第三节 微生物菌种分离筛选研究实例

一、蛋白酶产生菌种的筛选及应用技术

蛋白酶是在一定的pH和温度条件下，通过内切和外切作用使蛋白质水解为小肽和氨基酸的生物酶（周兰姜，2011），在所有工业用酶中是应用最为广泛的一种，约占整个酶制剂产量的60%以上（王俊英，2012）；蛋白酶既可以从动植物组织中提取，也可以通过微生物发酵工艺进行生产，目前蛋白酶制剂主要利用曲霉、芽孢杆菌等微生物发酵制备（宋鹏，2012）。与动植物资源比较，微生物来源的蛋白酶生产周期短、生产成本低、易控制、不受土地和季节等限制，且微生物产生的蛋白酶多为胞外酶，日趋成为工业酶制剂的主要来源（马桂珍，2011），因此分离筛选能易纯化制备、分泌具有良好酶学特性并在适宜的培养条件下能提高产酶活性的菌株，是基础科研人员的目标和任务。

Fang等从海底泥浆中分离出一株能在多种有机溶剂下正常生长，且蛋白酶稳定性良好的菌株Bacillus sphaericus DS11，通过蛋白酶活力测定达465U/mL(Fang, et al.,2009)。Reddy等从土壤中分离出菌株Bacillus sp.RKY3，经PB试验设计和响应面方法优化后酶活达939U/mL (Reddy, et al.,2008)。Karan等从盐水湖中分离出的产胞外蛋白酶菌株Geomicrobium sp.EMB2，在有机溶剂、盐溶液、表面活性剂、洗涤剂和碱性溶剂中有显著稳定性，经响应面法优化后酶活达721U/mL(Karan, et al.,2011)。Wang等运用响应面方法优化Colwellia sp.NJ341的发酵培养基，使其蛋白酶活性达183.21 U/mL(Wang, et al., 2008)。Chi等从盐田沉积物中分离出一株蛋白酶高产菌Aureobasidium pullulans，通过优化最高酶活达7.2U/mL(Chi, et al.,2007)。任佩等采用检测水解透明圈和测定蛋白酶活力的方法，从章鱼肠道中分离筛选出一株高产蛋白酶的菌株QDV-3，其所产蛋白酶在SDSPAGE电泳上显示至少有5种，分子质量范围为32.4~124.2kD（任佩，2013）。邓加聪等从养殖场附近淤泥中采样，分离得到20株胶原蛋白水解活性的菌株（邓加聪，2013）。经活性平板初筛、摇床复筛及酶活测定，筛选得到1株胶原蛋白酶活性为28.70U/mL的菌株。卫春会等采用传统微生物分离方法从高温大曲中分离得到3株细菌（卫春会，2014），通过酪素培养基确定了蛋白酶活性最高的是细菌JX1，其产物蛋白酶的活性达到142.636U/g。

（一）蛋白酶产生菌的选育原理

蛋白质分解菌可利用明胶液化和牛乳胨化试验检验。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态（固体状态），而在25℃以上明胶就会液化，有些微生物能分泌明胶水解酶（胞外酶），可将大分子明胶水解成小分子明胶，从而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。

牛乳含有酪蛋白成分，具有酪蛋白水解酶的细菌水解酪蛋白为小分子物质，可直接出现胨化现象，据此可知该菌为蛋白质分解菌。

能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板生长后，其菌落可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的比值（D/d值），常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。但是，由于不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件也和液体环境中的生长情况差别很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是高产蛋白酶菌株。可再次利用干酪素平板培养基，依据D/d值确定产蛋白酶菌株。

通过初筛得到的菌株还必须用发酵培养基进行培养，通过对发酵液中蛋白酶活力的仔细调查、比较，才有可能真正得到需要的蛋白酶高产菌株，这个过程称为复筛。需要指出的是，因为不同菌株的适宜产酶条件差别很大，常需选择多种发酵培养基进行产酶菌株的复筛工作，否则可能漏掉一些已经得到的高产菌株。

蛋白酶活力的测定按中华人民共和国颁布的标准QB747-80（工业用蛋白酶测定方法）进行。其原理是Folin试剂与酚类化合物如酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)等在一定的温度和pH下发生反应形成蓝色化合物；用蛋白酶分解酪蛋白（底物）生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计比色测定可知酶活大小。

