第二节　腐植酸分级分析新技术

腐植酸作为天然高分子或生化氧化聚集体，其所含有的蛋白质、核酸、多糖、木质素都是生物工程分离的主要成分，因此，表2-5的分级依据与方法是生物大分子可共享用的。

一、毛细管电泳/高效毛细管电泳法

依据腐植酸有电荷，有不同的动电位（电位），根据腐植酸在电解质溶液中移动速率的不同，在电场中能将其分成几个段分。腐植酸是胶体阴离子，用电泳可鉴别出黄腐酸的性质和棕腐酸的性质，电泳分级可将腐植酸在碱性溶液中分成二到三段分。其中黄色段保留在原点，棕色段是流动性较大的，而黑色段中，有低分子量的段分在电泳中前移。

（1）毛细管电泳（CE）　包括电泳、色谱等功能，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性（电荷、大小、等电点、极性、亲核行为和相分配特性等）进行的液相微分离分析技术。毛细管电色谱是继高效液相色谱之后有机物分析的又一重要手段。毛细管电泳（CE）与质谱（MS）联用，可以对生物大分子，包括腐植酸级分进行定性与定量。

（2）高效毛细管电泳法（HPCE）　是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的液相分离技术，具有分离效率高、分析时间短、检测限低、进样量小、自动化程度高等优点，可对泥炭、生化腐植酸等的活性组分：生物碱、黄酮类、香豆素、有机酸和各种苷类成分多肽蛋白分析，在黄腐酸有效成分分析、指纹图谱（特征图谱）的研究方面有显著的优势。

二、分子量法

采用冰点下降法测定实验，在带有77-9型贝克曼温度计的黄腐酸分子量测定装置中进行（见图2-11）。

1.冰点下降常数K值的测定

调节贝克曼温度计的测量范围到0℃左右，调节冰浴温度-5～-4℃，在测量管内移入一定量的去离子水，插入贝克曼温度计，不断缓慢地搅拌试液，测定其凝固点，用同样的方法测定待测黄腐酸溶液的凝固点Tf，平行实验组相差应小于0.004℃。

分子量的计算公式如下：

　　（2-1）

式中，MB为溶质B的分子量，kg/mol；c为稀溶液的浓度，g/L；ρ为纯溶剂在凝固点时的密度，kg/L；Kf为所测定的修正的冰点下降常数，用与黄腐酸具有类似性质的结构类似物水杨酸、草酸和邻苯二甲酸氢钾溶液测定，并用黄腐酸分子结构类似物作模型化合物。

冰点下降法选用水作溶剂，溶于水的大部分溶质会在水中电离，部分溶质也会在水中通过氢键缔合，使分子量的测定偏离正确的数值，黄腐酸是一种含有羟基羧基结构的物质，容易与水通过氢键缔合，直接采用冰点下降法测定黄腐酸的分子量会导致较大的误差。因此，应用冰点下降法测定黄腐酸分子量必须对水溶液中溶质的部分电离和缔合进行修正，确定冰点下降常数K。

选用与黄腐酸、黄腐酸盐有同样官能团的水杨酸、草酸、邻苯二甲酸氢钾、甘草酸、茶多酚为标准模型物，配成一定浓度的水溶液，用已知分子量反推K值，得到如表2-6所示的结果。

从表2-6可以看出，一定浓度下标定的模型物冰点下降常数K值很接近，可以认为是一个常数。经过关联K值与溶质浓度的关系，使一定浓度范围内的K值保持恒定，从而测定出黄腐酸的分子量。通过关联出的表2-6的数据可以推论，氢键缔合在测定体系中起主导作用，溶质在水中解离后使水中的质子数增加，K值减小，但电离作用对K值的影响很小，因此，电离能力最强的邻苯二甲酸氢钾标定出来的K值只比电离能力最差的水杨酸低了2.01％，从而可以获得黄腐酸和黄腐酸盐分子量之间的校正差异。

K值取上述5种物质标定出来的平均值，K=3.94kg·K/mol。

2.修正后K值的验证

为了检验修正后的K值是否可以用于黄腐酸分子量的测定，继续选用黄腐酸分子结构类似物及其混合组分作为模型物，配成一定浓度的水溶液，测定其分子量，并与理论值做比较。结果见表2-7。

采用自行搭建的冰点下降测定仪，可以快速准确地测定黄腐酸的分子量，与理论值相比，误差≤3.37％。而后在元素、官能团分析的基础上能建立分子结构、分子式、分子量［10，11］。某黄腐酸分子的元素、官能团和理化特性见表2-8。FA分子模拟构象见图2-12。

