第三节 糖化发酵剂制备
一、糖化剂及糖化工艺
（一）糖化剂的类型
淀粉质原料酿制食醋，必须经过糖化、酒精发酵、醋酸发酵3个生化阶段。把淀粉转变成可发酵性糖，所用的催化剂称为糖化剂。食醋生产采用的糖化剂，现在基本有以下6个类型。
1.大曲（曲块）
大曲是以根霉、毛霉、曲霉、酵母为主，并有大量野生菌的糖化曲。大曲主要是利用霉菌产生的淀粉酶对淀粉进行水解，与成曲之后霉菌的死活没有多大关系，但也保留少量活的细菌和酵母。生产时非常强调用陈曲，一般要求存放半年以上。这类曲生产工艺复杂，但优点是便于保管和运输，酿成的食醋风味好，但淀粉利用率较低，生产周期长，现在我国几种主要名特食醋的生产仍多采用大曲。
2.麸曲（散曲以黑曲霉、黄曲霉为主）
麸曲为国内酿醋厂所普遍采用的糖化剂。糖化力强，出醋率高，采用人工纯培养，操作简便。麸曲生产成本低，对各种原料适应性强，制曲周期也短。老法制醋所用的大曲、麦曲、药曲等都是利用空气中、工具及覆盖物上存在的微生物，在原料上自然繁殖而成，由于菌种来源极其不纯，成曲质量差异很大，使产品质量不够稳定，原料利用率低。1970年以前北京市制醋行业大部分使用北京市龙门醋厂制曲车间生产的大曲，每年制曲耗用粮近百万斤（大麦、豌豆）。1971年推广应用黑曲霉麸曲并停止了大曲的生产，不仅节约了制曲用粮，而且提高了醋的出品率20%左右。由于麸曲酶系较大曲单纯，故在产品风味和澄清程度上还有一定的差距。
3.小曲
小曲又称酒药、药曲或药饼，是我国独特的酿酒酿醋糖化发酵剂。主要是根霉及酵母，利用根霉在生长过程中所产生的淀粉酶以进行糖化作用。小曲酿醋时，用量很少。小曲便于运输和保管，但这类曲对原料选择性强，适用于糯米、大米、高粱等原料，对于薯类及野生植物原料的适应性差。
4.红曲
红曲是我国特产之一，红曲霉培养在米饭上能分泌出红色素与黄色素，而且有较强的糖化酶活力，被广泛应用于增色及红曲醋、乌衣红曲醋的酿造。
5.液体曲
一般以曲霉菌为主，经发酵罐内深层培养，得到一种液态的含α-淀粉酶及糖化酶的曲子，可代替固体曲用于酿醋。液体曲生产的菌种是在液体培养基中生长快、糖化力强的菌株，一般固体曲用的菌种不一定适合在液体中培养。液体曲常用的菌种有UV-11等。液体曲生产机械化程度高，能节约劳动力，降低劳动强度，但设备投资大，动力消耗大，技术要求高。
6.糖化酶
主要以深层培养法生产提取酶制剂，如用于淀粉液化的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶及用于糖化的葡萄糖淀粉酶都可加工成酶制剂，用于食醋酿造。
在糖化酶品种的选择上，传统的固态发酵工艺以酶代曲，可以选择固体糖化酶；在间歇糖化时，固体或液体糖化酶可以直接加入糖化锅，不必稀释；在连续糖化时，可先用30℃温水稀释糖化酶后进行流加。液体糖化酶由于浓缩倍数高、活力高、酶系纯、杂质少，使用效果优于固体糖化酶；复合糖化酶由于进一步提高了最终成品醋的收得率，因此，比普通糖化酶有着更好的效果。
（二）制曲
1.大曲生产
（1）大曲生产工艺流程 制大曲工艺流程见图2-2。
图2-2 制大曲工艺流程
（2）生产要点
① 原料粉碎 将大麦70%与豌豆30%混合后分别粉碎。过20目孔筛，通过孔筛的细粉与通不过孔筛的粗粉之比，夏季为30∶70，冬季为20∶80。
② 拌料踩曲 拌料要均匀，掌握好水分，每50kg混合料加温水25kg。踩曲用12人依次踩实。不少厂家已采用机械制曲机制曲，踩好的曲块应厚薄均匀、外形平整、四角饱满无缺、结实坚固，每块曲3.5kg。