（二）蛋白酶产生菌的选育流程与方法

1．蛋白酶产生菌的选育流程

待检样品→预处理→梯度稀释→平板初筛→发酵培养复筛→粗酶提取→蛋白酶活力测定→高产蛋白酶菌株

2．蛋白酶产生菌的初筛方法

脱脂牛乳琼脂法以倾注平板法制成不同检样稀释度的平板后，于20℃恒温培养箱中培养3d，用1%盐酸或10%醋酸溶液淹没平板1min，倾去多余的酸溶液，计数因细菌分解蛋白质的作用而产生透明圈的菌落数。蛋白质分解菌的计数以每毫升或每克样品中蛋白质分解菌的菌落数报告。

软琼脂明胶覆盖法：向灭菌平板中倒入少许作为底层培养基（以刚好铺满底部为准），凝固后吸取适当检样稀释液0.1mL接种于底部培养基，用无菌玻璃涂布棒将平板上的菌液涂布均匀，然后倒入已熔化并冷却至50℃左右的软琼脂明胶覆盖培养基10~12mL立即混匀，凝固后将平板倒置于20℃恒温培养箱中培养3d。之后用10mL 5%醋酸淹没平板表面，15min后倾去酸液，计算具有透明圈的菌落数。

明胶穿刺法：取高层明胶培养基试管，用接种针穿刺接种待检纯培养物，置于20℃恒温培养箱中培养2~5d，观察明胶液化情况，以此判断是否为蛋白酶分解菌。

脱脂牛奶—干酪素琼脂平板培养法：又称脱脂牛奶琼脂平板法，即向灭菌平板中倒入15~20mL脱脂牛奶琼脂培养基，凝固后吸取适当检样稀释液0.1mL接种于培养基，用无菌玻璃涂布棒将平板上的菌液涂布均匀，将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养3d，观察透明圈产生情况。干酪素琼脂平板法，即挑取上述培养基中D/d值（透明圈与菌落直接比）较大的菌落，划线培养于干酪素琼脂培养基，将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养3d，观察透明圈产生情况。划线分离两次，筛选出D/d值较大的菌落，进行发酵培养复筛。

目前研究报道中较多采用脱脂牛奶—干酪素琼脂平板培养法筛选产蛋白酶菌株，该法操作简单，观察方便，筛选率高。

3．蛋白酶活力的测定

将初筛得到的蛋白酶产生菌株接种到适宜的发酵培养基中，在30℃下于150r/min摇床培养2d。将发酵液离心或过滤后按照QB747-80中方法测定蛋白酶活力，筛选出高产蛋白酶活力菌株。

蛋白酶活力的测定参照丁鲁华（1984年）的方法进行测定。蛋白酶活力单位定义：1.0mL酶液于35℃, pH7.2条件下，每分钟水解2%酪蛋白溶液产生lμg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位，以U/mL表示。

（三）蛋白酶产生菌的选育实例——豆制品发酵

豆制品是以大豆为主要原料经过加工制作或精炼提取而得到的产品，种类多达几千种，包括具有几千年生产历史的传统豆制品和采用新技术生产的新型豆制品。传统豆制品包括发酵性与非发酵性豆制品；目前发酵豆制品微生物主要包括下面几大类：一是细菌类，以枯草芽孢杆菌为典型代表，日本的纳豆(Natto)生产的主要菌种就是纳豆芽孢杆菌，它不仅可以分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶，更主要的是它可以生成纳豆激酶(Nattokinase)，芽孢杆菌也是生产淀粉酶的主要菌株，生产蛋白酶的为枯草杆菌1398，藤黄小球菌(Micrococcus luteus)是克东腐乳酿造用的主要微生物。二是真菌类，主要以毛霉、根霉(Rhizopus)、米曲霉(Aspegillus oryzae)为主，腐乳酿制以毛霉为主，有总状毛霉(Mucor racemosus)、高大毛霉(Mucormucedo)、雅致放射性毛霉(Actinomucor elegans)、腐乳毛霉(Mucor sufu)等，国内登记的有腐乳毛霉3.25，雅致放射性毛霉3.2778等；米曲霉也是发酵豆制品常见的霉菌，如米曲霉3.042、酱油曲霉等，主要用于制作豆酱和豆豉（王瑞芝，2009）。