3.勾勒分子式、分子量

分子量581，分子式C22H15NO18，结构见图2-13。

分子量1034，分子式C37H34N2O33，结构见图2-14。

分子量2368，分子式C63H67N3O40，结构见图2-15。

三、紫外吸收光谱法

紫外光谱法（UV）可系统鉴别矿源腐植酸、生化腐植酸中的植物残体，以及腐植酸药肥的复方成分，该方法简便，可操作性强。

图2-16采用UV-2102 PCS型紫外可见分析图谱显示，矿源腐植酸降解后扫描波长为261～265nm、465nm处的共轭性结构明显、E265/E465或E265/E665>10，而天然矿源腐植酸未降解前在465～665nm间几乎没有峰端，仅呈现一条光滑的下降曲线，很难确定共轭结构。

四、红外吸收光谱法

红外光谱（IR）与紫外吸收光谱一样，是一种分子吸收光谱。红外线的能量比紫外线的低，当红外线照射分子时，不足以引起分子中价电子能级的跃迁，而引起分子振动能级和转动能级的跃迁。红外光谱对化合物的鉴定和有机物的结构分析具有鲜明的特征，构成化合物的原子质量的不同，化学键性质的不同，原子连接次序和空间位置的不同都会引起红外光谱的差别。由于绝大部分有机物基团的振动频率处于中红外区（2.5～25μm）。红外光谱图是红外光谱最常用的表示方法，它通过吸收峰的位置、相对强度以及峰的形状提供化合物的结构信息，其中以吸收峰的位置最为重要。

红外光谱法可以提供各种不同来源和性质的腐植酸中的重要官能团和结构的有用信息。腐植酸的红外吸收带及其归属见表2-9，不同的研究者所报道的谱带在频率上有微小的差别，列出的值应看成是近似值，腐植酸的典型红外吸收可归因于：各种羟基和氨基基团，多数含有氢键；脂肪族的基团和链；各种羰基基团，尤其是羧基基团，以及酮、醛、醌和酯；可能络合有羰基的芳香结构；烯键；酰胺；羧酸盐；酚和醇基团；多糖；硅酸盐杂质和水。

煤炭腐植酸虽然在可见光区有吸收，但并无特征性，谱线上不出现特征峰。有人通过固定波长如465nm测定吸光度，按Beer-lambert公式计算HA含量，但事实表明，不同HA和同一种腐植酸不同方法和工艺的产品，即使在固定波长下，其光密度并不相同，因此，也就没有对各种HA都适用的标准曲线。但可用作同一种原料，相同工艺生产过程中提取HA时作为控制分析来用。

紫外光谱也没有特征吸收。腐植酸的荧光特性很显著。刘康德的研究表明，各种煤HA荧光发射光谱至少有一个峰值，峰值点随芳构化的加深而一致移向长波方向。荧光强度对HA用于钻井液防塌剂有重要影响，因荧光干扰钻井工程中的测井。带荧光的处理剂是不能用于探井钻井过程使用的，因此，测定HA原料的荧光强度对指导这方面的应用有直接意义。

红外光谱研究通常需要固态或者干燥的样品，腐植酸复杂的分子结构提供了很多的原子间的相互作用和振动频率，这对于分析并不是很有利的，利用强大的傅立叶转换，可产生良好的分辨率和较好的结果，尤其是那些具有精细分辨率的指纹区和一些特征谱带可用于表示腐植酸及其他组分间的相互作用。

傅立叶红外光谱可以快速测定C、H和O元素组成的腐植酸的主要结构部位，必须仔细地消除由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐和水分引起的干扰。其中有关结构的定量数据不仅受到方法本身的限制，还受到分子中多种形式的分子间相互作用的限制。因此，傅里叶变换红外光谱、傅里叶变换拉曼光谱技术也广泛应用在腐植酸组成分析和质量控制中。如通过IR分析，不仅能了解褐煤腐植酸的主要结构官能团，还可知道含有特征组分雌酮。褐煤雌酮蜡萃取前后图谱见图2-17。