③ 入曲室 将制成的曲坯搬入室温25℃左右的曲房内，地面先铺垫一层谷糠，曲坯立放，间距1～2cm，行距3～4cm；再码放曲坯一层，层间用苇秆架隔，间距、行距同第一层。用苇席1～2层遮盖坯垛，并在苇席上喷洒清水，使其潮湿。
④ 上霉 关闭曲房门窗，让曲坯自然升温，当坯表面均匀生长有白色小菌落时，上霉完成。上霉时间48～72h。
⑤ 晾霉 晾霉指在降温、排潮下，曲坯表面霉点受凉并定型。
打开曲房门窗，揭开苇席，经12h左右，将曲坯翻码为三层，间距扩大为3～4cm，品温要求不超过33℃；再经12h左右，当品温升至36～37℃时，将曲坯翻码为四层，间距扩大为5cm左右，以后经24h曲坯翻码一次。晾霉时间为48～72h。
⑥ 起潮火 起潮火指微生物大量生长繁殖，使曲坯排放的水汽最多，品温很高的阶段。
关闭曲房门窗，品温自然上升。用开闭门窗、翻码曲坯、扩大间距、增加码层等方法，控制品温在38～47℃，时间为4天左右。
⑦ 大火 大火指微生物继续生长繁殖，使曲坯品温达到最高峰的阶段。
每1～2天翻码曲坯一次，间距10cm以上，要求品温为30～48℃，时间为7～8天。此期间曲的水分基本排除干净。
⑧ 后火 后火指微生物生长繁殖减慢，曲坯品温逐渐下降的阶段。
大火后，品温逐渐下降，当降至36～37℃时，翻码曲坯一次，间距缩小至5cm左右，经3天左右，品温降至32～33℃。
⑨ 养曲 翻码曲坯，间距缩小至3.5cm，品温控制在28～30℃，室温为30～32℃，时间2～3天。
⑩ 成曲贮存 打开门窗，经3～5天晾曲后，移入干燥、阴凉、通风的库房内贮存，成曲间距1cm以上，码层不超过6层，以防返火。如制红心曲，则应在曲将成之日，保温坐火，使曲皮两边向中心夹击，两边温度相碰接火，则红心即成。
2.麸曲生产
固体麸曲的生产方法通常有曲盒制曲、帘子制曲和机械通风制曲3种。制盒曲、帘子曲劳动强度大，目前只有制作种曲时或小厂采用，大生产中已被淘汰了。帘子制曲虽然有一定改进，但仍不能摆脱手工操作，劳动强度大而且占用厂房面积大，生产效率低，还受气候影响，产品质量不稳定，通常只有制备种曲时应用此法。机械通风制曲，曲料厚度为帘子法的10～15倍，曲料入箱后通入一定温度、湿度的空气，提供曲霉适宜生长的条件，这样便可达到优质、高产及降低劳动强度的目的。
（1）麸曲的生产工艺流程 麸曲的生产工艺流程见图2-3。
图2-3 麸曲的生产工艺流程
（2）生产要点
① 试管培养（龙门醋厂AS3.758黑曲霉曲生产工艺） 称大米50g，冲洗干净，加入350mL水煮成饭状，降温至50～55℃接入新鲜的黑曲霉20g，放入500mL三角瓶中，盖上棉塞，在50～55℃水浴锅保温糖化4h，取出用脱脂棉过滤，再用滤纸过滤1次即为糖化液，100mL糖化液加入琼脂2～3g，溶化后装入试管，高压灭菌0.1MPa、20min，取出做成斜面培养基，放入冰箱备用。
在无菌条件下接种，置于30℃保温箱72h后，长满黑褐色孢子即可应用。
② 三角瓶培养 称取麸皮100g，稻壳5g，加水75～80mL，拌匀装入1L三角瓶中，厚0.5～1cm，加棉塞，包好防潮纸，高压灭菌（0.1MPa、15min）后取出放入无菌室冷却至30℃，将试管中黑曲霉移接在三角瓶中，置于30℃保温箱中培养，经24～28h观察生长情况，如布满白色菌丝，即可扣瓶。将三角瓶倒放在保温箱中，再经48h，等长满黑褐色孢子即成熟，短期备用。