我国传统的大豆发酵制品之一豆豉，不仅具有良好的风味，还具有很高的营养价值。传统发酵豆豉采用的是自然制曲，包括酵母及曲霉等多种微生物，属于多菌种混合发酵豆豉；其中，米曲霉型豆豉起源最早且分布广泛，其所分泌的蛋白酶对发酵过程中所产生的风味和营养具有重要作用。以下以豆制品发酵产蛋白酶典型菌株毛霉菌的分离筛选为例，介绍蛋白酶产生菌的分离筛选过程。

1．高产蛋白酶产生菌的初步筛选

以邓芳席(1995)分离筛选优良毛霉菌株为例。

（1）单菌分离

从自然生霉的腐乳毛胚、腊八豆曲或浏阳豆豉曲样品上取少量毛霉孢子，点种在牛奶琼脂平板上20℃培养。选取生长速度快，菌丝致密，孢子量多的单个菌落，继续进行多次点种培养。然后用稀释平板分离，待长出单菌落移接斜面。

（2）小试管初筛

采用透明带法，取培养4d的PDA琼脂平板毛霉菌种约0.25cm2，放入小试管初筛液体培养基表面，20℃培养5d。测量菌丝下培养液澄清层高度，选择透明带出现较早，并且较宽的菌株进行菌种复筛。

或取活化培养好的培养液5mL，振荡混匀后用接种环以点接法点滴在脱脂乳固体培养基上，于20~40℃范围培养48h，挑选菌体周围产生透明圈较大的菌株，并记录透明圈直径。

（3）三角瓶复筛

取毛霉PDA琼脂平板菌种一小块，接入三角瓶麸皮培养基中，于20℃培养4d，提取酶液，测定蛋白酶活力，这样得到初始菌株。

液体培养法：将挑选出的菌株接种到100mL液体发酵培养基中，选取合适的温度培养48h，取10mL发酵液，离心(4500r/min,20min,4℃)收集上清液，上清液即为粗酶液。收集粗酶液测定蛋白酶的活力。

2．高产蛋白酶生产菌株的诱变育种

一般野生型菌株的性能及耐受性较差，遗传不稳定，往往不能满足现代快速发酵的需求，因此采用不同处理方法进行菌种选育是必不可少的，通过诱变能够得到适用于豆豉发酵的高效菌株，以达到缩短发酵周期和提升发酵产能的目的。

得到初始菌株后可以采用60Co射线诱变或紫外线、亚硝基胍等其他方式结合处理，可以采取以下的程序获得高产蛋白酶或耐高温的菌株（徐建国，2010），具体程序如下：

菌种活化➝菌悬液制备➝紫外诱变条件优化及诱变➝高产蛋白酶菌株筛选➝突变菌株蛋白酶活力测定➝优选高蛋白酶活力菌株➝亚硝基胍诱变条件优化➝高产蛋白酶菌株筛选➝突变菌株蛋白酶活力测定➝优选及遗传稳定性检验

陈方博(2010)采用氦氖诱变与亚硝基胍诱变技术处理产蛋白酶菌株米曲霉(HDF-C14)，细胞发生正突变率为15.79%，而用脉冲频率2450MHz处理试验菌株，并不能促进细胞正突变。

3．产蛋白酶菌株发酵条件的优化

可以依据实际情况采用单一或多种方法混合选育，在确定筛选菌株后再考察培养温度、培养时间和接种量等发酵条件对菌株产酶的影响，并改变培养基的氮源、碳源及起始pH值，优化发酵培养基（吴满刚，2014）。

将筛选出的菌株接种到100mL液体发酵培养基中，于35℃,150r/min的摇床培养48h，测定粗酶液中蛋白酶活力，考察培养温度、培养时间和接种量等发酵条件对菌株产酶的影响，并改变培养基的氮源、碳源及起始pH值，优化发酵培养基。

