增强，蛋白降解率明显升高。这提示烧伤脓毒症时糖和脂类的供能利用远不能满足机体高代谢的需求。由于骨骼肌占机体细胞干重的50%以上，是机体最大的含氮库，如果大量的结构蛋白被分解供能，不仅导致负氮平衡，还会引发并发症。从目的论来讲骨骼肌的这种分解代谢反应在严重烧伤脓毒症早期对机体是有利的，如向重要器官提供了游离氨基酸，有利于机体保护性调节反应，如供肝脏合成急性期蛋白及糖异生，供给免疫系统细胞和肠上皮细胞大量谷氨酸以适应其需要量的明显增加等。但由于机体中没有供储备的蛋白质，所有蛋白均被认为是有功能的。骨骼肌分解代谢增强主要表现为肌纤维蛋白分解的增强，而单纯靠补充营养素并不能有效改善骨骼肌蛋白的高分解代谢。肌纤维蛋白的过度消耗，长期负氮平衡的后果是严重的。如果是四肢肌肉，尤其是小腿肌肉萎缩和消耗，静脉血栓形成和器官栓塞的危险性就会明显增加；患者的呼吸肌一旦受到影响，将会有肺部并发症的出现。事实上因严重肌肉蛋白分解代谢而死亡的患者，多是由于不能清除肺内分泌物和由此引发的肺部感染所致。既然骨骼肌蛋白分解代谢对机体整体代谢产生如此深远的影响，那么，是什么机制在控制着骨骼肌蛋白分解过程？影响因素是什么？这些基本问题的阐明将有助于临床采取措施调控骨骼肌蛋白高分解代谢。

（二）骨骼肌蛋白降解途径-泛素-蛋白酶体途径

骨骼肌细胞和其他机体细胞一样具有多种蛋白降解途径，如溶酶体蛋白降解途径、钙依赖蛋白酶（calpain）系统、泛素-蛋白酶体途径，但究竟是哪种途径在骨骼肌蛋白降解中占主导地位呢？新近的研究发现，将脓毒症动物骨骼肌孵育液中添加泛素-蛋白酶体能量依赖途径的ATP，结果是反映骨骼肌总蛋白降解率的酪氨酸（Tyr）增加了172%和反映骨骼肌肌纤维蛋白降解率的3-甲基组氨酸（3-MH）增加了4倍多；应用溶酶体的半胱氨酸酶抑制剂leupeptin和E64来阻断溶酶体蛋白降解途径后，骨骼肌蛋白降解率未见明显变化；应用钙依赖途径的抑制剂阻断钙依赖性途径后，骨骼肌蛋白降解率较对照组无差异。新近我们的研究也证实了抑制溶酶体蛋白降解途径和阻断钙依赖性蛋白降解途径后，骨骼肌蛋白降解率未见明显变化，相反，使用MG132阻断泛素-蛋白酶体途径后，骨骼肌蛋白降解率显著降低。以上研究结果表明脓毒症状态下骨骼肌蛋白降解增加可能不是经由溶酶体蛋白降解途径和钙依赖性途径介导，而是泛素-蛋白酶体途径。

泛素-蛋白酶体途径从发现至今已有20年的历史，其主要特点是高度选择性和能量依赖性。泛素-蛋白酶体途径由泛素（ubiquitin）、泛素相关酶、蛋白酶体和辅助酶四部分组成。泛素是泛素-蛋白酶体蛋白降解途径中重要的组成部分，由76个氨基酸残基组成的、相对分子质量约为8500的高度保守热稳定多肽，它存在于所有有核细胞中。相关酶包括泛素活化酶（ubiquitinactivating enzyme，E1）、泛素偶联酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2s）、泛素-蛋白连接酶E3s（ubiquitin-protein ligating enzymes）、泛素碳末端水解酶（ubiquitin-end hydrolysis）或异肽酶（isopeptidase）和蛋白酶体（proteasome）。E1是催化泛素与蛋白底物结合所需的第一个酶，细胞内含量丰富，为细胞的活性和生存所必需。E2s是泛素与蛋白底物结合所需的第二个酶，多数E2s为小相对分子质量蛋白质，E3s是泛素与蛋白底物结合所需的第三个酶。E3s在决定泛素介导底物蛋白降解的选择性方面具有重要意义。泛素碳末端水解酶或异肽酶能够使游离泛素再循环，对泛素系统的正常运行必不可少。20s蛋白酶体和26s蛋白酶体作为多亚基高相对分子质量复合体是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶。我们新近的研究结果显示，泛素-蛋白酶体途径在严重烧伤脓毒症骨骼肌蛋白高分解代谢过程中确实发生了变化，而其改变与严重烧伤脓毒症骨骼肌蛋白代谢有着本质的联系，并有多种因素调节着骨骼肌蛋白的高分解代谢过程。

