3.7　酶工程

近年来的研究和发现使酶的内涵不断扩大，不仅发现了非蛋白质类的酶——核酶，还增加了新的酶学品种，如抗体酶、人工酶、模拟酶等。

天然酶是经过自然界长期进化，具有高效特异性和高效催化性的催化剂。由于天然酶的含量有限，分离提取成本较高，而且体外活性不稳定，因此人们希望可以自行生产一些活性高、选择性强、稳定性好、制备简单的酶产品。酶工程就是在这种背景下发展起来的，主要任务是解决大量酶的生产和使用、酶修饰改性以及新酶设计等问题，涉及酶学、以基因重组技术为主的现代分子生物学以及生物反应工程等学科领域。

近几年，在人工模拟酶、基因工程酶和酶应用等方面取得了长足进展，如模拟光合作用中部分酶的结构和功能，特别是电子转移和能量传递过程中的酶，以制备新型的人工酶光催化放氢体系，为利用可见光光解水制取氢气提供了新的途径。基因工程技术在酶的高效表达和大量生产方面成效显著，如尿激酶原、组织纤溶酶原激活剂、凝乳酶、α-淀粉酶、青霉素G酰化酶等在医药或工业生产中都有广泛使用。另外，酶基因的定点突变技术可以改变酶的性质（如酶活性、底物专一性、稳定性、对辅酶的依赖性等）。例如：将枯草杆菌蛋白酶的Asp99和Glu156替换为Lys后，使酶在pH7的活力提高了1倍，pH6时活力提高了10倍。随着对酶结构与功能关系的认识不断深入，人们运用现代分子生物技术，设计新酶基因，合成具有独特性质的非天然新酶。

3.7.1　人工酶和模拟酶

运用分子印迹技术可以制备具有蛋白酶、氧化还原酶催化功能的人工酶（synzyme），如1977年人工合成了具有溶菌酶活力的多肽（Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe），其活力达到天然酶的50％；1990年人工构建了由73个氨基酸残基组成的多肽，具有胰凝乳蛋白酶的活性。制备过程中使用了胰凝乳蛋白酶的底物酪氨酸乙酯作为模板，用计算机模拟了胰凝乳蛋白酶的活性位点。

模拟酶（mimetic enzyme）是利用有机化学的方法合成比酶简单的非蛋白质分子，它们可以模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性。酶的模拟过程分3个层次：①合成类似酶的简单络合物；②模拟酶的活性中心；③模拟酶活性部位的微环境。目前构建模拟酶的模型化合物有环糊精、冠醚、穴醚、笼醚、卟啉、大环番结构等物质，利用环糊精已成功地模拟了胰凝乳蛋白酶、核糖核酸酶、转氨酶、碳酸酐酶等。

人工酶和模拟酶在分子识别、手性药物拆分、环境污染物检测及生物传感器等方面得到越来越多的应用。这里介绍几个人工酶或模拟酶。

1）抗体酶

抗体酶（abzymes）是具有催化活性的抗体，具备抗体的高度选择性和酶的高效催化能力。普通抗体没有催化活性，但与抗原结合有高度的选择性，这与酶非常相似。人们通过事先设计反应的过渡态类似物作为抗原/半抗原，按照单克隆抗体的制备程序获得抗体，使其可变区赋予了酶的属性，成为具有催化活性的抗体。至今获得的抗体酶可以催化6种类型的酶促反应，其催化专一性相当或超过一般的酶，催化速度有的可以达到普通酶催化的水平。

制备抗体酶包括以下三个步骤：①构建过渡态类似物，作为半抗原；②化学偶联半抗原与载体蛋白制成抗原；③用单克隆抗体技术生产抗体酶。

单克隆抗体技术是Kohler和Milstein于1975年提出的，核心是将产生目标抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，利用杂交瘤快速繁殖的特点大量生产单克隆抗体。目前已在哺乳动物细胞中制备了五十多种抗体酶，能催化酯、羧酸和酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂解以及聚合、酯交换等十多种反应。如Pollack等人用对硝基苯酚磷酸胆碱酯作为相应羧酸二酯水解反应的过渡态类似物，作为半抗原诱导产生单克隆抗体，筛选得到一株MOPC167单克隆抗体，它可催化水解反应，并使反应速率加快12000倍。该抗体催化反应的动力学行为满足米氏方程，并具有底物特异性及pH依赖性等酶反应特征。

