第三章 单个细胞的制备
第一节 概述
流式细胞技术的主要检测对象是各种临床标本中的单个活细胞，因此从各种临床标本中分离制备单个分散的活细胞悬液是该技术的关键环节。
对于具体的临床流式细胞学检验项目、具体的组织标本，必须根据实际情况选择合适、有效的单细胞悬液的制备方法。合适、有效的单细胞悬液制备方法的衡量标准包括两个方面，即单细胞产量和细胞损伤程度，以获得的单细胞产量最高且细胞损伤程度最小为最好。实际工作中同时达到这两个目标较为困难，但是必须保证上机检验时，能够得到理想的细胞分析结果。
目前常用的单细胞悬液制备方法总体上包括以下几种类型。
一、物理学方法
（一）定义
物理学方法是指利用物理学处理措施从标本中获得单个分散的细胞样品的单细胞悬液制备方法，如网搓、剪碎、超声振荡等。
（二）适用范围
物理学方法适用于从幼稚的胚胎性组织、淋巴组织、造血组织、具有松散排列的组织器官的组织中制备单细胞悬液。
（三）注意事项
1.不同的组织选择具体的哪一种方法需要结合检验目的进行考虑。
2.物理学方法不适合用于从紧密连接性组织如皮肤、鳞状上皮的黏膜组织等制备单细胞悬液，因为物理法容易造成大量细胞损伤，使细胞黏附成团。
3.物理学方法常常造成严重的细胞损伤，细胞产量也较低，但是对收获细胞功能状态的影响较小。
二、酶学方法
（一）定义
酶学方法是指利用酶蛋白对组织细胞之间的连接进行消化降解，从组织标本中获得单个分散的细胞样品的单细胞悬液制备方法。酶蛋白对实体组织分散作用的原理主要包括以下3个方面：①酶蛋白可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②酶蛋白可以水解组织间的黏多糖物质；③酶蛋白可以水解组织细胞间紧密连接结构中的蛋白质成分。
（二）适用范围
酶学方法适合于人们对组织细胞之间连接机制具有明确认识，并能选择到适合消化降解其细胞连接物质的组织标本。
（三）注意事项
1.不同的组织标本采用不同的酶进行单细胞悬液的制备。
2.酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不会造成酶效价的降低。
3.要注意组织标本在酶消化液中的最佳消化时间。
4.要注意酶活性发挥的pH范围，尽量采用能够使酶活性达到最大的pH，切忌将酶置于失活pH环境，如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳。
5.注意酶的最佳使用浓度。
6.注意影响酶活性的其他因素，如室温等。
7.酶学方法对组织的分散解聚较理想，但可能带来对待测化学成分的影响。
三、化学方法
（一）定义
化学方法是指利用某些阳离子（如钙离子、镁离子等）在组织细胞连接中所处的关键作用，采用某些化学试剂（如螯合剂）将这些阳离子替代出来，达到破坏细胞连接，使细胞分散开来的单细胞悬液制备方法。化学法常用的螯合剂如EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠盐）、TPB（四基苯硼）和枸橼酸钠等。
（二）适用范围
化学方法适用于组织细胞连接方式中以关键性阳离子作用为主的组织标本。
（三）注意事项
1.不同的组织标本使用的螯合剂种类不同。
2.化学方法，尤其是与酶学法联合使用时，对实体瘤组织的分散解聚最为理想，但是也可能对待测化学成分带来影响。