（三）泛素-蛋白酶体途径在严重烧伤脓毒症骨骼肌蛋白降解中的作用

研究表明，肌细胞胞质很少，大部分由肌纤维蛋白构成，而肌纤维蛋白主要由肌动蛋白（actin）和肌凝蛋白（myosin）组成。3-甲基组氨酸（3-MH）是一种只存在于肌肉肌动蛋白和肌凝蛋白的氨基酸，释放产生的3-MH由于不再参与骨骼肌细胞新蛋白的合成，故其释放量可间接反映肌纤维蛋白的降解，而酪氨酸（tyrosine, Tyr）存在于肌细胞所有蛋白中，故其释放量可间接反映总蛋白的降解。我们新近的研究表明，烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症的大鼠，无论是反映骨骼肌总蛋白降解率的酪氨酸还是反映肌纤维蛋白降解率的三甲基组氨酸（3-MH），都较无烧伤组显著增加，尤其是肌纤维蛋白的降解率增加更显著。同时随着烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症伤情的加重，骨骼肌蛋白降解率增加更明显。有趣的是在上述3种动物模型情况下比目鱼肌总蛋白降解率和肌纤维蛋白降解率变化不明显。这与我们以往有关骨骼肌“有氧糖酵解”的研究结果是一致的。不同的肌纤维类型（比目鱼肌含60%的红肌纤维和30%中间肌纤维，趾长伸肌含45%白肌纤维和45%中间肌纤维）各有其不同的代谢特点。进一步的研究发现，在骨骼肌组织中Tyr和3-MH增加的同时，泛素2.4kb的mRNA表达上调，说明骨骼肌蛋白降解增强与泛素-蛋白酶体蛋白降解途径在转录水平被激活密切相关。我们所做的相关性分析亦证实，泛素mRNA表达增加与Tyr和3-MH增加量之间均呈显著正相关。

在另外一组实验中，我们专门研究了烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症大鼠泛素-蛋白酶体降解途径中重要组成成分泛素、E2-14K、RC2亚基转录表达，结果发现在上述3种不同病理状态下，①大鼠趾长伸肌组织泛素mRNA在2.4kb和1.2kb相对分子质量区域条带表达明显，尤以2.4kb条带泛素mRNA表达上调显著，烧伤组增加310%，脓毒症组增加470%，烧伤合并脓毒症组增加679%。提示伤情越重，泛素基因表达增强越显著。②E2-14kb含有2种mRNA片段，长度分别为1.8kb、1.2kb，两者起源于同一基因，只是碱基对和编码区不同，我们的研究结果显示，在烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症3种不同的刺激条件下，骨骼肌组织E2-14kb在1.2kb条带基因转录水平出现不同程度的表达增强。而1.8kb条带无明显变化。结果说明，在骨骼肌蛋白降解中，发生了某种基因转录失控，使1.2kb mRNA转录增多，以满足机体的需要，但其转录失控的确切机制和调控因子尚不清楚，两种转录片段的不同表达能否推断两者在骨骼肌蛋白降解中具有不同的功能还有待进一步研究。③20s蛋白酶体亚基RC2在烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症不同刺激条件下，大鼠骨骼肌组织中mRNA表达，均出现显著增强，其中烧伤组增加121%，脓毒症组增加168%。烧伤合并脓毒症组增加238%。20s蛋白酶体亚基RC2在转录水平的表达增强更进一步说明泛素-蛋白酶体途径参与烧伤，尤其是烧伤合并脓毒症时骨骼肌蛋白的降解，这为了解分解状态下骨骼肌蛋白高消耗的分子机制提供了证据。

游离泛素及泛素化蛋白在烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症大鼠趾长伸肌组织中均发生了不同程度的变化，如烧伤组游离泛素2h、6h、12h、24h分别增加15%、17%、33%、30%，泛素化蛋白分别增加46%、52%、186%、163%；脓毒症组2h、6h游离泛素分别增加21%、46%，12h和24h较对照组无明显差异。泛素化蛋白2h增加140%，6h增加240%，12h和24h泛素化蛋白较正常对照组无统计学意义。烧伤合并脓毒症组游离泛素分别增加45%、76%、38%、29%；泛素化蛋白分别增加191%、335%、168%、127%，提示在严重烧伤脓毒症几种病理状态下，泛素蛋白水平表达增强和流经该途径的底物蛋白也显著增加。

随着烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症伤情的加重，泛素蛋白在大鼠趾长伸肌胞质中淡黄色颗粒状泛素阳性物质异常分布越明显。这说明泛素-蛋白酶体途径中的泛素在骨骼肌组织中蛋白表达出现明显增加，结合与骨骼肌蛋白降解率增加间的关系，更进一步说明在烧伤、脓毒症、烧伤合并脓毒症状态下泛素-蛋白酶体途径在骨骼肌蛋白降解中具有重要作用。

（四）激活泛素-蛋白酶体途径导致骨骼肌蛋白降解增强中的调节因子

既往的研究表明，严重烧伤脓毒症时常伴有炎症介质的大量释放，是诱发高代谢的重要原因之一。参与调节骨骼肌蛋白分解代谢的细胞因子可能主要是IL-1、IL-6、TNF和糖皮质激素。