③ 木盒种曲培养 称取麸皮50kg，加水50～55kg，拌匀，装锅，冒汽后40min取出，在无菌培养室过筛疏松，等品温降到35℃左右，种曲[0.3%～0.5%（质量分数）]接入三角瓶。接种后品温降至30～32℃，堆集1～2h，然后装入灭菌的曲盒内，厚度1cm左右，码成柱形，前期室温29℃，当品温上升到34～35℃时倒盒，等长满菌丝后将盒内曲料分成小块，即划盒。划盒后将曲料摊平，盖上灭过菌的湿草帘，然后将盒摆成品字形。地面上洒些水，以保持室内湿度。中期室温保持在26℃，全部生产过程需72h，待曲料布满黑褐色孢子即种曲成熟。后期室温控制在30℃，排除曲房潮气，存放在阴凉、空气流动处，干燥备用。
④ 通风制曲 由于曲料厚度在20～25cm，要求通风均匀，阻力小，因此在配料中适当加入稻壳或谷糠等以保证料层疏松。
每50kg麸皮加入稻壳4～5kg，加水30～32.5kg拌匀，装入锅内，冒汽30min出锅，用扬料机打碎结块并降温，至32～35℃接种曲[0.3%～0.5%（质量分数）]，装入曲池内，品温30℃，室温保持在28℃左右，品温上升至34℃时开始通风，降至30℃时停风，待曲块形成翻曲1次，疏松曲块利于通风，连续通风控制品温，经28～30h菌丝大量结块，即成麸曲，出曲室摊开阴干，短期备用。
3.小曲生产
小曲以大米、大麦等为原料，有的添加各种中草药。在加中草药问题上各施各法，有的添加一种，有的添加许多种，但生产实践证明，少用药或不用药，也能制得质量较好的小曲。一般采用经过长期自然培养的种曲进行接种，也有用纯粹培养根霉和酵母菌进行接种，这样更能保证有用微生物的大量繁殖。
曲霉等。
（1）小曲生产工艺流程 以无药糠曲为例介绍，生产工艺流程见图2-4。
图2-4 无药糠曲生产工艺流程
（2）生产要点
① 原料处理 先把碎米碾成米粉，再用少量冷水将所需米粉泡湿，然后将此米粉倾入锅内的沸水中，不等煮得过熟即取出。纯糠也碾碎，在纯糠碾到最后一次时加曲种共同碾碎。
配料比例：纯糠87%～92%，碎米粉5%～10%，曲种3%，加水量为原料的64%～70%。
② 制坯 先在搅拌场将曲母、碎米粉、纯糠粉按比例拌和均匀，拌匀后再过秤装入拌料盒。掺水时边掺边和，要和得快，和得散，和得均匀，和3～4遍，要求达到无生粉、无疙瘩，并仔细检验水分。踩坯要踩干，用切刀按紧压平，切成3.7m3的曲块。切曲要切断，团曲要无棱角，表面光滑，要达到曲皮光润、保持水分并有松心紧皮的效果，以利于霉菌生长匀壮。团曲每100kg撒粉0.3kg（在3%曲母中扣出），要撒布均匀。当天拌好的原料必须当天用完，绝对不能剩到第二天使用。工具要清洗。团曲成型后送入曲室，由上而下，由边角至中央摆放，曲与曲的间隔保持不靠拢即可。
③ 培养曲 根据小曲中微生物的生长过程，大致可分为三个阶段进行管理。
前期培养：小曲入室，室温保持22～26℃，经10～12h，品温升至27～28℃，曲粒生香味，菌丝稍露，开窗放湿。至20h开始出现甜香，即转入中期培养。
中期培养：20h后，品温升到35～36℃，曲粒甜香，有白霜。25～40h后曲粒品温由37～39℃降至28～29℃，这时要排潮，使品温提高到30～32℃，转入后期培养。
后期培养：45h后，室温控制在33℃以上，为高温排潮期。70h后即可出曲。
品温以中层的曲心为标准，室温温度表应悬于中层中间。
成品率一般为原料的80%～84%。
出曲后将曲室打扫干净，每月用硫黄或甲醛将曲室灭菌1～2次。
④ 烘干 曲粒出房后，立即移至烘房，在低温下进行烘干或晒干，至水分11%以下，保藏备用。
4.红曲生产
红曲生产工艺流程见图2-5。
图2-5 红曲生产工艺流程
① 菌种
