3.6　酶的抑制作用

抑制剂与酶相互作用可以使酶的活性降低或完全丧失，这种现象称为酶的抑制作用（inhibition）。外源物质或细胞内的正常代谢物可能抑制某一特定酶的活性，因此酶的抑制剂可以用来研究酶的作用机制和代谢途径，也可以用作人类防病治病的药物，还可以应用于研发新型农药。众所周知，艾滋病（获得性免疫缺陷综合征，AIDS）是通过人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和破坏宿主免疫系统而引起的一种疾病。HIV是RNA病毒，侵入宿主后在HIV反转录酶（reverse transcriptase）作用下转录成DNA，合成病毒蛋白。病毒编码的HIV蛋白酶（HIV protease）水解并释放病毒蛋白，使得病毒得以繁殖，所以研究和开发HIV反转录酶和HIV蛋白酶的抑制剂，可达到预防和治疗AIDS的目的。几丁质合成酶是几丁质生物合成中的关键酶，而由微生物产生的几丁质合成酶抑制剂能够抑制该酶活性，阻止几丁质的生物合成，从而抑制真菌生长或阻止昆虫幼虫和蛹蜕皮，达到杀虫效果，而哺乳类动物没有几丁质代谢系统，所以筛选几丁质合成酶抑制剂有望开发出新型、对人低毒无害、环保的抗真菌剂和杀虫剂。由此可见，抑制剂的研究无论是在基础理论研究方面，还是在实际应用方面都具有极其重要的意义。

3.6.1　酶催化反应的抑制作用和类型

抑制作用可以分为两种类型：不可逆抑制作用和可逆抑制作用。

1）不可逆抑制作用

酶活性部位的氨基酸残基与抑制剂通过共价键结合，使酶永久失活，这种作用称为不可逆抑制作用（irreversible inhibition）。使用透析、超滤或凝胶过滤方法不能除去这类抑制剂，酶活性得不到恢复。可以通过不可逆抑制剂，研究酶活性中心的必需基团。不可逆抑制作用根据选择性不同可分为两类：非专一性不可逆抑制剂和专一性不可逆抑制剂。

（1）非专一性不可逆抑制剂

抑制剂作用在酶的一类或多类基团上，引起酶失活，包括以下几类。

①有机磷化合物：二异丙基氟磷酸（DIFP）与乙酰胆碱酯酶（一种丝氨酸蛋白酶）的活性部位丝氨酸的羟基共价结合，使酶不可逆失活（图3.22），从而使乙酰胆碱不能被水解成乙酸和胆碱，造成乙酰胆碱积累（有毒），阻断神经传导。这类物质还有马拉硫磷、对硫磷、敌百虫和敌敌畏等有机磷杀虫剂，都可引起神经中毒，因此被称为神经毒剂。

②有机汞、有机砷化合物：与含巯基的酶或含硫辛酸的辅酶结合，导致酶失活。

③氰化物、硫化物和CO：与酶分子中的金属离子形成稳定的络合物，如氰化物与铁卟啉中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。

④重金属及重金属盐（Ag、Cu、Pb、Hg等）：导致蛋白质变性，从而影响酶活。

⑤烷化剂：作用于酶中巯基、氨基、羧基和咪唑基等，如碘乙酸可使酶中—SH烷化，使酶活性丧失。

⑥青霉素：青霉素是一种抗生素，对糖肽转肽酶的抑制作用是不可逆的。一旦糖肽转肽酶失活，细菌合成细胞壁时就不能促使肽聚糖交联，从而阻止细胞壁形成，导致细菌死亡。

（2）专一性不可逆抑制剂

这类抑制剂针对某种酶活性中心的某一必需基团共价结合，导致酶永久失活。

2）可逆抑制作用

酶与抑制剂通过非共价键结合，导致酶活性降低或丧失的作用称为可逆抑制作用（reversible inhibition）。相对于不可逆抑制作用，可逆抑制作用的反应是可以解离、恢复的，抑制剂可以使用透析等方法除去，酶活性可以重新得到恢复。根据酶催化反应特征，可逆抑制作用可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。