而从图2-18可见，腐植酸、改性腐植酸在3429cm-1有氢键结合—OH的特征吸收峰；3065cm-1有芳环C—H的伸缩振动；1707cm-1有羧基和羰基的伸缩振动；1596cm-1为芳香性振动峰；1411cm-1为羟基—OH振动和酚羟基的C—O振动；1244cm-1为羧基中C—O伸缩振动，由此可见，HA是含有多种官能团，并且通过桥键随机连接的一个或多个稠环芳核组成的天然大分子混合物。这些活性官能团决定了腐植酸很好的弱酸性、亲水性、离子交换性、络合螯合性和吸附性。其中1035cm-1处为磺酸基振动峰，振动峰值与改性前相比明显增强，说明改性成功。

五、质谱/ICP-MS联用技术

对可溶性的黄腐酸降解组分，质谱（MS）与气相色谱联用（GC），可以不经过衍生化（见图2-19）。

对水溶性腐植酸采用电喷雾质谱（ESI-MS）技术。其m/z值主要集中在低于1500的范围内；在m/z约250、350、500和700处有类似“波”的离子峰分布，可暗示不同来源的腐植酸前体物——木质素单体形成的二聚体、三聚体、四聚体的结构等；m/z70～110为腐植酸的“核结构”，m/z110～200主要为三种木质素来源的单体结构及其衍生物，

通常，质谱法是使样品电离、碎裂后，按照质荷比大小检测各种离子的一种方法。对有机质谱来说，最经典、使用最广泛的电力方法是电子轰击法（EI）。结合高温热解技术，将裂解和质谱结合起来，可以分析腐植酸的结构［13］。

运用ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪则可以测定腐植酸10-6～10-9（mg/kg～μg/kg）间的浓度，可鉴定腐植酸药物的危害元素是否在限定范围。ICP-MS仪器的特点是有机、无机组分能联合测试，且能测出腐植酸降解组分的数据分子量，借助计算机勾勒出腐植酸降解物结构图。在某些方面相比传统检测技术更直观，可为腐植酸组分成为生物医药的原料提供技术支撑。

六、核磁共振法

核磁共振是指处于外磁场中的物质原子核系统受到相应频率（兆赫数量级的射频）的电磁波作用时，在其磁能级间发生的共振跃迁现象。就本质而言，核磁共振波谱与红外及紫外吸收光谱一样，都是物质与电磁波相互作用而产生的，属于吸收光谱的范畴，根据核磁共振波谱上共振峰的位置、强度和精细结构可以研究分子结构。

核磁共振氢谱是应用最为广泛的核磁共振波谱，是由于质子的旋磁比较大，天然丰度接近100％，核磁共振测定的绝对灵敏度是所有核磁中最大的。1H-NMR通过图中峰组个数、峰的位置（即化学位移）、自旋偶合情况（偶合常数和自旋裂分）以及积分曲线高度比四种不同的信息直接提供化合物中含氢基团的情况，并间接涉及其他基团。

某腐植酸的1H-NMR的化学位移和归属见表2-10所示。

如经过绿色萃取从NMR可知含雌酮的褐煤蜡组分递增。与氢谱不同，13CNMR提供的第一个重要信息是分子中碳原子的数目，每一条谱线代表一种碳原子。如果分子有一定的对称性，则谱线数少于碳原子的数目。在对称分子中两个或两个以上的相同的碳原子产生一个吸收峰，吸收峰若明显增大，也是该种碳数目多的一种表现。因此，观察和研究碳原子的信号对研究不同类型的腐植酸有非常重要的意义。

由于12C没有核磁共振信号，而13C虽然有核磁共振信号，但其天然丰度只有1.1％，信号很弱，给检测带来了困难，随着脉冲傅立叶变化核磁共振翼仪的问世，核磁共振碳谱的研究才迅速发展起来，而核磁共振碳谱的测试技术和方法的发展，使13C-NMR变成一种很有效的结构分析方法。腐植酸的结构组成，脂肪碳在δ0～δ45范围内表现为一个宽峰，在δ45～δ110的含氧脂肪碳区域内的两个峰分别为甲氧基和与氧相连的脂肪碳，如：CH（OH）—或—CH—O—C。随着相对分子质量的增加，这两个峰的积分结果没有明显的变化。在芳香碳区域内的两个峰（δ130和δ150），分别为与氢或碳相连的芳碳和与氧相连的芳碳。腐植酸中的芳香碳主要与氢或碳相连，这种类型的芳碳约占全部芳碳的80％，仅有20％的芳碳是与氧相连的酚和芳醚。δ160～δ190范围的碳以羧基碳为主，同时也包括酰胺碳、酯碳在内的各种碳。

