第四节 香豆素和木脂素类成分的分析
一、理化性质
（一）香豆素的理化性质
1.物理性质
游离的香豆素类成分在可见光下多为无色或浅黄色结晶，具有一定的熔点，也有一些香豆素类成分呈液态，且大多有香味。分子量小的游离香豆素类成分，多具有升华性和挥发性，能随水蒸气蒸出。游离的香豆素类成分能溶于沸水，难溶于冷水，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷和乙醚等有机溶剂。
香豆素苷多呈粉末状，无香味，无升华性和挥发性，能溶于水、甲醇和乙醇，难溶于乙醚、苯等极性低的有机溶剂。
2.荧光
香豆素母核本身不具有荧光，但羟基香豆素在紫外光灯照射下，多显蓝色或紫色荧光。此外，香豆素类成分荧光的有无或强弱与分子中取代基的种类及位置有关。如7-OH香豆素类往往具有较强的蓝色荧光，加碱碱化后荧光更强，且荧光变为绿色，但若8位再引入—OH，则荧光减至极弱，甚至不显荧光；羟基香豆素醚化或导入非羟基取代基后，荧光强度往往也会减弱，呋喃香豆素多显蓝色或褐色荧光，但较弱；多烷氧基取代的呋喃香豆素一般呈黄绿色或褐色荧光。
（二）木脂素的理化性质
1.物理性质
常见的多数木脂素类化合物为无色结晶，一般没有挥发性，少数具有升华性，如二氢愈创木脂酸。游离态木脂素一般难溶于水，在石油醚中溶解度较小，易溶于苯、三氯甲烷、乙醚、丙酮及乙醇等有机溶剂，有酚羟基存在的木脂素还可溶于苛性碱水溶液；成苷存在的木脂素水溶性增强，也可溶于甲醇、乙醇。
2.旋光性
木脂素常有多个手性碳原子或手性中心结构，因此大部分具有光学活性，且遇碱易异构化。木脂素生理活性常与手性碳原子的构型有关，在分析时应注意操作条件，尽量避免与碱接触，防止其构型的改变；同时在分析含有木脂素的中药饮片时，应对其构型也进行检查，以防在炮制、贮存、运输等过程中发生构型的改变，从而降低甚至丧失临床疗效。
二、定性分析
（一）香豆素的定性分析
1.化学分析法
（1）显色反应 香豆素类物质分子中具有内酯结构，且大多具有酚羟基，通过这些基团的特征性显色反应，能为检视和鉴别香豆素类成分提供参考。
①酚羟基的反应：具有酚羟基取代的香豆素类化合物，在水溶液中可与Fe Cl3试剂反应显色。若酚羟基的邻、对位无取代，可与重氮化试剂反应，显红色～紫红色。
②异羟肟酸铁反应：香豆素类成分具有内酯结构，在碱性条件下内酯环开裂，与盐酸羟胺缩合生成异羟肟酸，再在酸性条件下与Fe3+生成红色的络合物。
③Gibb反应和Emerson反应：在碱性条件下（pH9～10），香豆素类成分内酯环水解开裂，生成酚羟基，如果其对位（C6位）无取代，可与Gibb试剂（2，6-二氯苯醌氯亚胺）反应而显蓝色，或与Emerson试剂（4-氨基安替比林和铁氰化钾）反应显红色；若C6位有取代，则无反应。
（2）荧光法 利用羟基香豆素类化合物一般显蓝色或紫色荧光的性质，可进行定性鉴别。可直接观察提取溶液的荧光，也可观察薄层色谱或纸色谱后斑点的荧光。根据荧光的颜色及强弱初步判断取代基的种类和位置。
2.色谱分析法
（1）薄层色谱 常用硅胶作为吸附剂，并且为了获得较好的分离效果，常用一定pH的缓冲溶液（如3mol/L醋酸钠或0.5mol/L草酸）处理。游离香豆素类可用环己烷（石油醚）-乙酸乙酯（5:1）、三氯甲烷-丙酮（9:1）等溶剂系统展开；香豆素苷类可依极性不同选用不同比例的三氯甲烷-甲醇作为展开剂。展开后可在紫外光灯（365nm）下直接观察荧光斑点，或喷三氯化锑等试剂显色。
（2）纸色谱 香豆素纸色谱常用的展开剂系统有：水饱和的异戊醇、水饱和的三氯甲烷、正丁醇-乙酸-水（4:1:5）、乙酸乙酯-吡啶-水（2:1:1）等的上层溶液。展开后的滤纸可先在紫外光灯（365nm）下观察荧光，若荧光微弱可喷少量碱性溶液以增强荧光，或直接喷10％氢氧化钾乙醇溶液、20％三氯化锑氯仿溶液等试剂显色。
