第三节 禽流感病毒研究进展
一、H5N1研究进展
1．致病力
禽流感病毒毒力高低与HA裂解位点氨基酸的性质及组成序列有关。上一节已经提到近几年研究发现细胞内的蛋白酶可以将H5N1的血凝素HA0切割成HA1与HA2蛋白，该特性被认为是与禽流感病毒高致病力特性相关的重要特征。反向遗传学试验证实，H5N1病毒PB2蛋白的E627K替换与病毒在哺乳动物上的适应，小鼠模型中毒力的增加，低温环境下病毒复制能力的提高以及小鼠上呼吸道感染相关。部分人源样本中分离得到的H5N1毒株中存在D701N突变，被证实可以在小鼠模型中增强病毒的毒力。
根据目前研究，高致病性H5N1禽流感可以感染人上、下呼吸道细胞与肺泡上皮细胞，从而引起机体一系列反应，如细胞因子与化学因子的失调、免疫细胞的病毒血症和感染导致其他器官的感染、感染巨噬细胞导致迟发型细胞凋亡、上调肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体、病毒复制引起的溶细胞损伤与细胞凋亡等。这些反应最终可以导致严重的肺部损伤。HA抗原可以刺激机体产生细胞免疫应答，从而产生细胞毒性T淋巴细胞，其中悬浮的穿孔素可引起细胞与化学因子失调，从而引起肺部损伤。非结构蛋白NS1中的92位谷氨酸可以抑制TNF-α与干扰素作用，而靠近NS1蛋白C末端的ESEV/EPEV区域可以阻断重要的细胞信号通路，即PDZ区域蛋白介导的通路，从而导致宿主严重的肺部损伤。
2．传播力
HA与宿主细胞表面特异性病毒受体的结合是导致病毒感染的先决条件。对于H5N1来说，病毒可以结合禽类的唾液酸α-2,3Gal受体，也可以结合人类唾液酸α-2,3Gal及唾液酸 α-2,6Gal受体。动物试验表明，高致病性禽流感H5N1不能在雪貂或猪之间进行有效传播，雪貂间不能传播H5N1与H3N2的重组病毒。流行病学资料表明，人感染H5N1高致病性禽流感的主要原因是直接接触携带该病毒的禽类，特别是处理病死禽类。目前无流行病学与病原学直接证据证明H5N1禽流感能在人间进行有效传播。
3．进化研究
1997年4月，香港3个养鸡场共4500只鸡感染H5N1禽流感死亡。2003年12月，在韩国禽类中暴发H5N1禽流感疫情，随后波及中国、日本、越南、柬埔寨、泰国、老挝和印尼等7个国家，死亡或涉及的禽类总数近1亿。2005年春，我国青海湖发生大规模候鸟感染H5N1禽流感，导致6000多只迁徙水鸟死亡。这是全球范围首次出现的候鸟H5N1禽流感暴发疫情，波及了亚洲、非洲及欧洲的56个国家和地区，通过对2005年至2006年流行的禽流感基因分析提示禽流感基因的变化与候鸟迁徙路线一致，暗示病毒沿候鸟的迁徙方向传播。通过构建系统进化树，已经证实人感染高致病性H5N1病毒来源于禽类，而且该病毒一直不断地在野生禽类与家禽循环传播。尤其是在活禽市场，该病毒可以持续传播，不断地进行重组与释放。全国多地在不同宿主体内，如猪、禽类等，分离到H5N1、H5N5、H5N2、H5N8等毒株，并证实H5亚型禽流感病毒的八个节段均可以与其他亚型流感病毒发生重组，从而形成新的流感病毒亚型。而野生候鸟可以将其携带进入新的区域。在埃及、非洲撒哈拉沙漠等地也出现病毒感染病例。