固态核磁共振碳谱的主要优点是缩短了脉冲之间的时间间隔，其化学位移归属可见表2-11。

图2-20和图2-21分别是矿源型腐植酸和生化腐植酸的13C-NMR。依据NMR对应的化学位移及归属分析可以看出：MHA中的脂肪碳、环烷碳的量比BFA少得多；矿源腐植酸以苯环为主的芳香碳特征显著；13C表观羧酸量分析与试样原腐植酸总量（羧酸）分析结果能相符合。为此，按照矿源腐植酸与生化腐植酸的组成和官能团的特点，有利于筛选不同的腐植酸生产所需要的原料。

图2-22是利用生物降解技术将复杂的腐植酸（HA）结构降解为黄腐酸（FA）甚至更小的分子，这不但能提高腐植酸的附加值，而且可为腐植酸组分的药物利用提供依据。图2-23、图2-24是SP泥炭腐植酸原料的13C-NMR图谱，经过降解的NMR图，可见显示的组分变窄。不同的泥炭、年青褐煤的FA/HA，尤其是BFA/BHA结合IR特征分析，已得到三萜皂苷（三萜酸）、甾体皂苷C21H47N3O10。

七、X射线衍射荧光光谱法

X射线衍射荧光光谱法可以用来分析腐植酸与金属Co2+等离子的络合性质［15］。当X射线照射到腐植酸等固体面上以后，会发生一系列复杂的变化，如，其部分射线被吸收，部分用于产生散射和X荧光等，还有部分将其能量转移给晶体中的电子。按X射线与物质相互作用的机制不同，可以将X射线分析法区分为X射线吸收分析法、X射线衍射分析法、X射线荧光分析法以及俄歇电子能谱法。

图2-25是某褐煤腐植酸的X衍射分析图谱。其特征是：在8°～12°的间隔中，表现出无定形物质的最大倾向值；而结合从各个不同产地褐煤的电子显微镜图谱中各质点形状和大小的同一性，显示它们聚集体的特征也是相似的，即都具有无定形物质所特有的疏松结构。

应用X射线衍射仪可以测定含量在几十毫克级以上的腐植酸灰分全组成，如表2-12测定的某褐煤腐植酸的灰分组成，从中可以看出除C、H、N元素外的元素比率。

采用X射线衍射技术结合材料学中的物相分析，通过对谱峰的归属确定高含量的个别物质。目前利用衍射特征峰敏锐、指纹性强的特点，用X射线衍射技术可有效鉴别腐植酸原料及产品的质量。

八、分子荧光光谱-计算机联合法

荧光分析就是利用某些物质被紫外线照射后所发生的能够反映出物质特性的荧光以进行该物质的定性或定量分析。可用荧光分析法测定的有机化合物为数更多，大致可以分为：脂肪族化合物、芳香族化合物、氨基酸和蛋白质、胺类、维生素、甾类化合物、酶和辅酶、药物、毒物、农药等。

分子荧光光谱法，利用腐植酸分子受光照射时所发生的荧光的特性和强度，可进行定性分析或定量分析。当腐植酸分子吸收了特征频率的光子，就由原来的基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级。激发态分子经与周围分子撞击而消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，在停留约10-9s之后，直接以光的形式释放出多余的能量，下降至电子基态的各个不同振动能级，此时所发射的光即是荧光。产生荧光的第一个必要条件是腐植酸的分子能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是腐植酸分子具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，亦即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。让不同波长的激发光激发荧光物质，使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的图，即为荧光激发光谱。荧光发射光谱的形状与激发光的波长无关。

对于稀溶液（吸光度A=εcL≤0.05）而言，其荧光强度F=2.303фI0εcL。式中，ф为被测物的荧光量子效率；I0为入射光强度；ε为荧光物质的摩尔吸光系数，c为荧光物质的浓度，L为样品池的厚度。该式表明，在稀溶液（A≤0.05）和I0及L不变的条件下，荧光强度与该物质的浓度呈正比。溶液的荧光强度还受到溶剂、温度、pH的影响。

张彩凤等将分子荧光光谱分析用于腐植酸C系数的确定［16］，以及含量的分析，如图2-26所示，根据不同的吸收波长与对应的强度峰，甄别泥炭腐植酸、褐煤腐植酸、风化煤腐植酸以及生物质来源的腐植酸。

