第三章 临床学

第一节 发病机理与病理变化

一、概述

禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。根据其外膜HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9），两种蛋白以HxNx方式组合形成135种亚型。根据在家禽种群中毒性的不同，禽流感病毒可以分为低致病性病毒和高致病性病毒。禽流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。人类通过直接或者间接接触禽获得感染，引起人感染的禽流感病毒有：H3N2、H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8等。H5和H7亚型在高致病性和低致病性禽流感病毒中均有发现，H9亚型目前只在低致病性禽流感病毒中有发现。但是禽流感病毒的致病性可以相互转换，研究表明，原为低致病性禽流感病毒株，可经6～9个月禽间流行迅速变异成为高致病性毒株。由于不同的禽流感亚型致病性不同，引起的临床谱也不完全相同，从隐性感染、轻症感染、重症感染甚至死亡。

历史流行经验表明：不同的禽流感亚型病死率有明显差异。世界卫生组织（WHO）最近统计数字显示：截止到2014年1月24日，全球16个国家共报告了650例实验室确诊的人感染H5N1禽流感病例，死亡386例，病死率达59.38%。截至2014年7月2日，2013～2014年在我国部分地区发生的新型H7N9禽流感病毒共导致了436例病人感染，168例病人死亡，病死率达38.53%。2003年荷兰暴发的人感染H7N7禽流感疫情引起89人感染，仅1例死亡。同样，H9N2等引起的人感染禽流感疫情的病死率较低。不同的禽流感亚型引起的不同的临床结局与其致病机制密切有关，这涉及病毒与宿主的相互作用的过程。

目前对禽流感病毒致病机理的研究主要依靠组织病理与尸体解剖、各种动物感染模型和体外细胞感染模型。人们对禽流感病毒致病机理的研究还处在初级阶段，主要有如下几个方面：①禽流感病毒侵入宿主过程；②禽流感病毒对宿主的病理损伤；③禽流感病毒的分子致病机理；④宿主对禽流感病毒的免疫反应与免疫病理；⑤细胞因子风暴学说理论；⑥禽流感病毒诱导宿主细胞产生凋亡学说理论。

二、禽流感病毒侵入宿主过程

禽流感病毒进入宿主细胞主要分为三个阶段：①粘附和进入细胞：禽流感病毒主要通过呼吸道飞沫进行传播，借助病毒表面的HA，与呼吸道黏膜上皮细胞表面的相应受体结合，吸附在宿主的呼吸道上皮细胞上。②转录与复制：病毒表面的NA作用于核蛋白的受体，使病毒和上皮细胞的核蛋白结合，在核内组成RNA型可溶性抗原，并渗出至胞质周围，复制子代病毒，将进行一系列复杂而有序的逐级放大的剪切和转录过程。③病毒释放：通过NA的作用，以出芽方式排出上皮细胞。一个复制过程的周期为4～6小时，排出的病毒扩散至附近细胞，产生炎症反应，临床上表现为发热，肌肉痛和白细胞减少等全身病毒血症样反应。

三、病毒对宿主的病理损伤

禽流感病毒通过HA与宿主受体结合感染宿主。禽流感病毒特异性受体是细胞膜上的糖蛋白α-2,3-糖苷唾液酸，人流感病毒特异性的受体是α-2,6-糖苷唾液酸。两种受体在不同器官的分布是不同的，禽流感病毒引起的病理损伤很大程度上取决于受体分布的范围、种类和密度等。