Abdel-Ghafa等于2008年利用来自不同地区的H5N1禽流感病毒HA基因序列，构建了一棵系统发育树。1997年香港公布的首例人感染H5N1病例，处于进化树的基部，为最早分离得到的毒株序列。随后在世界各地报道为已经引起人类疾病的毒株序列分布于系统进化树的各个单系分支，如2004～2005年在越南，泰国和柬埔寨暴发的毒株、印尼当地流行毒株、青海湖野鸟体内分离得到的毒株。青海湖野鸟中得到的H5N1病毒随着候鸟迁移扩散至中亚及南亚、中东地区、欧洲和非洲感染禽类，西亚、中东及非洲感染人类；部分毒株已经在中国南部流行，而且不断蚕食邻近国家。该结果提示目前H5N1病毒在不同地区已经形成了比较稳定的谱系，并具有各自不同的特征。
二、H7N9研究进展
1．致病力
禽流感病毒毒力高低与HA裂解位点氨基酸的性质及组成序列有关。由于H7N9禽流感病毒HA基因中HA的裂解位点333～340的氨基酸序列PEIPKGR* G中只存在一个精氨酸，因此在基因型上该病毒属于低致病性病毒。而在动物模型试验中，在雪貂气管内接种一定剂量（＞ 10 -5 TCID50）的新型H7N9 A/Anhui/1/2013，感染4天后进行临床和病毒学指标的监测观察，结果发现病毒在上、下呼吸道复制时雪貂出现致命性肺炎症状，表明新型H7N9病毒可能导致较为严重的临床症状。Mok等采用H9N2、H5N1、感染禽类的H7N9及感染人类的H7N9不同禽流感亚型毒株接种小鼠，观察这些病毒对小鼠的致病力，结果提示引起肺部和血清中促炎因子的能力从高到低排名为：H5N1＞人H7N9＞禽H7N9＞H9N2。
2．传播力
HA与宿主细胞表面特异性病毒受体的结合是导致病毒感染的先决条件。H7N9病毒的HA氨基酸序列替换位点提示该病毒可以与人呼吸道受体唾液酸α-2,6Gal结合，提示在基因型上该病毒可以有效感染人类。而雪貂模型试验表明，新型H7N9禽流感病毒能在人体上下呼吸道上皮细胞中复制并产生较高的滴度。若干例聚集性病例的出现引发了人们对新型H7N9禽流感病毒是否可以进行有效人际传播的思考。动物实验表明与H5N1不同，新型H7N9禽流感病毒可以通过雪貂之间直接接触进行有效传播。因此，有共同禽类暴露史的聚集性病例不能排除存在有限的、非持续性的人传人可能。
3．进化研究
基于序列比对联配以及构建系统进化树，研究人员对新型H7N9病毒进行溯源分析。目前多数研究人员认为该病毒为禽类来源，至少由4个来源重组进化形成；同时该病毒与当地禽类H9N2病毒不断进行重配，因此不同地区新型H7N9病毒已经呈现差异。目前大多数分离株的H7与N9片段分别来自不同亚型的欧亚大陆迁徙候鸟流感病毒H7N3中的H7，以及N9（如H2N9与H11N9等）。6个内部基因（PB2, PB1, PA, NP, MP和NS）来自至少两种不同的H9N2病毒，且均可以从禽中分离得到。H7世系与当地不同宿主的H9N2病毒经过至少两次重组事件产生了新型H7N9，病毒同时也重组产生了副产物——对哺乳动物有着较高致病力的H7N7病毒（图2-2），因此目前不能排除该H7N7病毒可能在今后引起流行的可能。计算得到的最近共同祖先结果提示，在2012年早期病毒在中国东部地区的野生鸟类中发生了第一次重组事件，随后在家禽中发生了第二次重组事件。已有的证据均表明活禽市场是目前人类感染该病毒的主要来源。（见文前彩图2-2新型人感染H7N9禽流感病毒重组示意图（摘自Lam et al. ,2013））
三、其他禽流感病毒研究进展