试管斜面培养：10.5%～14.5%的饴糖液100mL，可溶性淀粉5g，蛋白胨3g，琼脂3g，加热溶解后，加入冰醋酸0.2%，分装入试管，杀菌后制成斜面。接入红曲霉试管原种，置于恒温箱内28～30℃，培养14～20天备用。
米试管培养：试管中装入蒸熟的籼米（1/4体积），杀菌后冷却至室温接种（用经过杀菌的0.2%稀醋酸5～10mL，洗斜面红曲种子中的菌体，再用无菌吸管吸取0.5mL的红曲种子，接入大米试管中摇匀），在30～34℃恒温箱中培养10～14天后备用。
② 红曲用料配比 每100kg籼米加冷开水7kg，冰醋酸120～150g，红曲米试管菌种3支。使用前将红曲米试管菌种研细并与冷开水及冰醋酸混合均匀。
③ 籼米处理及接种 籼米加水浸泡40min，淘洗后沥干，再倒入蒸桶内蒸饭，边开蒸汽边上蒸，等到蒸桶周围全部冒汽后，加盖再蒸3min。蒸好的饭移入木盘内，搓散结块并散热，冷却到42～44℃（不得超46℃），接入已混合冰醋酸液的研细红曲种子，充分拌和后装入麻袋，把口扎好，进入曲室培养。
④ 培养 进入曲室时，品温开始由原来的36℃下降到34℃，而后慢慢上升，从34℃上升至39℃，需17～19h。以后每1h能升温1℃，到最后每0.5h即可升温1℃，待升至50～51℃时立即拆开米饭包，移至备有长形固定木盘的曲室中。整个过程所需时间为24h，此时曲室温度自始至终保持在25～30℃。当米饭拆包摊至木盘时已有白色菌丝着生，渐渐散热冷却到36～38℃时，再把米饭堆集起来（上面盖有麻袋以利保温），使温度上升至48℃。一般从51℃经冷却后上升到48℃，需5～6h。堆集达到48℃时，再把米饭散开来，翻拌冷到36～38℃，再次把米饭堆集起来，使温度上升到46℃，约需2h。料温达到46℃时第二次把米饭摊开，翻拌冷却至36～38℃。第三次把米饭堆集起来，再使温度上升到44℃时，最后把它散开来用板刮平。这时米饭粒表面已染成淡红色，使品温正常保持在35～42℃，不得超过42℃，一直保持到浸蓝为止。
⑤ 浸曲 培养35h左右，当米饭大部分已成淡红色，且十分干燥时需要进行浸曲。以后每隔6h浸曲吃水一次，即把木盘内的曲装入淘米箩内，放进小缸浸曲约1min后取出淋干，再倒入木盘内刮平。浸曲水温要求在25℃左右。如此进行浸曲吃水七次，浸曲前4h要翻拌一次，浸曲后也要翻拌一次。从米饭培养到出曲共计4天，使成品外观全部呈紫红色。为了降低劳动强度，可以不进行浸曲，而实行直接加水的操作，每100kg米每次吃水7～12kg。
⑥ 烘干 将湿曲摊入盛器内，厚度约1cm以下，进入烘房进行干燥。干燥温度为75℃左右，干燥时间为12～14h。每l00kg籼米得红曲成品38kg左右。
5.液体曲生产
（1）液体曲生产工艺流程 液体曲生产工艺流程见图2-6。
图2-6 液体曲生产工艺流程
（2）生产要点
① 孢子悬浮液的制备
斜面菌种的制作：以UV-11菌种为例。液体菌种要求孢子多，宜采用营养丰富的小米或米曲汁为培养基。
小米培养基及生产菌种的培养过程：先将优质小米洗净，加入15%～20%麸皮，再按1∶1.2的加水量加水后，常压蒸30min；然后分装试管，每支装3～5g，做成斜面，在0.15MPa的蒸汽压力下，杀菌60min，冷却接种；再放入恒温箱中30～32℃培养5～7天，培养前2～3天是菌丝生长期，后2～3天生长孢子，直到孢子布满整个斜面。
孢子悬浮液的制备：用无菌水把培养的斜面菌种的孢子洗下，做成孢子悬浮液，置于冰箱中备用。
② 种子培养