1．激素调节

临床观察显示，严重烧伤脓毒症患者外周血皮质醇浓度明显升高，24h尿内3-MH排出量显著增加，3-MH排出量与外周血皮质醇浓度变化呈显著正相关；股四头肌泛素-蛋白酶体组分mRNA表达显著增加，说明重症烧伤脓毒症患者体内糖皮质激素增加，从基因水平激活泛素-蛋白酶体途径，导致骨骼肌蛋白降解增强。我们在动物实验中也发现，烧伤后大鼠趾长伸肌总蛋白降解率明显增加，更以肌纤维蛋白为显著，泛素-蛋白酶体途径中的20s蛋白酶体亚基RC2mRNA表达上调，且与肌纤维蛋白降解率呈显著正相关。在另一组的研究中发现，烧伤后血浆糖皮质激素水平，与肌纤维蛋白降解率和RC2 mRNA表达呈高度正相关。进一步研究发现，地塞米松是通过糖皮质激素受体在基因水平增强泛素蛋白酶体途径活性的，从而导致严重烧伤、脓毒症大鼠骨骼肌总蛋白，特别是肌纤维蛋白降解增强，而给予糖皮质激素受体拮抗剂干预可有效阻断泛素-蛋白酶体多种组分的表达，同时可有效抑制骨骼肌蛋白降解率。这些研究结果说明，烧伤脓毒症时骨骼肌蛋白降解增强与泛素-蛋白酶体组分高表达有关，糖皮质激素参与了骨骼肌蛋白降解过程。

2．细胞因子调节

我们新近的研究结果表明，烧伤脓毒症大鼠趾长伸肌蛋白降解率与血浆内TNF-α浓度呈显著正相关，同时骨骼肌泛素组分2.4kb mRNA和C2 mRNA的表达均升高，而变化趋势与血浆TNF-α的含量变化趋势是一致的；TNF-α亦能使离体孵育骨骼肌泛素系统组分mRNA表达上调；静脉注射TNF-α骨骼肌重量减轻，蛋白降解增强，糖皮质激素受体拮抗剂可有效抑制骨骼肌蛋白降解。于体外培养的骨骼肌肌管中加于TNF-α，能显著增强骨骼肌蛋白降解率。而使用蛋白酶体抑制剂可显著降低骨骼肌蛋白降解率，这些研究结果说明，TNF-α能与骨骼肌细胞间接或直接发生作用，增强泛素蛋白降解途径的活性，参与骨骼肌蛋白降解过程。

最近的研究发现，泛素-蛋白酶体系统的活化与转录因子的活化有着密切关系。烧伤脓毒症状态下骨骼肌NF-κB活性明显增加，而使用NF-κB的抑制剂PDTC（二硫代氨基甲酸吡咯烷）可明显降低NF-κB在骨骼肌中的活性，与此同时骨骼肌总蛋白及纤维蛋白的降解率明显下降，说明通过使用NF-κB抑制剂确能起到调控脓毒症状态下骨骼肌蛋白分解代谢的作用，也说明炎症介质过度释放是导致烧伤脓毒症骨骼肌蛋白降解增强的重要原因。

3．治疗与研究展望

严重烧伤脓毒症状态下的骨骼肌高分解代谢，目前尚无一种有效的防治措施。单纯增加热量和蛋白供给并不能较好地改善负氮平衡，只是增加了尿中氮源性废物。给予生长激素、类胰岛素样生长因子等激素类治疗，尽管骨骼肌蛋白降解可减少，但同时有很多副作用。泛素-蛋白酶体途径研究的进展，使我们对骨骼肌消耗的分子机制有了较好了解，它是严重烧伤脓毒症时骨骼肌蛋白降解的重要途径。糖皮质激素、TNF等介质是直接或间接导致骨骼肌蛋白降解的重要诱导或调节因子。抑制炎症介质NF-κB途径可有效降低脓毒症状态下骨骼肌蛋白降解率。早期切除烧伤的焦痂导致泛素转录表达、蛋白表达下降，骨骼肌蛋白降解减少。应用泛素-蛋白酶体抑制剂可减少实验动物骨骼肌蛋白降解率，但其临床应用的可行性尚未得到证实。初步的研究结果说明，防治严重烧伤脓毒症状态下骨骼肌蛋白高分解消耗的有效方法，首先是消除其根源，防治脓毒症，即治病；其次是针对泛素-蛋白酶体途径的作用机制和调节机制进行调控，这将是减少机体骨骼肌蛋白高分解消耗的有效措施之一。

然而，有关泛素-蛋白酶体途径在严重烧伤脓毒症状态下骨骼肌蛋白降解中的作用研究尚处于探索阶段，仍有许多问题需要澄清。例如严重烧伤脓毒症状态下炎症介质是如何相互作用导致骨骼肌蛋白消耗，骨骼肌蛋白降解的分子机制中哪些蛋白被泛素化，具体识别机制是什么，这些蛋白与泛素偶联通过哪些具体酶的催化，泛素-蛋白偶联体如何被26s蛋白酶体识别、降解等问题还需广泛地研究。相信随着严重烧伤脓毒症状态下骨骼肌蛋白降解机制和调节机制研究的深入，这些问题都会找到答案。

（柴家科　吴焱秋　申传安）