在上呼吸道，禽流感病毒受体只在上皮基底部的无纤毛细胞中分布，而占黏膜上皮大多数的纤毛上皮细胞中并无禽流感病毒受体。因此，禽流感病毒不易通过飞沫的形式在人间传播。这可能也就是禽流感没有在人间引起广泛传播的原因。在下呼吸道，α-2,3-糖苷唾液酸主要分布在肺泡Ⅱ型上皮、肺泡的巨噬细胞和部分支气管黏膜上皮细胞上。禽流感病毒引起的呼吸道病理变化如下：病毒侵入呼吸道黏膜的上皮细胞，引起上皮细胞增生、坏死、黏膜局部充血、水肿和浅表溃疡等卡他性病变。4～5天后，基底细胞层病变可扩展到支气管、细支气管、肺泡和支气管周围组织，引起黏膜水肿、充血、淋巴细胞浸润，并伴有微血管栓塞、坏死、小动脉瘤形成和出血等，引发全身毒血症样反应。少数重症进行性肺炎除了细支气管炎症变化外，还可有肺泡壁充血水肿、纤维蛋白渗出，单核细胞浸润、透明膜形成、肺出血等，引起诸多并发症。

禽流感病毒受体还分布在人类其他组织和器官内，如血管内皮细胞，所以病毒侵袭血管内皮后，人禽流感患者也出现了类似病禽的弥漫性小血管血栓和出血。

脾脏组织中的淋巴细胞主要是T淋巴细胞，表达禽流感病毒受体。人禽流感患者尸检结果显示外周血液中T淋巴细胞数量减少，淋巴组织显著萎缩，淋巴细胞大量减少。这是由于其表达禽流感病毒受体，易于被病毒识别攻击所致。

脑组织中神经元也表达禽流感病毒受体，1997年香港发生的第一例H5N1人禽流感患者为一名3岁男孩，死于Reye综合征以及肺炎并发症。用原位杂交法检测人禽流感患者尸检标本结果显示，神经元中有禽流感病毒存在。小鼠模型也发现H5N1病毒具有嗜神经性。种种迹象表明，禽流感病毒可在有受体的神经元中复制增殖，最终造成神经系统病变，表现出相应临床症状。

除了血管内皮细胞外，肾脏肾小球以及部分肾小管细胞也表达禽流感病毒受体，人禽流感患者尸检发现肾脏存在急性肾小管坏死现象，其详细机制仍有待进一步探讨。

肝脏组织中只有Kupffer细胞表达禽流感病毒受体。人禽流感患者尸检标本原位杂交结果显示胎儿Kupffe细胞有H5N1病毒存在。

除了间质中的血管内皮外，肠上皮并不表达禽流感病毒受体。但仍在人禽流感患者尸检标本的肠上皮细胞中发现了H5N1病毒，而且经细胞培养证实，肠上皮黏膜细胞中的病毒载量较大，说明在周围细胞都被感染的情况下，没有受体的细胞也能够被H5N1感染。

低致病性禽流感除上述病理外还会引起眼部感染，病理表现主要是结膜的充血水肿和炎症细胞的浸润。

高致病性禽流感病毒毒力较强，引发的传染性变态反应（IV型变态反应）是导致进行性肺炎、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）等严重并发症的根本原因。

四、病毒的分子致病机理

禽流感病毒与宿主细胞受体结合强度是决定禽流感病毒宿主特异性的最重要因素。常见的禽流感病毒HA蛋白结合的细胞受体有两种，一种为α-2,3-糖苷唾液酸，另一种为α-2,6-糖苷唾液酸。多数禽流感病毒优先结合于α-2,3-糖苷唾液酸受体，而人流感病毒则优先结合于α-2,6-糖苷唾液酸受体。研究发现，这种差异与HA蛋白上受体结合位点的第226位氨基酸密切相关，若第226位氨基酸残基是谷氨酸（Gln），为α-2,3-糖苷唾液酸受体结合特异性，若第226位氨基酸残基为亮氨酸（Leu），则为α-2,6-糖苷唾液酸受体结合特异性，倘若第226位氨基酸为甲硫氨酸（Met），则同时对α-2,3-糖苷唾液酸流感和α-2,6-糖苷唾液酸均具有相同的结合能力。1997年香港禽流感A/ Hongkong/156/97（H5N 1）HA第226位氨基酸为Met，这可能是导致香港禽流感病毒感染人的另一个重要原因。