（四）蛋白酶产生菌的选育实例——鱼酱油发酵

鱼酱油作为传统鱼类发酵产品，有着悠久的历史，是人们的主要蛋白质与营养氨基酸重要来源之一。传统的鱼酱油是以海产低值鱼为原料，与一定比例的海盐混合后经过腌制和长期自然发酵，最后过滤而成的色泽透亮，香气浓郁的液体调味品。传统鱼酱油的高盐环境使发酵过程中的优势微生物为嗜盐菌，主要包括芽孢杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、链球菌属和片球菌属中极度耐盐的细菌，也包括含有细菌视紫红质光合色素的红色极端嗜盐古细菌(extremely halophilic red archaea)和嗜盐乳酸菌(halophilic lactic acid bacteria)。嗜盐乳酸菌中仅有四联球菌属中的一些细菌能在高盐浓度(18%NaCl)下正常生长(Udomsil, et al.,2010)。泰国鱼露发酵过程的优势菌群是芽孢杆菌、棒状杆菌，还有少量的假单胞菌和红色极端嗜盐古细菌(Antonio, et al.,1998)。黄紫燕等对传统鱼露发酵中的微生物动态进行了分析（黄紫燕，2010），检测出乳酸菌和酵母菌是发酵过程中的优势菌。海洋鱼类因其蛋白质含量丰富、种类繁多，在鱼酱油发酵过程中发挥主要作用的是产蛋白酶菌类。下面就以鱼酱油不同时期的发酵样品为例，简述蛋白酶产生菌的选育过程。

（1）鱼酱油蛋白酶产生菌的初筛

目前研究中多采用脱脂牛奶—干酪素琼脂平板法。取鱼酱油发酵过程中不同发酵时期的样品，经预处理后配制成不同梯度稀释液。分别吸取0.1mL稀释液接种于脱脂牛奶琼脂平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌液涂布均匀后，将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养3d，观察透明圈产生情况。用接种环挑取D/d值较大的菌落，划线接种于干酪素琼脂培养基，将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养3d，观察透明圈产生情况。划线分离两次，筛选出D/d值较大的菌落，进一步作下一步的复筛实验。

（2）鱼酱油蛋白酶产生菌的复筛

将初筛得到的菌株接种到牛肉膏蛋白胨发酵培养基中，30℃、150r/min摇床培养2d。取发酵液离心后按照QB747-80中的方法测定蛋白酶活力，根据蛋白酶活力的大小最后得到高产蛋白酶活力的菌株。

二、产海洋活性物质的微生物筛选方法

海洋微生物天然活性物质的筛选首先是海洋微生物的分离筛选。筛选时不仅要考虑到海洋微生物的多种来源以及特定的生长环境，而且还要考虑到微生物的种类。由于产生特定活性物质的微生物是从海洋的不同区域中采集的大量微生物菌株样品中筛选出来的，需要大量筛选工作才有可能得到有价值的菌株。因此需要一套廉价简易的、快速有效的培养筛选模式，首先将无活性的大部分菌株排除掉，再通过别的手段获得具有重要意义和实用价值的高产菌株。研究常用快捷有效的自动化高通量药物筛选方法(HTS)或快速分子筛选方法进行筛选，以下介绍几种常用且有效的筛选方法。

（一）高通量筛选法

中国海洋大学在已有tsFT210细胞的流式细胞术筛选模型基础上（朱天骄，2002），利用研究室现有条件建立了海虾生物致死法筛选模型，并通过组合使用这2种模型，探讨了海虾生物致死法一级初筛和对初筛活性菌株利用流式细胞术模型二级复筛的分级组合筛选模式（韩小贤，2005）。利用这种模型进行分级组合筛选，充分发挥2种模型各自的长处，形成了细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及细胞毒等抗癌活性微生物菌株的简便快速且经济可行的组合筛选模式，该分级组合筛选模式与流式细胞术筛选模型的单独筛选模式相比，无漏筛，具有成本低、速度快、复筛样本数目大大缩小、流式细胞术筛选的工作量减少等特点，适用于大量菌株抗肿瘤活性的体外筛选。