培养基的配制：种子培养基与液体曲培养基的配方原则上应有区别，但生产上为了管理方便，不单独配制种子培养基，而是采用液体曲培养基。其配方是：薯干粉5.2%，米糠2%，豆饼粉1.2%，硫酸铵0.16%。
培养基的灭菌：由于培养基使用麸皮、米糠、豆饼粉等蛋白质含量高的原料，故杀菌要彻底，否则容易发生杂菌污染。此外培养基在高温杀菌的过程中也使原料中淀粉溶解，蛋白质变性。
生产上采用间断性配料和连续配料的方法时宜设置两台配料机。在配料罐中将料液搅拌均匀后用盐酸调pH值到4.5，再将料液加热到85℃，经往复泵送入两套管加热器中，在器内通入0.45MPa的直接蒸汽，将料液加热到135℃左右，然后进入第一后热器，再进入第二后热器，在后热器中总时间为40～45min，最后经喷淋冷却器冷却至30℃，再进入种子罐或培养罐。
种子培养：先将种子罐进行空罐灭菌。其方法是先将种子罐洗净，排净罐内和夹层内的存水，用高压蒸汽灭菌，保持罐压0.15MPa，时间为20min。待罐压降至“0”开始投料。投料完毕，用微孔针刺法，利用突然减压把孢子悬浮液接种到种子罐中，接种量为5%～10%。接种前后均保持罐内压力为0.03MPa，培养温度30～32℃。培养过程需通入无菌空气，风量为1∶0.4（1m3醪液、1min通入0.4m3空气）。培养时间一般为36～40h。
③ 成品曲制备 利用压力差将种子罐中培养好的种子液压入培养罐中，即提高种子罐压力，同时适当降低培养罐压力，造成压力差，将种子液从种子罐压入培养罐。接种量为10%左右，维持罐压力0.05MPa，通风量为1∶0.2，温度为30～32℃，培养40h后每隔2h取样测定酶活力和pH值，直至酶活力开始下降，即可放罐，一般需三天左右。
液体曲成熟后暂不使用时，可在低温26～27℃、保压条件下贮存一周之久。在贮存期间虽会由于菌体自溶而使液体变稀，但酶活力仍保持不变。
（三）糖化工艺
1.高温糖化法
高温糖化法也叫酶法液化法，是以α-淀粉酶制剂对原料进行液化，再用液体曲或固体曲进行糖化的方法。由于液化和糖化都在高温下进行，所以叫高温糖化法。这种方法具有糖化速度快、淀粉利用率高等优点，广泛用于液体深层制醋和回流法制醋等新工艺。
（1）液化工艺 将淀粉乳浓度调到16°Bé以上，用纯碱调整pH值到6.2～6.4，加入适量的氯化钙（Ca2+有提高淀粉酶的热稳定性作用），其用量为原料的0.1%。按要求投入定量的液化酶（生产上控制5～8U/g原料），搅拌均匀后，送到液化及糖化桶中，加热到85～90℃，保温10～15min，至DE值（葡萄糖值，糖化液中还原糖全部当作葡萄糖计算，占干物质的百分率称为葡萄糖值，它表示淀粉的水解程度或糖化程度）为15左右。然后升温至100℃灭酶5～10min。
（2）糖化工艺 用冷开水把醪液降温至65℃，加入固体曲或液体曲，用量为100～120U/g原料，糖化时的pH值控制在4.0～4.6，糖化时间为30min左右。糖化后，应立即冷却到30℃，送入酒精发酵工段。
在液化和糖化过程中，都需要搅拌操作。液化及糖化设备见图2-7。
图2-7 液化及糖化桶示意图
2.传统工艺法
传统的制醋方法，无论是蒸料或煮料，其糖化工艺的共同特点如下。
（1）不进行人工培养糖化菌，而是依靠自然菌种进行糖化，因此酶系复杂，糖化产物繁多，为各种食醋提供独特风味。
（2）糖化过程中液化和糖化两个阶段并无明显区分。
（3）糖化和发酵同时进行，有的工艺甚至进行糖化、酒精发酵、醋酸发酵三边发酵。
（4）糖化过程中产酸较多，原料利用率低。
（5）糖化时间一般为5～7天。
目前，各地对传统工艺都有所改进。现多用纯种培养的黑曲霉制麸曲进行糖化，以利提高糖化率。
