2.2　肽

2.2.1　肽和肽键

肽是氨基酸的聚合物，也常被称作肽链（peptide chain）。一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩合，失去一分子水，通过酰胺键（—CO—NH—）将两个氨基酸连接在一起，这个酰胺键称为肽键（peptide bond），氨基酸缩合形成的化合物称为肽（peptide），在肽链中的氨基酸被称为氨基酸残基（amino acid residue）。

最简单的肽由两个氨基酸残基组成，含有一个肽键称为二肽（dipeptide），图2.22由丙氨酸和丝氨酸缩合形成的二肽，因为丝氨酸的氨基已被丙氨酰取代，此二肽被称为丙氨酰丝氨酸。三肽是由3个氨基酸残基通过二个肽键构成，依次，有四肽、五肽等，通常把几个到十几个氨基酸残基组成的肽链称为寡肽（oligopeptide），更多氨基酸残基形成的肽链称为多肽（polypeptide）。多肽链中每形成一个肽键就丢失一分子水，丢失的水分子数应比氨基酸残基数少一个。

在肽链中，氨基酸残基按一定顺序排列称为氨基酸序列，是肽和蛋白质最重要的性质之一，称为蛋白质的一级结构。通常一条多肽链主链的一末端含有一个游离的α-氨基称为氨基端或N端（amino terminal），在另一末端含有一个游离的α-羧基称为羧基端或C端（carboxyl terminal）。当两个游离的末端基团形成肽键时，该肽被称为环肽（cyclicpeptide）。肽链中氨基酸序列是从N端至C端，所以肽链中氨基酸残基的排列顺序都是从左向右书写，图2.22的二肽简写为Ala-Ser，如果反过来书写的Ser-Ala则是另一种不同的二肽。

由肽键的4个原子—CO—NH—和相邻的2个Cα构成了一个平面，称为肽平面（peptide plane）。20世纪30～40年代，Linus Carl Pauling和Robert Corey研究表明：由于共振相互作用，肽平面是具有刚性的平面结构，肽键的C—N键虽然是单键，却有部分双键性质，不能自由旋转。但肽链中的N—Cα键和C—Cα键都可以自由旋转（图2.23）。

肽平面通常取反式构象（trans conformation），即连续的Cα原子分别位于肽链的两侧；顺式构象（cis conformation）中肽平面上的2个Cα原子位于肽键同侧。由于相邻侧链间的立体位阻，顺式构象比反式构象的稳定性要低。多数情况下，反式结构在能量上更有利。但脯氨酸残基因其环状结构，立体干扰减小，使得蛋白质中大约10％的脯氨酸残基以顺式构象存在，这也是脯氨酸残基常引起多肽链转向的原因所在。

从肽链结构看，肽链的骨架或主链是指除氨基酸残基侧链之外的参与肽键的原子，即—Cα—C—N—Cα—序列的重复排列，处于同一个肽平面，称为共价主链（main chain或backbone）。肽链骨架可以被看作是一串相连的刚性肽平面，它们可以用若干个残基绕Cα—N键旋转ф角度和绕Cα—C键旋转ψ角度的二面角（dihedral angle）来描述（图2.24）。

2.2.2　肽的性质

多肽的分子量可以粗略地进行计算。蛋白质中含有的氨基酸以侧链较小的氨基酸出现概率较大，它们的平均分子量大约为128，在形成肽键时失去一分子水（Mr18）后，氨基酸残基平均分子量约为110，由此已知多肽或蛋白质的氨基酸残基数目可以推算其分子量。

蛋白质中的肽键在多数细胞环境中比较稳定，其半衰期（t1/2）大约为7年，但在体外肽键可以被酸、碱或酶水解，完全水解可获得游离氨基酸的混合物，不同蛋白质的水解所得到的氨基酸种类和数量相差很大。