Mat rosovich等研究发现，NA茎区氨基酸缺失减弱禽流感病毒从细胞释放能力，而HA额外的糖基化位点则降低禽流感病毒对细胞受体的亲和力；通过对GenBank中不同禽类毒株HA和NA序列比较，还发现NA茎区氨基酸缺失与HA的糖基化位点是H5、H7亚型禽流感一个重要特征。Banks等在对1999年意大利H7N1亚型高致病性禽流感病毒研究中也发现，其HA1第149位（处于受体结合位点附近）出现糖基化位点，NA蛋白茎区第54～75位间缺失22个氨基酸残基，进而推测这可能是野水鸭H7N1亚型病毒毒株适应于鸡的原因所在。

目前研究表明人禽流感H5N1亚型病毒的高致病性与其非结构蛋白有关。普通流感病毒感染时，非结构蛋白（NS1）产生于机体受感染的细胞，与病毒复制产生的双股RNA（dsRN A）相互作用，产生细胞内信号作用于RNA病毒蛋白激酶（PKR）以及核因子KB（NF KB）启动干扰素的转录和合成，从而发挥抗病毒的非特异性免疫作用。在高致病性人禽流感H5N1亚型病毒感染者体内存在高浓度的干扰素和肿瘤坏死因子，但是这些细胞因子却不能抑制或杀死高致病性的人禽流感病毒。研究表明这种病毒不仅对干扰素和肿瘤坏死因子具有极强的抵抗力，而且可以大量的增殖，进一步诱导炎性细胞因子的产生，引起全身性炎症反应综合征，从而在感染人的过程中表现出极高致病力。这种现象是由H5N1亚型病毒的非结构基因发生变异造成的，与其第92位存在Gln有关。

Scholtissek等研究认为，禽流感病毒核蛋白（NP）的磷酸化能增强病毒的增殖能力，而这种磷酸化是由宿主细胞来完成的，不同宿主的磷酸化能力不同，从而影响病毒感染范围。

Subbarao等研究发现，由于PB2第627位Gln被替换成赖氨酸（Lys），使不能在哺乳动物细胞（如MDCK）复制的禽流感毒株获得了增殖的能力，并形成蚀斑，同时发现，所有禽流感病毒此位点的氨基酸均为Gln，而所有人流感病毒此位点的氨基酸均为Lys，因此，推测流感病毒PB2第627位氨基酸残基在决定流感病毒的宿主范围起着重要作用。

禽流感病毒的毒力与囊膜上的HA及蛋白水解酶切割敏感性密切相关。HA的切割是由宿主细胞内蛋白水解酶来完成的，然而，不同宿主细胞内所含蛋白水解酶类不同，因此，对HA切割的能力存在差异，这就造成了不同流感毒株对组织的亲嗜性或趋向性不同。高致病性禽流感病毒的HA切割位点附近有多个碱性氨基酸，可被禽体内广泛存在的蛋白水解酶，如fur in、PC6所识别和切割，从而决定了高致病性禽流感病毒在禽体内的广泛嗜细胞性，其结果就是，病毒在宿主各组织细胞间迅速扩散，引起全身的严重感染；而非致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒的HA在切割位点上缺乏多个碱性氨基酸结构，有些毒株在切割位点上仅有一个精氨酸（Arg），因此，这些毒株只能被某些细胞（主要局限于呼吸道黏膜、消化道黏膜）的蛋白水解酶识别和切割，其结果就是，病毒只能局限在消化道或呼吸道黏膜上皮细胞中增殖，引起局部（呼吸道或消化道）感染。1992年Vey M等研究了H7亚型各病毒分离株和定点诱变的突变株HA切割位点的氨基酸序列，结果发现蛋白内切酶能识别的最短氨基酸序列为-R-X-K/R-R（X代表任意一种碱性氨基酸）。

