2.1　氨基酸

在早期蛋白质研究中，人们通过对蛋白质进行酸、碱或蛋白酶水解，可以得到分子量较小的肽段，最终获得相应氨基酸的混合物，由此认识到氨基酸是蛋白质的基本结构单元。尽管不同的生物物种中蛋白质的种类和含量差别很大，但归根结底蛋白质是由20种氨基酸（amino acid）组成，这20种氨基酸被称作基本氨基酸或标准氨基酸。大量的蛋白质分析表明，常见的蛋白质都是由20种基本氨基酸组成，但并非每一种蛋白质都含有这20种氨基酸。当然在蛋白质的水解物中也能发现少量罕见的氨基酸，它们都是基本氨基酸的衍生物或异构体。

二十种基本氨基酸都是通过蛋白质的水解作用分离得到的，1806年从芦笋汁液中分离出第一个氨基酸——天冬酰胺，直到1938年在血纤维蛋白水解物中得到最后一个氨基酸——苏氨酸。所有氨基酸都有通俗名字，有的来自于分离原料，如天冬酰胺和天冬氨酸发现于植物天门冬中，谷氨酸在谷物中，酪氨酸在奶酪中，而甘氨酸则因其甜味而取名。

二十种氨基酸都被称为α-氨基酸，即氨基酸分子中的α-碳原子上（分子中第二个碳，Cα）结合一个氨基（—NH2）和一个羧基（—COOH），此外Cα还结合有一个氢原子（H）和一个侧链基团（R基团）。20种氨基酸的区别就在于侧链R基团的不同，侧链上的碳依次按字母命名为β-碳、γ-碳、δ-碳和ε-碳，分别指的是第三、四、五和六位碳（图2.1）。

在氨基酸的结构中含有羧基（—COOH）和氨基（—NH2），但氨基酸在结晶状态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是解离成两性离子，在中性pH（生理条件）下，氨基以质子化）形式存在，羧基以解离态（—COO-）形式存在，因此氨基酸能以酸和碱两种形式起作用。

2.1.1　氨基酸的结构

在氨基酸分子中，如果侧链R基不是氢原子（除甘氨酸外），则Cα上结合了4种不同的基团或原子，这种情况下Cα就是一个不对称碳原子，即Cα是手性碳原子，具有旋光性，含有不对称碳的氨基酸存在两种不能叠合的镜像立体异构体——对映体：L-氨基酸和D-氨基酸（图2.2）。由天然蛋白质水解得到的氨基酸，除甘氨酸外，都是L-氨基酸，而D-氨基酸主要存在于微生物细胞中。

为描述蛋白质和多肽结构的需要，常用缩写符号表示氨基酸。表2.1给出了20种基本氨基酸的中英文名称、三字母缩写符号、单字母缩写符号、分子量、亲水指数以及在蛋白质中的平均出现频率。

2.1.2　氨基酸的分类

二十种基本氨基酸的区别就在于侧链（side chain）R基团的不同，可以根据R基团的性质进行分类。

1）按R基团的化学结构分类

根据R基团的化学结构可以分为：6种脂肪族氨基酸、3种芳香族氨基酸、2种含硫氨基酸、2种含羟基氨基酸、3种碱性氨基酸、2种酸性氨基酸和2种酰胺氨基酸。

（1）脂肪族氨基酸

六种脂肪族氨基酸的结构式见图2.3。

甘氨酸（Gly，G）的结构在20种氨基酸中最简单，它的侧链是个氢原子，因此，甘氨酸的Cα不是手性碳，不具有旋光性。甘氨酸又因为侧链很小，具有更高的柔性，在蛋白质构象中具有特殊作用，可以进入其他氨基酸不能进入的狭缝中。