多肽分子可以被看作是一个“大的氨基酸分子”，含有游离的α-氨基和α-羧基，由于相对距离较远，它们之间的静电引力较弱，因此肽链末端的α-羧基的pKa值比游离氨基酸的α-羧基pKa要大一些，而α-氨基的pKa相比氨基酸的要小，侧链R基的pKa值在二者之间相差不大。

多肽也具有两性解离性质，在水溶液中以两性离子形式存在，有等电点。在等电点处，正离子数与负离子数相等，净电荷为零，电泳时不移动，此时多肽在溶液中的溶解度最小。肽链等电点的高低主要取决于肽链中氨基酸侧链酸性和碱性基团的相对数目。

肽的化学反应也和氨基酸一样，游离的α-氨基、α-羧基和R基可以发生与相应氨基酸基团类似的反应。也能与茚三酮发生反应，生成呈色物质，这一反应广泛应用于肽的定性和定量测定中。肽和蛋白质还能与碱性CuSO4溶液发生反应，生成紫红色或蓝紫色复合物，该反应称为双缩脲反应（biuret reaction）（图2.25），是肽（除二肽以外）和蛋白质所特有而氨基酸没有的反应，利用分光光度计可以测定蛋白质的含量。

2.2.3　肽的化学合成

多肽合成最初是在20世纪初由德国的费歇尔（Hermann Emil Fischer）设计的，合成了由18种氨基酸分子组成的多肽，整个反应是在溶液中进行，故称为多肽液相合成法（liquid phase peptide synthesis）。反应中肽链可以从N端向C端方向，也可以从C端向N端方向延伸：一个氨基酸的α-氨基和另一个氨基酸的α-羧基被保护基团保护起来，参与肽键形成的羧基被活化，如形成酰氯或酸酐；活化的羧基受到游离的氨基亲核攻击形成带有保护基团的二肽，最后通过水解，有选择地除去保护基团而得到完整的多肽。1963年梅里菲尔德（Robert Bruce Merrifield）设计了一种新的合成肽途径，被称作多肽固相合成法（solid phase peptide synthesis），并成功合成了舒缓激肽（9肽）和核糖核酸酶（124个氨基酸残基），由此获得了1984年的诺贝尔化学奖。

多肽固相合成法中主要考虑固相载体、氨基酸的保护策略和缩合试剂的选择。图2.26给出了多肽固相合成的简单过程：首先将肽链C端第一个氨基酸的氨基加以保护，使其羧基与树脂共价结合，将氨基酸导入到树脂上；然后选用适当试剂除去氨基保护基；再通过活化酯活化第二个氨基被保护的氨基酸羧基，在缩合试剂作用下，与第一个氨基酸的氨基缩合形成肽键，由此在固相载体上得到了一个带有氨基保护基的二肽。循环上述反应，使肽链从C端向N端延长，直至得到所需要的肽链，最后除去N端保护基和侧链保护基，裂解肽链与树脂之间的酯键，得到目的多肽。

固相合成法与传统的液相合成法相比具有许多优点：反应产物被连接在固相载体上，整个反应可以在一个容器中进行；反应物与生成物很容易分离，节省了繁琐的纯化步骤；加入过量的反应物可以获得高产率的目标产物；操作简便，便于自动化操作。目前，自动多肽合成仪就是根据该原理设计的。

2.2.4　生物活性肽

在生物体内存在着许多具有各种特殊生物功能的活性肽（bioactive peptides），其组成从两个到成千个氨基酸残基。二肽也有着重要的生物学作用，如人工合成的二肽阿斯巴甜（aspartame）——天冬氨酰苯丙氨酸甲酯（天冬甜素）常作食物的甜味剂（图2.27），它的甜度是蔗糖的200倍。

下面介绍几种常见的生物活性肽。

1）胰岛素

1921年加拿大科学家Frederick Grant Banting在牛胰腺中提取了一种蛋白激素——胰岛素（insulin），由此他获得了1923年诺贝尔生理学或医学奖。胰岛素的生理功能主要是促进细胞摄取葡萄糖，促进肝糖原和肌糖原的合成，抑制肝糖原分解，是目前治疗Ⅰ型糖尿病的首选药物（图2.28）。