根据流感病毒HA与NA的抗原特异性，目前共分离到16个HA亚型与9个NA亚型。由于所有人流感病毒亚型都可以在禽类动物中分离得到，因此，禽流感病毒亚型较多。目前常见的禽流感亚型，除了上文提到的H5N1与H7N9外，最普通的亚型为H9N2。由于该病毒基因型在HA基因的裂解位点为PSRSSR* GLF，属于低致病性禽流感病毒。表型上，该病毒通常只引起家禽轻微的呼吸道症状以及产蛋鸡产蛋量下降，一般不会导致感染家禽大批量死亡。因此其关注度不如H5与H7亚型病毒。但是，作为禽流感病毒“基因库”，该病毒经常与其他亚型发生节段重组或部分重组，产生新的亚型：如新型H7N9病毒即为野禽H7N3与至少两种不同来源的H9N2重组形成。Xu等对2000～2005年中国南部鹌鹑体内分离得到的H9N2病毒进行进化与分子流行病学研究，发现鹌鹑可能是H9N2病毒主要的宿主；从2000年开始，G1类型与Ck/Bei类型的H9N2谱系在南部地区流行，很多毒株至少经历了两种及以上的重组事件。新型的G1类型的毒株自2003年开始流行，而多重重组的Ck/Bei类型与G1类型的基因片段在鹌鹑体内重组之后又感染了其他禽类。这揭示了不同禽类体内不同谱系，甚至不同亚型病毒间频繁地进行基因节段重组现象，如H9N2与H5N1。因此，对禽流感病毒的监测是理解该病毒遗传和潜在流行的关键所在。
2013年5月20日，我国台湾地区发现全球首例人感染H6N1禽流感病例。该病毒曾经在野生禽与家禽中多次分离到，是禽类物种中常见的病毒之一。台湾疾控中心的研究人员通过分析，对该病毒临床表现、流行病学与病毒病原学进行研究，得到了以下结论：
①该病毒从一名20岁的女性流感样病例的咽拭子样本中分离得到，经过对其HA基因与NA基因的分型，确定该病毒为H6N1亚型禽流感病毒。传染源尚未明确。
②序列分析表明，该人感染H6N1病毒与台湾地区家禽中的H6N1病毒高度同源。人感染H6N1病毒的HA基因中存在G228S替换，该特征作为H6N1独有的特征已经在台湾地区家禽中传播，而且该特征可能提高人类2,6唾液酸受体与病毒的亲和能力。
③这类病毒正在不断地积累变异与进化特征，增加人传人的潜在风险几率。因此需要进一步加强对不可预知和复杂禽流感大流行的防备。
2013年12月17日，江西省检测出一份阳性甲型流感病毒，经过中国疾控中心确认，为H10 N8禽流感病毒。病例为一位73岁女性，有活禽市场暴露史，临床表现为重症肺炎，伴有高血压、心脏病等基础性疾病，免疫水平低下，因呼吸衰竭后休克死亡。序列分析表明该病毒8节段均来自于禽类，6个内部片段来自于H9 N2病毒。HA基因226至228位置氨基酸序列为QSG。而在PB2蛋白627位置的E与K的混杂状态表明该病毒与哺乳动物细胞的亲和力较一般禽类流感病毒高。病毒对神经氨酸抑制剂敏感。该人感染H10 N8病毒与之前报道的感染禽类的H10 N8病毒有着较远的系统发育关系，可以引起人类感染，甚至是死亡。
2014年5月9日四川省南充市从监测病例中检测出H5N6病毒，经过中国疾控中心复核确定为H5N6病毒，这是全球范围内第一次人源的H5N6病毒。之前的研究认为H5N6病毒对禽类为低致病性病毒，且其灭活佐剂疫苗可以保护猫免受H5N1高致病性禽流感致死剂量感染。目前检测到的H5N6病毒从基因序列水平分析对禽高致病性，说明该病毒自身已经历了一定程度的演化。目前，WHO表示该病毒为禽源病毒，由于所有的密切接触者未出现流感样症状，由此判断现阶段该病毒传播的风险较低，但需要继续进行监测。