丙氨酸（Ala，A）、缬氨酸（Val，V）、亮氨酸（Leu，L）和异亮氨酸（Ile，I）是带有饱和脂肪烃链的4种氨基酸。丙氨酸的侧链是一个甲基，其他氨基酸（除Gly和Pro外）的结构都是以丙氨酸结构为基础形成的；缬氨酸含有一个分支状3碳侧链；亮氨酸和异亮氨酸都带有4碳分支侧链。其中缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的侧链碳原子具有分支，故被称为分支氨基酸，这3种氨基酸具有高度疏水性（hydrophobicity）。值得注意的是，异亮氨酸的α-碳和β-碳都是不对称碳，所以异亮氨酸存在4种立体异构体：L-异亮氨酸、D-异亮氨酸、L-别构异亮氨酸、D-别构异亮氨酸。但在蛋白质结构中只有L-异亮氨酸存在。上述4种脂肪族氨基酸侧链缺乏反应功能基团，具有聚集成簇倾向，可以通过疏水相互作用来稳定蛋白质的三维结构。

脯氨酸（Pro，P）不同于其他19种氨基酸，侧链上的3个碳原子不仅与α-碳结合，还与氨基的氮原子结合，形成环状分子，所以脯氨酸分子上的氨基是二级氨基，即脯氨酸是亚氨基酸。脯氨酸的α-碳也是手性碳，其环状结构限制多肽的空间构型，常常引起多肽链的转折，改变多肽链的方向。

（2）芳香族氨基酸

三种芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe，F）、酪氨酸（Tyr，Y）和色氨酸（Trp，W）的侧链都含有芳香族基团（图2.4），其中苯丙氨酸侧链是苯基，具有很强的疏水性；酪氨酸又被称为对羟基苯丙氨酸，其侧链带有酚基，酚基是比较弱的酸，所以酪氨酸侧链的pKa为10.5；色氨酸的侧链带有双环的吲哚环，又被称为吲哚丙氨酸。由于酪氨酸和色氨酸的侧链都带有极性基团，它们的疏水性没有苯丙氨酸那么强。这三种芳香族氨基酸在中性pH条件下，在波长280nm附近都有特征吸收峰，利用这一特性可以检测这些氨基酸的浓度。

（3）含硫氨基酸

甲硫氨酸（Met，M）和半胱氨酸（Cys，C）是两个含硫氨基酸（图2.5）。甲硫氨酸也叫蛋氨酸，其侧链带有非极性的甲基，疏水性很高，蛋氨酸是大多数多肽链生物合成时的起始氨基酸；半胱氨酸与丙氨酸结构相似，又称为巯基丙氨酸，其巯基替换了甲基上的氢原子，其侧链疏水性较弱，但反应性非常高，因为硫原子是可极化的原子，且巯基能与氧和氮形成弱的氢键。半胱氨酸的巯基是弱酸，易失去质子带负电荷。胱氨酸（cystine）是由两个氧化的半胱氨酸通过一个二硫键连接而成，二硫键（disulfide bond）或称二硫桥（disulfide bridge）在稳定蛋白质三维结构中起着重要作用。两个半胱氨酸的侧链在三维空间上虽然相距很近，但在多肽链上的排列顺序不需要很近，另外二硫键也可以在不同的多肽链之间形成。

（4）含羟基氨基酸

丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）是两个侧链上含有β-羟基的氨基酸，结构式见图2.6，不带电荷但具有极性（polarity）和亲水性（hydrophilicity）。丝氨酸和苏氨酸的羟基与酸性较强的酪氨酸上的酚基不同，具有一级醇和二级醇的弱离子化倾向。丝氨酸上的羟甲基（—CH2OH）在水溶液中几乎不解离，但可以参与很多酶的活性中心反应，就像离子化一样的反应；苏氨酸与异亮氨酸相同，都具有2个手性碳原子、4种立体异构体，但在蛋白质中出现的只有L-苏氨酸。