（二）BIA筛选法

此方法多用于海洋微生物中抗肿瘤物质的筛选。虽然抗肿瘤物质筛选方法很多，但试验证明，在体外模型中BIA法以其独特的筛选机制显示出不可忽视的优势。它是利用遗传学方法构建的一株具有K2lacZ片段的溶源性E.coli指示菌菌株，该菌株在正常条件下不表达β-半乳糖苷酶，但当培养介质中含有能作用于DNA的化合物时，菌株就会被诱导产生B2半乳糖苷酶。因此，通过检测是否有β-半乳糖苷酶产生就可初步确定样品中是否含有能够作用于肿瘤细胞DNA的物质。由于天然药物中不少是通过使肿瘤细胞DNA受损伤起作用，因此，可利用此法检测天然产物中具有这种作用机理的抗肿瘤活性物质（张亚鹏，2006），进行快速、特异性方法筛选菌株。

（三）流式细胞术筛选法

流式细胞技术(flow cytometer, FCM)能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个染色体的分析，而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。与传统的用荧光镜检测细胞方法相比，这种以流动的方式（相对静态方式）测量细胞具有速度快、精度高和准确性好的特点，可以说FCM是目前最先进的细胞定量分析技术，该仪器在医学和基础生命科学中已得到广泛应用，在微藻研究中的应用相对说来较为新颖。流式细胞术一经引入微藻学，便很快在微藻的不同研究领域扩展开。

（四）海洋微生物活性产物的其他筛选法

目前，在海洋微生物中筛选活性药物的技术中，高通量筛选方法的应用和完善，提供了在短时间内筛选大量化合物的能力，而这又使得从海洋微生物分离提取各种化合物成为发现活性物质的关键环节（梁剑光，2004）。所以，扩大海洋生物的化学研究，将会建立更多更有效的海洋微生物活性物质筛选方法。

山东农业大学的科研工作者在研究海洋微生物杀虫活性筛选方法中，初筛采用浸虫法，将初筛表现活性的菌株采用“细胞毒”法（MTT法）进行复筛，结果从294株供试菌株中，共有效筛选出7株活性较高的菌株（徐守健，2006）。

胡志钮等以卤虫为指示动物，采用双层琼脂扩散方法构建了一种杀虫微生物筛选模型（胡志钮，2000）。该模型具有灵敏度高、快速简便等优点，适合于海洋微生物杀虫活性物质的早期大量初筛工作。利用该模型对1240株分离于厦门海区潮间带的放线菌进行了初筛，杀虫阳性率为2.3%，展示了海洋微生物是杀虫活性物质研究和开发的重要来源。

许文思等（许文思，2001）建立了一种利用两个菌株对DNA损伤修复的差异性的DDRT法，可以用来检测受试物对DNA的毒性；建立了液体悬浮法和琼脂固体筛选方法，用于抗肿瘤药物的筛选。这两种方法简便易行，其中琼脂固体筛选方法与常用的抗生素生物鉴定杯碟法一样简单，适用于大量筛选各种来源的抗肿瘤药物。从抗肿瘤药物的作用机理来看，多数抗肿瘤药物的作用机制主要是作用于DNA，因而DDRT法可应用于筛选并得到作用于DNA的抗肿瘤物质。李根等利用这一方法对海洋微生物进行抗肿瘤活性物质的筛选（李根，2004），并对其抗肿瘤作用和DDRT筛选方法作初步探讨，获得成功。

Lemos等使用非选择性分离技术(Lemos, et al.,1986)，从北太平洋海水中分离到一种能产生抗生素和紫色素的色杆菌，这种化合物能抑制金黄色葡萄球菌。

（五）优化发酵条件法

研究微生物合适的发酵条件，从而更快培养分离微生物也是一种方法。魏向阳等研究了产脂肪酶菌株L42的筛选及最适发酵培养条件（魏向阳，2008），结果表明最佳生长条件为20℃,5%接种体积分数，培养基初始pH为8.0，摇瓶装液体积50mL（250mL三角瓶），NaCl质量分数为2%~4%，培养24h，获得大量脂肪酶。林学政等通过液体培养基培养海洋嗜冷菌产脂肪酶条件（林学政，2005），首先经南极科考从表层水深至3300米不等的南大洋的海洋环境中采样，在含Tween80的培养基平板上分离培养，经发酵培养后测定脂肪酶酶活，比较产酶活性获得酶活较高的菌株。邵铁娟等对产低温碱性脂肪酶海洋菌株进行研究（邵铁娟，2004）。朱义明等也曾从广西北海70个海洋动物表皮或肠道中分离并筛选了抗金黄色葡萄球菌的微生物（朱义明，2007）。