将分子荧光光谱仪配上计算机，根据荧光物质选择各类有效测量参数，并剖析定义化学光谱扫描测量结果，可以简化光谱分析的各项操作步骤和测量机理，达到一台仪器进行一机多功能、多指标、多目标的光谱分析测量各类化学物质及性质的目的；通过计算机软件控制的分子荧光仪还可与其他吸收光谱、色谱、质谱等精密仪器联用，达到更高速、更高效的分析手段，除了应用于一般的腐植酸产品外，还可应用于腐植酸环保、生化、医药等领域。

九、指纹分析法（综合分析法）

指纹图谱是一种创新型药用腐植酸（黄腐酸）质量控制核心技术，像中药组分检测那样，它能够较完整地表征药用腐植酸、药用黄腐酸复杂体系的特征性，按测定手段可分为化学组分指纹图谱和生物指纹图谱。

腐植酸、黄腐酸化学组分指纹图谱是指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的，用以表征其化学成分特征的指纹图谱（特征图谱）。如，结合离子色谱法、电色谱（CE）、高效液相色谱法（HPLC）加以定性定量，根据芳香羧酸或脂肪羧酸比例的多少，配合紫外分光光谱仪，测定出主要组分，与核磁共振（NMR）、红外光谱（IR）、LC-MS、检索、BLC-MS的仪器检测元素分析等，若结合Nano Temper分子间作用力仪（微量热泳动仪），可以提供丰富的生物亲和力、结合点数目、化学计量学和结合能量学信息，能适合于高端不同腐植酸原料或产品开发的需要。

腐植酸、黄腐酸生物指纹图谱包括药用黄腐酸的DNA指纹图谱和研究中的基因组学指纹图谱、黄腐酸蛋白质组学指纹图谱。这对矿源泥炭、生化腐植酸的研究可能比较适合［17］。而对于农用腐植酸原料，比指纹图谱更实用的是反应活性（交换容量），如盐基交换容量（CEC），它是土壤肥力的一个重要指标，决定着土壤保持养分的能力。对农药、兽药、医药实用指标还要添上有效元素Ca、Fe、K、Cu、Zn等，限制元素Cl、S、Al，公害指标As、Cd、Pb、Cr、Hg等限定。

十、试剂盒法（酶联免疫法）

试剂盒能够以可替换的方式被插入分析仪（1）中并包括多个试剂袋（A，B，C，D），该试剂袋（A，B，C，D）装有连接管线（6，7，8，9），这些连接管线中的每一个可以可选择地被连接到分析仪的输入设备（3）……

试剂盒涉及生物技术，尤其是一种可用于酶标记免疫检测技术，将链亲和素、生物素捕获技术应用于酶联免疫技术中，建立板式链亲和素双位点夹心一步法定量酶联免疫试验。

药用级腐植酸作为免疫反应试剂盒药剂有三种途径。

①作为人工抗原（hapten）可以如多糖、多肽、脂质和核酸等物质，作为半抗原，其单独作用时无免疫原性，但与蛋白质等大分子物质结合后可具有免疫原性。

②将药用级腐植酸半抗原分子，再偶联载体（carrier），形成半抗原-载体结合物，成为人工结合抗原。

半抗原与载体的连接有物理方法和化学方法。物理方法是通过电荷和微孔吸附半抗原，物理吸附的载体主要有羧甲基纤维素；化学方法是利用游离氨基或游离羧基等功能基团将半抗原连接到载体上。

③作为免疫佐剂，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，称为免疫佐剂。

佐剂分为两类：一类是本身具有免疫原性的佐剂，如细胞因子、百日咳杆菌、卡介苗（结核分枝杆菌）、源于分枝杆菌的胞壁酰二肽等；另一类是本身无免疫原性的佐剂，氢氧化铝、液体石蜡、羊毛脂、明矾、表面活性剂以及人工合成的多聚肌苷酸：胞苷酸、脂质体等。

腐植酸属于本身无免疫原性的佐剂。

佐剂的作用机制主要为：a.改变抗原的物理性状，延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统；b.刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力；c.刺激淋巴细胞增殖和分化，可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度，这些在腐植酸用于动物免疫试验中都已经显示。因此，腐植酸在辅助肿瘤、前列腺、肝癌、大肠癌、肺癌、癌胚抗原等临床应用中都有一定的效果［18］。

腐植酸作为食品安全检验elisa试剂盒，可以用于食品中的激素、药物、霉菌毒素，以及微生物、维生素等的检测产品。如对番茄青枯病病毒，水产品呋喃唑酮检测试剂盒［19］。

动植物疾病诊断类如猪、牛、羊、马等家畜和禽类等检测试剂盒，可保证兽药残留检测质量可靠和动物性食品安全［20～24］。