（5）碱性氨基酸

组氨酸（His，H）、赖氨酸（Lys，K）、精氨酸（Arg，R）侧链都有含氮碱基（图2.7），在pH7时都带正电荷，具有亲水特性。组氨酸的侧链含咪唑基又称咪唑丙氨酸，咪唑基的pKa为6.0，在20种氨基酸中只有组氨酸侧链在生理pH范围内解离；赖氨酸拥有α-氨基和ε-氨基，是二氨基酸，在中性条件下ε-氨基以碱性氨离子（）形式存在，在蛋白质中带正电荷；精氨酸侧链上的胍基在细胞中以质子化形式存在，也赋予蛋白质正电荷。精氨酸是20种氨基酸中碱性最强的氨基酸，其侧链胍基pKa最高，为12.48。

（6）酸性氨基酸及其衍生物

两种酸性氨基酸及其对应的酰胺氨基酸的结构式见图2.8。天冬氨酸（Asp，D）和谷氨酸（Glu，E）都具有2个羧基，除了α-羧基外，天冬氨酸侧链是β-羧基，谷氨酸侧链是γ-羧基。在pH7时侧链上的羧基离子化，带负电荷。天冬氨酸和谷氨酸在生理条件下几乎是与共轭碱基存在。谷氨酸钠盐是我们熟悉的调味品——味精。

天冬酰胺（Asn，N）和谷氨酰胺（Gln，Q）分别是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺化产物，它们的侧链虽然不带电荷，但极性却很强，多数情况下位于蛋白质的表面与水相互作用。另外，这两种氨基酸的酰胺基还可以与其他氨基酸侧链的原子形成氢键。

2）按氨基酸侧链的极性分类

根据氨基酸侧链的极性可以分为以下几类：

①非极性氨基酸（9种）：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。

②极性不带电荷氨基酸（6种）：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸。

③极性带电荷氨基酸（5种）：赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。

每种氨基酸都带有不同的侧链，使得20种氨基酸表现出不同的相对疏水性（hydrophobicity）或者亲水性（hydrophilicity）。依据表2.1中的亲水指数，其中具有高度疏水性的氨基酸有：Ile、Val、Leu、Phe、Met；高度亲水性氨基酸有：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、His。通常情况下，蛋白质中疏水性氨基酸残基易聚集在内部，而亲水性氨基酸残基多存在于球状蛋白分子的表面。

3）从营养学的角度分类

从营养学角度将20种氨基酸分为必需氨基酸（essential amino acids）和非必需氨基酸。必需氨基酸是指在人体内不能合成或合成量很少，必须由食物供给的氨基酸；而非必需氨基酸则可以不必从外界摄取，人体自身可以由必需氨基酸转化或用其他非氨基酸原料合成。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸通常被称为8种人体必需氨基酸。组氨酸和精氨酸人体虽然能够合成，但是在婴幼儿时期合成效率较低，也需要由外界供给，所以也有10种人体必需氨基酸的说法。半胱氨酸和酪氨酸在体内分别由甲硫氨酸和苯丙氨酸转变而成，如果膳食中能直接提供这两种氨基酸，则人体对甲硫氨酸和苯丙氨酸的需要可分别减少30％和50％，所以半胱氨酸和酪氨酸被称为条件必需氨基酸或半必需氨基酸。

蛋白质营养价值的高低取决于其所含必需氨基酸的种类、含量及其比例是否接近人体需要，越接近的营养价值就越高，反之则营养价值低。动物性蛋白质所含的必需氨基酸在组成和比例方面比较接近人体需要，所以营养价值比较高，如蛋、奶、肉、鱼等被称为优质蛋白质，其中鸡蛋中蛋白质与人体蛋白质氨基酸模式最接近；而植物性蛋白质往往相对缺少赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和色氨酸，其营养价值相对较低。食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸相对含量较低，导致其他必需氨基酸在体内不能被充分利用而浪费，造成蛋白质营养价值降低，这些含量相对较低的必需氨基酸被称为限制氨基酸。