以下进一步通过优化发酵条件法筛选微生物的案例，说明此法的实际应用。几丁质酶是诱导性酶，而几丁质广泛存在于甲壳类动物、节肢动物的外壳中，因此要有针对性从海洋中取样，富集培养分解几丁质的菌株，利用以几丁质为唯一碳源的培养基进行菌株富集培养，限制了绝大多数不能利用几丁质的微生物生长，促进了能够产生几丁质酶的菌株生长繁殖，使目标微生物在富集培养液中所占比例增大，进而筛选目标微生物。筛选产几丁质酶的微生物较为常用的方法是透明圈法，以不溶性白色胶体几丁质为唯一碳源制成平板，以平板上菌落周围透明圈的大小判断菌株产几丁质酶活性的高低。

此外，还可以考虑将环境介质或一些与环境介质相关的特定化学物质或细胞信号分子，如cAMP、细胞能源物质ATP及微生物复苏促进因子(resuscitation-promoting factor, RPF)等，添加至微生物培养基中。岳秀娟等探索了在培养基中加入土壤浸出液的分离方法（岳秀娟，2006），发现4株必须在含有土壤提取液的培养基上才能生长的菌株，表明传统的分离方法确实可能忽略了这类微生物的分离。为克服培养过程中氧气对微生物的毒害作用，可采取两方面措施。一方面降低“活性氧物质”；另一方面则在培养过程中添加具有降解毒性氧能力的物质，使处于VBNC状态的微生物在营养丰富的培养基上得以恢复生长繁殖能力，从而增加可用于分离与培养的微生物种类。

三、产组胺微生物的分离与筛选

生物胺，一类含氮低分子量化合物的总称，按化学结构可分为杂环类（色胺、组胺）、芳香族（苯基乙胺、酪胺）和脂肪族（精胺、亚精胺、尸胺和腐胺）(Lonvaud,2001)。其中组胺的毒性最大，酪胺次之。Taylor等发现二级胺包括腐胺和色胺的存在具有协同作用(Taylor &Speckhard,1983)，能增强组胺的毒性。另外，Shalaby等指出生物胺也可能是诱变前体(Shalaby,1996)，胺的存在可以和亚硝酸盐反应形成具有强致癌作用的亚硝胺。据研究报道，生物胺广泛存在于各种食品中，如干酪、发酵香肠、果酒、水产品和发酵蔬菜等，特别是富含蛋白质及氨基酸强化食品和发酵食品。食品中过量的生物胺会对机体健康造成不良的影响(Til, et al.,1997; Laura & Natalija,2007)。美国FDA通过对大量组胺中毒暴露数据的评估，确定组胺危害作用水平为500mg/kg（食品）。欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100mg/kg；其他食品中组胺不得超过100mg/kg，酪胺不得超过100~800mg/kg。以下将从微生物角度出发，利用鉴别培养基结合HPLC检测筛选，以腌制蔬菜作为待分离样品，以此分离出产组胺菌株，并经16 SrDNA序列分析鉴定种属；对得到的可疑菌株进一步研究其pH、温度和盐度等培养因素对菌株生长和产组胺量的影响，以明确产组胺菌株的生理生化特性，从而为发酵食品类组胺物质的控制提供理论依据。

（一）产组胺菌株的鉴别筛选

从发酵腌制蔬菜等样品液中经分离纯化得到细菌菌株，挑取斜面保藏的分离纯化菌株分别对应在MRS和PCA培养基平板上划线培养，连续转接活化2~3代，再将各菌株通过点种法接种于产组胺菌鉴别培养基（蛋白胨5.00g，牛肉浸膏5.00g, L-组氨酸5.00g，氯化钠2.50g,5'-磷酸吡哆醛0.05g，琼脂15.00g，溴甲酚紫0.06g，蒸馏水1000mL，加热溶解，调pH至5.5后经灭菌操作），放置于30℃条件下培养48h，菌落生长良好且周围有紫色晕环产生的确定为产组胺可疑菌株，再经划线法接种于产组胺菌鉴别培养基培养，进行复筛。