3.生料糖化法
生料糖化法就是淀粉质原料预先不经过蒸煮，直接用糖化剂对原料淀粉进行糖化。此法可节约能源20%～30%，省去润料、蒸煮、冷却等工序。但是，要做到淀粉水解率不低于熟料糖化法，首先就需要拥有对生淀粉水解率高的微生物菌种，这是十分关键的；另外，用曲量要适当增大；其次，生料糖化产生出来的糖要能迅速被酵母菌利用，始终让发酵醪中的可发酵性糖保持在2%左右的低水平，借助酵母菌的生长优势以及生成的酒精和各种有机酸来抑制杂菌的生长繁殖，保证发酵正常进行。关于生料糖化法，国内外学者进行过许多研究，特别是用在酒精发酵上，由于全世界酒精生产数量十分巨大，如果生料糖化法可替代熟料糖化法，它将产生出巨大的经济效益。
随着酶学的研究的不断深入发展，通过对酶进行分离、纯化及特性研究，已弄清生料糖化的实质是真菌葡萄糖淀粉酶对生淀粉的降解作用。葡萄糖淀粉酶对不同种类的生淀粉的水解效果是不同的。有实验表明，黑曲对玉米生淀粉的水解率最高，而对马铃薯生淀粉的水解最差。
二、酒母的制备
使糖液或糖化醪进行酒精发酵的原动力是酵母菌。将纯种酵母菌经过逐级扩大化培养制成的酵母培养液称为酒母。
在自然界中，酵母菌的种类很多，有些酵母菌能发酵糖生成酒精，有些则不能；有的生成酒精能力强，有的则弱；有的酵母菌能产生酯类物质，有的就没有这种能力；有的酵母菌在不良环境中仍能进行发酵，有的则适应能力差。用传统工艺酿醋，在醋生成之前的酒精发酵是依靠曲中以及空气中落入物料中的酵母菌繁殖后进行的。由于依靠自然界的酵母菌，菌种会有不同，功能也各异，使食醋风味好、口味醇厚，但质量就不易保持稳定，且原料出醋率低，有的每100kg粮食仅出醋0.3kg。新的酿醋方法，由于采用优良酵母菌菌种，通过纯培养方法制成酒母，再将其接入糖化醪或醅中进行酒精发酵，因此生产效率大为提高，产品质量稳定，出醋率上升。制备酒母时应选择产酒率高、发酵迅速、抗杂菌能力强、对环境适应性好、性能稳定的优良菌株。
酒母的扩大培养过程主要包括斜面试管、液体试管、小（大）三角瓶、卡氏罐、酒母罐（缸）等培养步骤。
1.酒母扩大培养
酒母扩大培养流程见图2-8。
图2-8 酒母扩大培养流程
2.工艺要点
（1）试管斜面菌种 用麦芽汁或米曲汁糖化液制成斜面培养基。接种酵母原菌，在28℃培养3天即得。保存于4℃冰箱中，1～3个月移接一次。
（2）小三角瓶扩大培养 用7°Bé麦芽汁或7°Bé米曲汁，于250mL三角瓶中装入150mL培养基，灭菌冷却后，接种斜面菌种1～2环，摇匀后于28℃下培养24h。
（3）大三角瓶培养 麦芽汁或糖化醪500mL装入1000mL三角瓶中，灭菌并冷却至30℃左右，接入小三角瓶酒母液约25mL，在28℃下培养16～20h。
（4）卡氏罐培养 容量一般为15L的不锈钢卡氏罐（如图2-9所示），加入稀释到14%～16%的经硫酸调pH值至4.1～4.4的糖化醪，灭菌后冷却到25～30℃，接入大三角瓶酒母液，在28℃左右培养10～18h。
图2-9 培养酵母的卡氏罐
（5）酒母罐扩大培养 按生产实际需要，可选择大缸或发酵罐进行酒母的再扩大。培养基多用玉米糖化醪，接入卡氏罐酵母，在30℃条件下保温培养8～9h，即达成熟。
三、醋母制备
传统方法制醋，是依靠野生醋酸菌自然进入醋醅进行醋酸发酵，因此，生产周期长、出醋率低。现在多使用人工选育的优良醋酸菌，通过扩大培养得到醋酸菌种子（醋母），再将其接入醋醅或醋醪中进行醋酸发酵，使生产效率大为提高。
（一）菌种的选择、培养及保藏
1.菌种的选择