抗体酶的研究不仅为酶作用机理及过渡态理论提供了依据，而且还可用于医疗和生产，如水解病毒蛋白、清除血管凝血块、治疗吸毒和癌症、拆分手性药物等。

2）杂化酶

杂化酶（hybrid enzymes）是以天然蛋白为母体，经化学修饰引进适当的活性部分，形成新的具有催化或识别功能的“人工酶”。如在抗体中引入催化活性中心后，杂化酶具备了识别和催化双重功能；在核酸水解酶的活性中心附近引入识别片段（如一段寡核苷酸），杂化核酸酶就可以有选择性地对核酸进行定位切割。

运用分子生物学技术也可以得到新的杂化酶，如将两种杆菌的葡聚糖酶基因进行杂合，构建新的杂化酶基因，在宿主细胞中表达得到新的杂化酶。该酶在酸性条件下具有很好的热稳定性，如在pH4.1、65℃下保持1h，酶活性仍能保留80％～90％，而非杂化酶的活性基本丧失；在pH6、70℃下1h后，新杂化酶仍有90％活性。

3）博来霉素

博来霉素（bleomycin，BLM）是可以切割DNA、具有抗肿瘤活性的糖肽类抗生素。该分子既有结合位点也有催化位点，与DNA的结合具有G特异性。在Fe2+的参与下，催化氧化DNA上戊糖，使C4与C3之间的键断开，从而使DNA链断裂。BLM在反应前后未发生任何变化，很像一个DNA内切酶。

3.7.2　酶工程应用

以下主要介绍非水相催化反应、酶的固定化技术、药物分子设计。

1）酶的非水相催化反应

酶通常在水相中具有催化功能，只要条件合适，在有机相或非水相中也能保持其活性。酶在非水相中催化的基本条件是：必须维持酶分子周围形成水化层的结合水，否则酶的构象将遭受破坏，导致酶失活。常见有机溶剂体系有：①均相体系，如甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二氧六环；②两相体系，如烃类、酯类等；③悬浮体系，如非极性有机溶剂和固体酶。

有机相酶促反应有以下几种类型。

（1）酯化反应

脂肪酶催化醇（通常是立体异构物）与羧酸反应合成酯。如黑曲霉脂肪酶在四氢呋喃和乙腈中催化反丁烯二酸与1，4-丁二醇反应，合成全反式构象的聚酯；脂肪酶催化吸附在亲水性硅胶上的单糖类底物与乙酸酐的酯化反应制备糖酯。

脂肪酶催化油脂与甲醇反应形成脂肪酸甲酯（生物柴油）和甘油，也称为转酯化反应（图3.27）。

（2）形成酰胺键反应

酶催化酯的氨解反应形成酰胺，如下：

（3）形成过氧酸反应

有机溶剂中脂肪酶催化羧酸和过氧化氢形成过氧酸，过氧酸可以氧化体系中存在的烯烃为环氧化物。

类似的过氧化反应：辣根过氧化物酶以过氧化氢为电子受体，专一性地催化酚和芳香胺的过氧化反应，使酚形成酚氧自由基，进一步发生聚合反应。

（4）氧化还原反应

如酚氧化反应、醇的氧化和羧酸的氧化反应，羰基还原为醇的反应等。

（5）形成糖苷键反应

如有机相焦磷酸化酶催化形成糖苷键：

再如有机相糖苷酶催化醇解反应：

2）酶的固定化技术

酶的固定化有利于保持酶的高效性和稳定性，避免环境因素的影响，并有利于产物分离。酶的固定化通常采用如下几种方法（图3.28）。

（1）吸附法

通过离子键、物理吸附将酶固定在固体载体（如纤维素、琼脂糖、硅胶、活性炭、高聚物、石英多孔玻璃、离子交换树脂等）上，工艺简便、条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化，酶失活后可重新活化，载体可以再生。缺点是酶与载体之间作用力弱，酶易脱落。