HA切割位点附近寡糖侧链也能影响蛋白水解酶对HA的切割性，从而影响禽流感病毒毒力。1993年Walker等对A/Turkey/Ireland/1378/85（H5N8）毒株及其突变株也进行了研究，结果发现，当HA切割位点附近存在寡糖侧链时，H5亚型强毒株HA切割位点最小氨基酸组成为Q-R/K-X-R/K-R/G（X为任意一种碱性氨基酸），而当没有寡糖侧链时，则只需两个碱性氨基酸残基插入HA即能被切割。提示HA切割位点插入宿主细胞的多肽序列，能提高蛋白水解酶对HA的切割性，从而增强禽流感病毒的毒力。因此，这些蛋白水解酶的存在，会增强禽流感病毒的致病力。

总之，目前的研究均表明：禽流感病毒HA蛋白的受体位点、HA的酶切位点及附近的糖基化位点数目、NA茎部长短、NP和NS蛋白变异、PB2蛋白627位点和宿主的RNA插入序列以及蛋白水解酶等因素会影响病毒的亲和力、毒力、复制能力从而影响其致病过程。

五、宿主对病毒的免疫反应与免疫病理

人体在感染禽流感病毒后或接种疫苗后可产生特异性的细胞免疫和体液免疫。抗HA和抗NA是流感的特异性抗体。抗HA为中和抗体，能抵抗感染的发生，而减轻病情和阻止病毒传播则与抗NA有关，抗NP具有型特异性，只能用于分离病毒的定型。血清抗体和鼻腔分泌物中的sIgA抗体与保护作用有关，局部分泌性抗体可能是防止感染的最重要因素。具有一定抗体滴度的人虽可感染禽流感但病情轻微。不同型别的流感病毒在抗原上没有联系，因此不能诱导交叉保护。当一种病毒的型别发生抗原漂移的时候，体内具有该株病毒高滴度抗体的个体感染新株后会呈现轻度感染。血清抗体可持续数月至数年，而分泌性抗体存留短暂，一般只有几个月。细胞免疫应答主要是特异性CD4+ T淋巴细胞能帮助B淋巴细胞产生抗体，CD8+ T细胞能溶解感染细胞，减少病灶内的病毒量，有助于疾病的恢复。值得注意的是CD8+ T细胞反应是有交叉性的（能溶解任何毒株感染的细胞），不具有株特异性，这可能是由于其直接作用于病毒核蛋白，而不是病毒体表面糖蛋白。

六、细胞因子风暴学说理论

目前，有人提出高致病性禽流感病毒介导的细胞因子失调和高细胞因子血症学说在人禽流感的发病机制中具有重要地位。

多个对高致病性禽流感死亡病例尸检研究证实：细胞因子参与了禽流感病毒的发病过程。对泰国18例H5N1病例以及8例普通流感病例进行比较研究结果发现，人禽流感患者外周血中IP-IO、MIC和MCP-1浓度远远高于普通流感患者，进一步说明了尸检肺组织中巨噬细胞的大量渗出可能与高细胞因子血症有关。1997年香港人禽流感死亡病例尸检结果发现：其主要病变是嗜血细胞综合征，外周血中T淋巴细胞数量下降，包括IL-2受体、IL-6和γ-干扰素在内的细胞因子水平升高。推测这些人禽流感病例死亡与感染病毒后病毒在呼吸道中的复制、继发高细胞因子血症及合并反应性嗜血细胞综合征等有关。Mongkol等分别在mRNA和蛋白水平检测两例H5N1死亡病例肺组织中TNF-α 表达情况，结果显示肺组织局部TNF-α mRNA和蛋白水平的表达均明显上调。大多数人禽流感患者外周血白细胞低下，特别是淋巴细胞明显减少。临床研究发现，T细胞总数以及CD3 +数与患者咽部病毒载量相关。尸检结果显示，人禽流感患者的骨髓、脾脏以及淋巴结等淋巴造血组织严重萎缩，淋巴细胞生成降低可能是低淋巴细胞血症的原因之一。另外，病毒的直接攻击或者是通过诱导大量细胞因子的分泌，促使淋巴细胞凋亡增加也可能直接或间接导致淋巴细胞减少。