醋酸菌能氧化酒精为醋酸，但不同的醋酸菌其氧化能力不同，产生风味物质的多少也有很大差别，所以选择菌种很重要。AS 1.41醋酸菌和沪酿1.01醋酸菌是常用的酿醋优良菌株。
2.醋酸菌的培养及保藏
（1）培养基 试管斜面培养基。
① 酒精含量6%的酒液100mL，葡萄糖0.3g，酵母膏1g，琼脂2.5g，碳酸钙1.5g，水100mL。
② 酒精2mL，葡萄糖1g，酵母膏1g，琼脂2.5g，碳酸钙1.5g，水100mL。
以上两种培养基中任选一种，不必调节pH值，制成试管斜面备用。
（2）培养方法 斜面接种醋酸菌后，置于30～32℃培养箱中培养48h。
（3）保藏 醋酸菌易被自己所产生的酸杀死，特别是能产酯的菌种在室温下十几天就死亡，因此斜面菌种宜保藏在4℃冰箱中，培养基中加入碳酸钙可以中和醋酸菌产生的酸，有利于保藏时间延长。
（二）醋酸菌固态法扩大培养
醋酸菌固态法扩大培养，是先将纯种醋酸菌经三角瓶扩大培养后，得到的种子液接入到醋醅上，利用自然通风和醋汁回浇的方法进行固态扩大培养。用固态法培养的醋酸菌，因为不是在严格的无菌条件下培养，所以纯度不高，但已能适用于除液体深层发酵制醋外的各种食醋的酿造。
1.大三角瓶纯种扩大培养
在1000mL三角瓶中装入含酵母膏1%和葡萄糖0.3%的培养液100mL，加棉塞，在98kPa蒸汽压下灭菌30min。冷却后，在无菌室内往培养液中加入酒精4%（体积分数），然后接入醋酸菌斜面种子，摇匀后于30℃下静置培养5～7天。当培养基液面上出现菌膜，有醋酸味，即培养成熟。如用振荡培养，三角瓶的装液量可增加至150mL，培养时间可缩短到24h。
2.固态育种
取生产上配制的新鲜醋醅，置于设有假底、下面开洞加塞的大缸中，接入经三角瓶培养成熟的纯醋酸菌种子液，拌和均匀。接种量为原料的2%～3%。培养1～2天后，由于醋酸菌繁殖，使品温升高，此时采用回浇法降温，即将缸底醋汁放出回浇在醋醅上，控制品温不高于38℃，继续培养。经过4～5天的培养，当醋汁酸度达到4g/100mL时，说明醋酸菌已大量繁殖，即可将此醋醅作为醋酸菌种子应用于生产中。
（三）醋酸菌种子液态培养
在种子罐中经液态培养的醋酸菌种子液，一般用于液体深层发酵法制醋。种子罐用不锈钢罐或陶瓷耐酸罐。
1.一级种子培养
（1）培养基 葡萄糖1%，酵母膏1%，碳酸钙1.5%，酒精2%。
（2）培养方法 在1000mL三角瓶中装培养液150mL，于98kPa蒸汽压下灭菌30min，冷却后在无菌条件下加入酒精2%（体积分数），接入醋酸菌斜面种子，在32～34℃下振荡培养24h。
2.二级种子培养
培养方法与一级种子的培养方法相同，但装液量改为250mL。接入一级种子的量为10%（体积分数）。在32～34℃下振荡培养16h。
3.三级种子培养
将8.5°Bé的水解糖液泵入50L种子罐中，装液量为35L。100℃灭菌10min，待降温至32℃左右时，接入10%（体积分数）酵母培养液，于30℃下静置培养30h，当酒精含量达到4%～6%时即可。然后接入醋酸菌二级种子液10%（体积分数），培养条件为通风比1∶0.3，搅拌转速360r/min，罐压30kPa，培养温度32～34℃，时间12～16h。培养终点为培养液的醋酸含量达到2g/100mL，否则可适当延长或缩短培养时间。
4.四级种子培养
8.5°Bé水解糖液泵入500L种子罐，装液量为350L。培养基的制备与三级种子的相同。接入醋酸菌三级种子液10%（体积分数）。培养时，通风比为1∶0.25，其余条件与三级种子的培养相同。
四级种子用于液体深层发酵法制醋。