为了提高植物性蛋白质的营养价值，可以根据不同来源蛋白质的氨基酸种类和含量，进行营养搭配，往往将两种或两种以上的食物混合食用，达到氨基酸互补目的。多种食物混合食用，相互补充必需氨基酸，这种作用称为蛋白质互补作用。如将大豆制品和米面同时食用，大豆蛋白可弥补米面蛋白质中赖氨酸的不足，米面也可以在一定程度上补充大豆蛋白中甲硫氨酸的不足，从而提高膳食蛋白质的营养价值。

2.1.3　氨基酸的性质

氨基酸的性质会影响其组成的蛋白质的性质，是氨基酸分析和分离的基础，也是测定蛋白质的氨基酸组成和序列的必要知识。

1）氨基酸的解离

在水溶液中，以两性离子形式存在的氨基酸既可以作为酸（质子供体，donor），也可以作为碱（质子受体，acceptor）。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。每种氨基酸都有2个或3个pK值，在一定的pH条件下，氨基酸带有不同的净电荷。以甘氨酸为例说明在不同pH条件下的解离情况（图2.9），pK1、pK2分别代表α-COOH和α-NH2的解离常数的负对数。

氨基酸的pK值可以通过绘制滴定曲线的方法获得。图2.10是甘氨酸的滴定曲线，1mol甘氨酸溶液的pH约为6.0，用标准盐酸溶液进行滴定，得到滴定曲线A；曲线的转折点即为pK1=2.34，即α-COOH的pKa为2.34，pH和pKa分别表示质子浓度和离子平衡常数。在此pH条件下，H3N+CH2COO-和H3N+CH2COOH为等物质的量浓度。在低pH条件下，甘氨酸以完全质子化的H3N+CH2COOH状态存在。用标准氢氧化钠溶液进行滴定，得到滴定曲线B；曲线的转折点即为pK2=9.60，即为的pKa值，此时有一半的H3N+CH2COO-转变成H2NCH2COO-。当pH12左右时，甘氨酸的主要形式是H2NCH2COO-。甘氨酸在2.34和9.60为中心的缓冲区段有缓冲能力，但在细胞间液或血液中不是一个好的缓冲剂。

侧链基团不解离的氨基酸都具有与甘氨酸类似的滴定曲线。带有可解离侧链的氨基酸，如酸性氨基酸和碱性氨基酸的侧链分别含有可解离的羧基和氨基，它们的滴定曲线比较复杂，有三个pK值，即pK1、pKR、pK2，其中pKR为侧链基团解离常数负对数（图2.11）。

表2.2给出了20种氨基酸的pKa值和等电点。从表2.2中可以看出，大多数氨基酸（除组氨酸外）的pK值都不在生理pH（pH7左右）范围内，所以在pH7附近没有明显的缓冲作用。组氨酸的咪唑基pK为6.0，它在pH7附近具有明显的缓冲作用。红细胞中运送氧气的血红蛋白分子中含有较多的组氨酸残基，使得它在血液中具有显著的缓冲能力，是维持血液pH稳定的主要因素之一。

2）氨基酸的等电点

从甘氨酸的解离曲线可以看出，氨基酸的带电状况与溶液的pH有关，改变pH可以使氨基酸带不同的电荷，当正负电荷相等时，即净电荷为零，氨基酸呈两性离子状态，此时对应的pH值即为氨基酸的等电点（isoelectric point，简写pI）。

侧链R基不含解离基团的中性氨基酸其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：

对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。

酸性氨基酸：

碱性氨基酸：

在任意pH条件下氨基酸的带电种类和带电量是可以预测的。在等电点处，氨基酸所带的净电荷为零，在电场中既不向正极移动，也不向负极移动；当溶液的pH大于pI时，氨基酸带有净负电荷，在电场中向正极移动；当溶液pH小于pI时，氨基酸带净正电荷，在电场中向负极移动。可以利用氨基酸在高于或低于其等电点的溶液中带电性质，在电场中移动来分离氨基酸。另外，氨基酸处于其等电点时溶解度最小，该氨基酸在溶液中将大部分或全部沉淀下来，其他等电点高于或低于该pH的氨基酸仍保留在溶液中，因此可利用此性质进行氨基酸分离。