（1）竞争性抑制（competitive inhibition）

抑制剂与底物结构相似，可以与底物竞争结合在酶的活性中心。酶既可与底物分子结合（ES），又可与抑制剂分子结合（EI），但不能同时与二者结合。一旦抑制剂与酶结合就阻止了底物与酶的结合，抑制酶的活性。琥珀酸脱氢酶可以将琥珀酸转化成延胡索酸，丙二酸与琥珀酸结构类似，也能与琥珀酸脱氢酶结合，但反应不能脱氢生成产物，酶失去了催化功能（图3.23）。

在治疗甲醇中毒时，可以利用乙醇作为竞争性抑制剂。甲醇有小毒，但被肝脏中的醇脱氢酶转变成甲醛具有高毒性，少量的甲醛就可导致失明，大量可致死。但乙醇与甲醇竞争地结合肝中醇脱氢酶后，多余的甲醇就可随尿排出体外，减少了对人体的伤害，而乙醇被转化成乙醛，很容易被继续代谢成无毒物质（如乙酸）。

（2）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）

抑制剂和底物结合在酶的不同部位，二者没有竞争性。酶可以与抑制剂先结合（EI）；也可能先与底物结合（ES），再和抑制剂结合（ESI），但形成的EI或ESI不能进一步分解成产物，因此抑制了酶活性。通常情况是抑制剂结合在酶活性中心以外的部位，如调节部位等。金属螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）对金属酶的抑制、亮氨酸对精氨酸酶的抑制都是非竞争性抑制。

（3）反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）

抑制剂不能与游离的酶结合，只能与酶和底物的复合体（ES）结合形成ESI，而ESI不能分解成产物。这种抑制剂只影响酶的催化作用，但不影响酶与底物结合，所以反竞争性抑制只针对多底物酶。

3.6.2　可逆抑制作用动力学

在米氏方程基础上确立可逆抑制作用动力学，也就是确立抑制剂、底物与酶促反应速率之间的关系。

1）竞争性抑制

在竞争性抑制作用中，酶与底物、抑制剂的结合都是可逆的，其动力学反应式如下：

Ki为抑制剂常数（inhibitor constant），表示酶与抑制剂复合物（EI）的解离常数。[I]表示抑制剂的浓度，[Ef]为游离酶的浓度，[EI]为酶与抑制剂复合物浓度。在竞争性抑制反应中，酶的总浓度为：

[E0]=[Ef]+[ES]+[EI]

根据米氏方程得：

Km=[Ef][S]/[ES]，即：[Ef]=Km[ES]/[S]

所以：[E0]=Km[ES]/[S]+[ES]+[Ef][I]/Ki

　　　　　　=Km[ES]/[S]+[ES]+Km[ES][I]/Ki[S]

整理得：[ES]=[E0][S]/{Km（1+[I]/Ki）+[S]}

ES分解生成产物的反应速率v，也就是总反应速率：

v=k3[ES]

最大反应速率：vmax=k3[E0]

竞争性抑制的酶促反应动力学方程式可表示为：

由上式和取双倒数作图（图3.24）。从图3.24（a）中可以看出，加入竞争性抑制剂后，vmax不变，Km变大，，随着抑制剂浓度增加而增大，说明在有抑制剂存在的情况下，底物与酶的亲和力减小；（b）图中Y轴截距不变，X轴截距变短，即vmax不变，Km变大。由此得知，增加S浓度，可以增加ES浓度，减小酶的竞争性抑制。

2）非竞争性抑制

非竞争性抑制的动力学反应式如下：

在非竞争性抑制反应中，酶的总浓度为：

[E0]=[Ef]+[ES]+[EI]+[ESI]

经推导得到非竞争性抑制的酶促反应动力学方程式：

由此方程式和取双倒数作图（图3.25），从图3.25（a）中可以看出，加入非竞争性抑制剂后，vmax变小，Km不变，即=Km，随抑制剂浓度增加而减小；从（b）图得出，X轴截距不变，Y轴截距增大，即Km不变，vmax变小。增加底物浓度，不会解除非竞争性抑制作用。

3）反竞争性抑制

反竞争性抑制的动力学反应式如下：

反竞争性抑制反应酶的总浓度为：

[E0]=[Ef]+[ES]+[ESI]

反竞争性抑制的酶促反应动力学方程式可推导为：

从图3.26可以看出，加入反竞争性抑制剂后，vmax和Km都变小，即，<vmax。双倒数作图是一组平行线，表现为斜率不变，向上平移。

表3.6中归纳了不同类型抑制作用的酶促动力学特征参数。