（二）木脂素的定性分析
1.化学分析法
木脂素类化合物没有共同的特征颜色反应，但对磷钼酸乙醇溶液、硫酸乙醇溶液等一些非特征性试剂，不同的木脂素化合物可显不同的颜色，常用于薄层色谱的显色。利用一些显色反应检视木脂素分子中某些功能团的存在与否。如Labat反应和Ecgrine反应可作为具有亚甲二氧基的木脂素的特征反应，前者为化合物加浓硫酸，再加没食子酸，可产生蓝绿色；后者为化合物加浓硫酸，再加变色酸，并保持温度70～80℃持续20min，可产生蓝紫色。氯化铁试剂、重氮化试剂检视酚羟基的存在与否。但应注意，若干扰因素较多，应进行阴性对照实验，以证明其专属性。
2.色谱分析法
木脂素类成分一般亲脂性较强，多采用吸附色谱法可获得较好的效果。常用硅胶薄层色谱；展开剂一般是亲脂性溶剂，如苯、三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇（9:1）、三氯甲烷-乙酸乙酯（9:1）、三氯甲烷-二氯甲烷（9:1）和乙酸乙酯-甲醇（95:1）等；常用的显色剂有：茴香醛浓硫酸试剂（110℃加热5min），5％或10％磷钼酸乙醇溶液（120℃加热至斑点明显出现），三氯化锑试剂（100℃加热10min紫外光灯下观察），碘蒸气（熏后观察应呈黄棕色或置紫外光灯下观察荧光）。
三、定量分析
（一）香豆素的定量分析
（1）分光光度法 在可见光波长区域，通过测定香豆素类成分经显色反应生成的有色物质而得到香豆素类的含量。当干扰成分较多时，可先用薄层色谱进行分离，在紫外光灯下定位，找出相关香豆素类成分，将薄层板上斑点部分完全刮下，用溶剂洗脱后加入试剂显色，进行比色测定。常用试剂为重氮化试剂。香豆素类成分都具有紫外吸收，样品较纯净时，可用紫外光谱直接测定。
（2）薄层扫描法 含香豆素类成分的样品经薄层色谱分离后，可喷洒显色剂显色后扫描，也可利用香豆素类成分能产生荧光的特性，将薄层板置紫外光灯下定位后，直接进行扫描测定，方法简便、准确，是香豆素类成分常用的测定方法之一。
（3）荧光光度法 利用羟基香豆素大多能产生较强荧光的性质，用荧光光度法进行测定，有较高的灵敏度。当干扰成分过多时，同样可先利用薄层色谱进行分离。
（4）高效液相色谱法 香豆素类成分含有芳香环及其他共轭结构，用HPLC测定时有较高的灵敏度。常用的固定相为C18，流动相为不同比例的甲醇-水。对极性小的香豆素类，一般用正相色谱或反相色谱；而对香豆素苷类，一般用反相色谱。均可用HPLC测定含量。
（5）气相色谱法 一些小分子量的香豆素类成分具有挥发性，可利用气相色谱进行含量测定。常用SE-30石英毛细管柱，FID检测器。如中药中的蛇床子素、欧前胡素、香橙内酯、异虎耳草素、花椒毒素、花椒毒酚等均可用GC测定含量。
（二）木脂素的定量分析
（1）分光光度法 用分光光度法测定单体木脂素的含量时，一般需要通过化学方法、柱色谱法、薄层色谱法等分离技术对样品进行净化处理，除去干扰性杂质。另外，木脂素类均有紫外吸收，可直接用紫外光谱法测定吸收度。
（2）薄层扫描法 可用于测定木脂素各单体成分的含量。单体木脂素一般选用薄层吸附色谱，以硅胶为吸附剂，低极性有机溶剂为展开剂。如牛蒡苷、芝麻素、连翘苷均可用此方法。
（3）高效液相色谱法 可用于测定木脂素各单体成分的含量。用高效液相色谱法测定单体木脂素含量时，一般以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈-水或甲醇-水系统为流动相的反相色谱，多用紫外检测器检测。如牛蒡子中牛蒡苷、杜仲中松脂醇二葡萄糖苷、连翘中连翘苷的含量测定均可用高效液相色谱法。