（2）包埋法

用天然或人工合成的高聚物将酶包裹起来的方法，分为凝胶包埋法和微囊化法。凝胶包埋法是将酶分散包埋在高聚物中，可切成凝胶小块或形成珠状微球；微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在聚合物形成的胶囊或膜内，膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中，又可阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。包埋法制备条件温和，很少改变酶的结构，适合于大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞的固定化。该法制备的固定化酶适合催化小分子底物的反应，高聚物或膜的存在限制了底物和产物的扩散。微囊化法包埋的酶量很大，在医学上具有很好的应用前景，受到人们越来越多的关注。

（3）交联法

通过双功能团试剂使酶分子之间发生交联，凝结成网状结构。除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。常用的交联试剂有戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺、2，2-二磺酸、1，5-二氟-2，4-二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等。这种方法容易使酶变性失活，因此通常先将酶从溶液中沉淀后再进行交联，称为交联酶聚集体（cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）。

（4）化学共价法

酶蛋白分子上的氨基酸残基和固相支持物表面上的反应基团之间通过共价键连接，从而固定酶的方法。由于酶与载体间连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。常用载体包括天然高分子（如纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚糖凝胶、胶原及衍生物等）、人工合成高聚物（如尼龙、多聚氨基酸、聚苯乙烯和甲基丙烯酸聚合物、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等）和无机支持物（如多孔玻璃、金属氧化物等）。通常情况下，固相载体需要活化，并且固定化操作需要严格控制条件才能使固定化酶保持较高的活力。蛋白质通过什么基团参加共价连接、载体的物理和化学性质等对固定化酶都有影响。化学共价法常与交联法联用。

固定化酶在酶催化反应、生物传感器、酶制剂中已经得到广泛应用，如利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆；用固定化脂肪酶生产脂肪酸、鲸蜡油、生物柴油等；用固定化青霉素酰化酶将青霉素G或V转化为6-烷基青霉烷酸（6-APA），用于合成各种青霉素衍生物；用固定化氨基酰化酶生产L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸；用酶电极生物传感器快速灵敏地检测脲、氨基酸、葡萄糖、乙醇和乳酸等，广泛应用于临床诊断、工业在线控制和科研活动中。

3）药物分子设计

药物分子设计是人工构建与机体某些成分或者重要功能物质（如蛋白质、核酸、酶、受体、离子通道）发生作用的化学物质，在分子水平上预见它们之间的相互作用，达到设计、筛选药物的目的。药物分子之所以能发挥作用，是因为它与体内的生物靶点可以互补并产生相互作用，从而影响靶位分子的活性而产生药效。药物分子的几何形状以及药效基团的配置与靶点分子（受体）的结合位点在空间形状和基团分布上是互补的，这种互补决定了药物与受体的相互识别和相互结合的程度。蛋白质和酶是体内重要的成分和靶点，常常被用作药物分子设计的受体。

药物分子设计涉及生物学、药理学、计算化学、分子图形学、生物信息学等多门学科，现代药物分子设计是基于受体的三维空间结构进行的，主要包括以下研究内容：①研究疾病发生的原因或机理，有针对性地确定生物靶点；②利用计算化学、分子图形学研究受体（靶点）和配体（药物分子）的结合模式及特征，指导药物合成和体外试验；③运用分子模拟手段，对已知三维空间结构的靶点和药物之间的关系进行研究，给出相似性、不相似性和多样性，对于不能进行三维定量的靶点和药物，可利用二维或三维定量构效关系方程或图形对受体结合部位直接模拟和映射；④利用QSAR或QSPR（定量构效关系）、神经网络研究预测生物利用度；⑤利用生物信息学设计新药物。

例如：抗艾滋病药物的分子设计。艾滋病HIV编码的天冬酰胺蛋白酶，是HIV及基因组复制的关键酶之一，可以作为治疗艾滋病的药物靶点。研究表明它有两条肽链，每条肽链有99个氨基酸残基，有特异的富含甘氨酸的发卡结构和2个天冬氨酸-苏氨酸-甘氨酸（Asp-Thr-Gly）构成的活性中心。通过研究抑制剂以氢键方式与酶活性位点上氨基酸残基相互作用，设计抑制该酶活性的药物。目前已经开发的药物有沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦登、阿扎那韦等，其中新药阿扎那韦抗病毒效果明显，对脂肪代谢的影响较小。图3.29所示是一种HIV1蛋白酶抑制剂（Indinavir）与酶的作用原理。