3）氨基酸的甲醛滴定（formol titration）

氨基酸是一种两性物质，既是酸又是碱，但是它不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定，这是因为氨基酸的酸碱滴定的pH或过高（pH12～13）或过低（pH1～2），没有适当的指示剂可被选用。在氨基酸溶液中加入过量的甲醛时，甲醛与氨基酸的氨基发生加成反应，生成单或双羟甲基氨基酸的衍生物，此时氨基酸已经不是以两性离子形式存在，而是与一元羧酸相同，因此可以进行普通的酸碱滴定（图2.12）。

氨基酸的氨基被羟甲基化后，碱性下降，其pK2值减少2～3个pH单位，当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pH12左右移至pH9附近，用标准氢氧化钠溶液滴定时可以用酚酞作为滴定氨基酸羧基的指示剂。氨基酸的甲醛滴定是测定氨基酸的一种常用方法，可以用来直接测定氨基酸的浓度。

4）氨基酸的紫外吸收

酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在近紫外区（200～400nm）都有吸收光的能力，因为它们的R基含有苯环共轭π键系统。酪氨酸的最大吸收波长（λmax）在275nm，苯丙氨酸在257nm，色氨酸在280nm（图2.13）。由于蛋白质含有这3种氨基酸或其中的1～2种，因此可以利用分光光度法在280nm波长处很方便地测定样品中的蛋白质含量。

2.1.4　氨基酸的特征化学反应

氨基酸的α-氨基、α-羧基以及各种侧链R基团可以进行很多种化学反应。这里简单介绍几种广泛应用于鉴定和测定氨基酸的化学反应。

1）与亚硝酸反应

氨基酸的α-氨基在室温下与亚硝酸作用生成氮气，反应式如图2.14所示。

在标准条件下测定生成的氮气体积，可计算出氨基酸的量，这是范斯来克（Van Slyke）法测定氨基氮的原理。该反应生成的氮气只有一半来自氨基酸，另一半来自亚硝酸。应该指出的是：亚硝酸与α-氨基反应3～4min即完成，但与赖氨酸的ε-氨基反应则很慢。

2）与茚三酮反应

氨基酸与茚三酮（ninhydrin）的反应是检测和定量氨基酸及多肽的重要反应。茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，具有游离α-氨基的氨基酸氧化脱氨、脱羧，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮生成蓝紫色复合物（图2.15）。作为亚氨基酸的脯氨酸与茚三酮反应不释放NH3，而直接生成黄色化合物。利用茚三酮显色可以定性鉴定或用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸，释放的CO2可用测压法测量，并计算出参加反应的氨基酸的量。

3）与2，4-二硝基氟苯、丹磺酰氯、苯异硫氰酸酯的反应

下述几种与氨基酸中α-氨基发生反应的试剂常用来鉴定蛋白质和多肽的N端氨基酸残基。

①2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）也叫Sanger试剂，在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸）（图2.16）。

②丹磺酰氯（dansylchloride，DNS-Cl）在弱碱性溶液中与氨基酸反应，生成具有荧光性质的稳定物质——丹磺酰衍生物（DNS-氨基酸）（图2.17）。

③苯异硫氰酸酯（phenylisothiocyanate，PITC）在弱碱性条件下与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），该反应又称为Edman反应，在蛋白质测序中被称为Edman降解法。目前使用的多肽序列自动分析仪是利用该原理设计的，可测定只有1μmol/L的样品（图2.18）。

4）侧链参与的反应

氨基酸侧链中的羟基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基等都可以和多种试剂发生反应，其中有些反应是蛋白质化学修饰的基础。