多个禽流感动物感染模型实验也证实：与季节性流感H1N1相比，感染禽流感病毒的小鼠肺组织中TNF-α, IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10明显增加。小鼠感染致死性H5N1模型发现，当肺组织中炎性反应降低时，脑组织中的IFN-γ、IL-1β增高，尽管脑组织的病变不很明显，但脑组织局部细胞因子的高表达也可能是导致死亡的原因之一。猕猴H5N1感染模型也证实，重症病例组的肺部组织有高浓度的TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1、IL-6和IL-18等。

体外实验也有类似发现：2004年，有学者将致死性H5N1病毒株感染人肺泡上皮和支气管上皮后发现IP-10、IFN-β、RANTES和IL-6在感染细胞株中大量表达。

总之，临床数据、体内外实验均说明，人感染高致病性禽流感患者急性呼吸道症状、多器官功能衰竭、低白细胞血症、嗜血细胞现象以及肺组织中大量炎性细胞的渗出等临床和病理表现均可能与病毒感染导致的高细胞因子血症有关。

七、禽流感病毒诱导宿主细胞产生凋亡学说理论

细胞凋亡（apoptosis）是个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活动，它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用，是真核细胞的一种特殊的死亡形式。细胞凋亡与胚胎发育、病毒感染、自身免疫耐受、肿瘤发生等生理、病理过程密切相关，近年来一直是生物医学领域的研究热点。Cell、EMBO等著名科学杂志均多次刊登过论述禽流感病毒与凋亡相关性的研究，证实：禽流感病毒与细胞凋亡存在密切关系。禽流感病毒感染宿主细胞时可不同程度地诱导细胞凋亡，且在体内、外都能诱导多种细胞发生凋亡，细胞凋亡是禽流感病毒杀死宿主细胞的主要方式。高致病性的禽流感病毒感染和其他流感病毒感染一样，可以引起宿主细胞凋亡。但是高致病性禽流感病毒比季节性流感高出数百倍的病死率究竟是由何机制引发的，是否与其诱导的宿主细胞凋亡相关，其凋亡受到了何种通路的参与和调控，这些机制均还不清楚。

总体来说，禽流感病毒致细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过肿瘤坏死因子（TNF）家族受体介导的外源性通道（extrinsic pathway），如：Fas/FasL受体配体在某些细胞的表达体现这些细胞自身有凋亡趋势，或有促进邻近细胞凋亡的倾向。另一条是通过线粒体途径/细胞色素C介导的内源性通道（intrinsic pathway）激发引起。线粒体通路中，B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma leukemia, Bcl-2）家族对内源性细胞凋亡的调控意义重大，可分为抑制凋亡的Bcl-2亚族和促凋亡的Bax和BH3亚族。其中抑制凋亡的成员包括Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w等，而促凋亡成员包括Bax、Bak和Bcl-xs等。Bax被确认为P53直接的早期应答基因，其启动子上含有P53结合域，而P53能抑制Bcl-2的转录，活化Bax的转录，通过调节两者的比率来控制细胞增生，通过控制细胞由G期向S期移动使细胞凋亡，以此清除异常细胞。Bcl-2与Bax序列有21%同源性，可与Bax形成异源二聚体，二者之比影响着细胞对各种引起其凋亡刺激的敏感性，决定细胞在受到凋亡信号时是否发生凋亡。而诱导凋亡发生的禽流感病毒NS1蛋白，可能在破坏被感染细胞的过程中扮演着关键角色，是决定流感病毒对感染细胞破坏力的重要因素。

综上所述，高致病性的禽流感病毒可诱导感染细胞凋亡；禽流感病毒的NS1蛋白只在感染细胞中表达，并可诱导细胞凋亡；NS1是调节禽流感病毒致病力的重要基因，但是具体的机制不清楚。

由于禽流感病毒本身型别众多，宿主广泛，流行生态复杂，病毒本身易变异，其生物学特性如致病性、感染性、人亲和力、耐药性等方面与宿主之间在不断的适应与调整，因此，对于禽流感病毒特别是新发的和高致病性禽流感病毒的发病机制的研究非常重要，这对于减少发病、阻断传播、减少重症与死亡病例有重要的意义。