胰岛素的一级结构由美国科学家Frederick Sanger确定，获得了1958年诺贝尔化学奖。胰岛素分子含有51个氨基酸残基，两条多肽链，一条由21个氨基酸残基组成的A链，另一条是30个氨基酸残基组成的B链。分子中含有二个链间二硫键和一个链内（A链）二硫键，分子质量为5700Da（图2.29）。1965年9月中国科学家首次成功人工合成了牛胰岛素。

2）抗生素肽

有些肽类或肽的衍生物具有抗生素的作用，如短杆菌肽S（gramicidin S）、多黏菌素E（polymyxin E）和放线菌素D（actinomycin D）等。

3）谷胱甘肽

1921年被发现，1930年确定了化学结构的谷胱甘肽（glutathione）是γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，含有游离的—SH基，有两种形式：还原型（GSH）和氧化型（GSSG），生理条件下以还原型谷胱甘肽为主要形式（图2.30）。主要生理功能是抗自由基、抗衰老、抗氧化（图2.31）。还原型谷胱甘肽在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，可阻止氧化血红蛋白，也可以保护酶分子中—SH基，有利于酶活性发挥，并且能恢复已被破坏的酶分子中—SH基的活性功能，使酶重新恢复活性。谷胱甘肽还可以抑制乙醇侵害肝脏所产生的脂肪肝。

4）脑啡肽

脑啡肽（enkephalin）是在中枢神经系统中形成的一类小的活性肽，与大脑吗啡样受体有很强的亲和力，镇痛作用与吗啡类似，这类活性肽有Met-脑啡肽和Leu-脑啡肽等，它们的结构很相似，N端的四个氨基酸残基相同（图2.32）。

5）激素类多肽

由生物体内多种腺体和组织分泌产生的激素类多肽，对生物的生长发育和代谢具有重要的调控作用。如催产素、加压素（图2.32）和舒缓激素肽等。

6）海洋多肽类

海洋生物（如海绵、海鞘、海兔、蓝藻、海洋微生物、贝类、鱼类、海星、海葵以及芋螺等）中含有微量的多肽类物质，以环肽结构居多，其环肽结构中常含有一个以上的Pro，并且肽链中常含有一些特殊氨基酸，如D-氨基酸、羟基氨基酸、不常见的α-氨基酸及β-氨基酸等。这些多肽常常在很低浓度下具有生物活性，如海兔抑制素Dolastatin 10是目前已知抗癌活性最强的天然海洋产物（图2.33），对P388白血病细胞的IC50值为2～10ng/mL，对B16黑色素瘤治疗剂量仅为1.1μg/mL，具有广谱抗癌适应性。其抗癌机理主要是抑制微管蛋白的聚合，导致纺锤体不能形成，使细胞不能完成分裂，直至癌细胞死亡。

7）其他肽

一些蕈产生的毒素也是肽类化合物，如α-鹅膏蕈碱（α-amanitin）是从鹅膏蕈属或称捕蝇蕈属的鬼笔鹅膏中分离出来的一个环八肽，是一种毒素。α-鹅膏蕈碱能与真核生物的RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ特异结合，抑制RNA合成，但不影响原核生物的RNA合成。此外，白毒伞还含有一种有毒的环七肽——鬼笔毒环肽（phalloidin）（图2.33），其致命性不强，具有一个极具前景的用途：将毒素吸附于荧光染料上面，可以用来研究细胞的内部作用机制，窥视细胞如何分裂，揭开癌细胞和组织生长之谜。

许多动物多肽也具有生物活性，如水蛭多肽——水蛭素（hirudin）由65～66个氨基酸残基组成，对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止发现的最强凝血酶天然特异抑制剂；蛙皮多肽能舒张血管；眼镜蛇肽毒可用于治疗晚期癌痛、神经痛、风湿性关节痛、带状疱疹等顽固性疼痛；麝香的水溶性肽类具有显著的抗炎作用等。