①鲍林（Pauling）反应：酪氨酸、组氨酸与重氮化合物（5％对氨基苯磺酸盐溶液、亚硝酸钠、碳酸钠）发生反应，酪氨酸生成橘红色化合物，组氨酸生成棕红色的化合物（图2.19）。

②米伦（Millon）反应：米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液）加入到酪氨酸或含有酪氨酸残基的蛋白质溶液中，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀。

③Folin-酚试剂反应（Lowry法）：酪氨酸和色氨酸与Folin试剂（磷钼酸和磷钨酸）在碱性条件下反应，生成蓝色物质。

④坂口（Sakoguchi）反应：精氨酸的特有反应。精氨酸与碱性次溴酸钠、α-萘酚反应，生成红色物质。

⑤乙醛酸（glyoxylate）反应：色氨酸特有的反应。色氨酸与乙醛酸、浓硫酸反应，在溶液的界面处产生一种紫红色物质。

⑥半胱氨酸的反应：可与亚硝酸-铁氰化钠的甲醇溶液反应生成一种红色物质。半胱氨酸与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应，产物在412nm处有强烈吸收，可应用此反应定量测定半胱氨酸的含量。

2.1.5　非标准氨基酸

截至目前，从生物体中发现的氨基酸已有几百种之多，除了20种标准氨基酸，在蛋白质中还存在其他不常见氨基酸，称为非标准氨基酸（图2.20）。除了参与蛋白质组成的氨基酸，还在各种组织和细胞中存在一些氨基酸，它们多为α-氨基酸的衍生物及β-氨基酸、γ-氨基酸或δ-氨基酸，还有极少量的D-氨基酸。如β-丙氨酸是合成B族维生素泛酸的一个中间体；脯氨酸衍生物——4-羟脯氨酸（4-hydroxyproline）和赖氨酸衍生物——5-羟赖氨酸（5-hydroxylysine）存在于连接组织的纤维胶原蛋白中，4-羟脯氨酸在植物细胞壁蛋白质中也有存在；6-N-甲基赖氨酸（6-N-methyllysine）是肌球蛋白的组分；γ-羧基谷氨酸（γ-carbxyglutamate）发现于血栓凝血蛋白酶原以及某些能结合钙离子的蛋白质中；还有硒代半胱氨酸（selenocysteine）、锁链赖氨素（desmosine）、O-磷酸丝氨酸、3-甲基谷氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸等。非标准氨基酸都是在已合成的肽链上由基本氨基酸经专一酶催化而进行修饰生成的，肽的N端氨基和C端羧基也能被化学修饰。通常情况下，在生物体内氨基酸的修饰对蛋白质的功能即使不是必需的，也起着重要的作用。鸟氨酸（ornithine）和瓜氨酸（citrulline）并不是蛋白质的组分，而是尿素循环和精氨酸生物合成的中间代谢物。

2.1.6　生物活性氨基酸

二十种基本氨基酸经历了复杂的化学变化，转变成为其他氨基酸和相关化合物，成为细胞合成和降解的一部分。少数情况下，氨基酸代谢的中间体具有直接作为20种氨基酸的前体或降解产物以外的功能。许多氨基酸并不作为合成多肽的原料，而是具有其独自功能。有些有机体利用某些氨基酸，以氨基的形式来转运氮；氨基酸也可作为代谢的燃料被氧化供能。此外，氨基酸及其衍生物经常作为化学信使在细胞通信中起重要作用。例如：甘氨酸、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，谷氨酸脱羧产物）、多巴胺（dopamine，一种酪氨酸衍生物）都是神经递质，是由神经细胞释放用于改变邻近神经细胞行为的物质。组胺（histamine，组氨酸脱羧产物）是一种变态反应的强有力的局部介体。甲状腺素（thyroxine，一种酪氨酸衍生物）是一种刺激脊椎动物新陈代谢的含碘的甲状腺激素（图2.21）。