（二）产组胺菌株的确认

将4℃斜面保藏的经初步筛选的可疑菌株连续划线转接2~3代，挑取一环活化后的菌株分别对应接种于MRS肉汤培养基和营养肉汤培养基中，30℃下振荡培养18h。以1%接种量将新鲜种子液接种于组胺发酵培养基(L-组氨酸10.00g，大豆蛋白胨17.00g，葡萄糖2.50g，丙酮酸钠10.00g，氯化钠3.00g，磷酸氢二钾2.50g，蒸馏水1000mL，调pH6.0)中，于30℃下培养36h，以不接种培养作对照组，以HPLC法检测发酵液样品中是否有组胺产生。

通过产组胺菌鉴别培养基筛选，有6株MRS培养基中生长的优势菌株能使培养基变紫红色，如图3-10所示。将6株菌株分别编号为M1至M6，其中M1为0天，M2和M3为5天，M4和M5为10天，M6为20天的冬瓜腌制体系中的优势菌株。将菌株M1至M6接种培养于组胺发酵培养基中，利用HPLC检测其发酵液中的组胺含量。

产组胺菌株的16 SrDNA基因序列分析和系统发育的建立：提取组胺菌株的总DNA，菌株的16 SrDNA经测序后发现M1、M2和M5以及M3和M4的碱基序列分别完全相同，因此，归属5株菌株为2个菌种。将16SrDNA序列在EzBioCloud数据库中进行同源性比对，同种菌中各取菌株M1和M3构建系统发育树，如图3-11所示。由图3-11可知，M1和M3均为肠杆菌属，而M1和Enterobacter aerogenes（产气肠杆菌）、M3和Enterobacter xiangfangensis分别聚成一支，相似度的值均达到90以上。M1和Enterobacter aerogenes、M3和Enterobacter xiangfangensis亲缘关系最近。

四、细菌素产生菌的选育与发酵技术

食品安全问题一直是国内外关注的热点。随着生活质量不断提高，健康绿色的食品也越来越受到人们的青睐。人们对食品中的防腐剂安全性提出了更高的要求。而我国使用的食品防腐剂绝大部分都是化学合成物，某些化学防腐剂对人体都有一定的毒害，所以寻找一种可替代化学防腐剂的天然安全防腐剂是目前科学家所关注的焦点。20世纪20年代中期，Gratia发现大肠杆菌V菌株代谢过程中能产生一些抑制ϕ菌株生长的物质，随后Gratia和Fredrericp对V菌株的分泌物进行研究，发现是一种类似于噬菌体，但不能够自主复制的物质在起作用，Fredrericp称其为大肠菌素(Gratia,1925)。1928年Rogers等首次在革兰氏阳性菌中发现类似于大肠杆菌素的代谢产物(Rogers,1928)。1933年Whitehead等(Whitehead,1933)从乳酸菌中分离得到一类具有抑菌活性的物质，在1947年将这类物质命名为尼生素(nisin)(Mattick,1947)。Jacob等人称这类抑菌物质为细菌素(Mary-Harting, 1972)。直到1982年Konisly对细菌素做出了明确的定义：细菌素(bacteriocin)是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌能力的蛋白质或者多肽，抑菌范围不仅局限于同源细菌，产生菌对其细菌素有一定的自身免疫性(Jack,1995)，既可以由革兰氏阴性菌产生，也可以由革兰氏阳性菌产生。

乳酸菌素是一类由乳酸菌在生长代谢过程中产生的多肽类物质，具有较好的热稳定性，能有效地抑制或杀死食物中多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌，少数乳酸菌素对革兰氏阴性菌也有一定的抑菌效果。美国FDA早在1988年就正式批准细菌素Nisin可用于奶酪的生产中（彭沈军，1995），从而开创了细菌素作为生物防腐剂应用于食品中的先例。现在细菌素nisin作为一种天然的防腐剂已经广泛应用在食品领域中，我国在20世纪90年代也批准了Nisin的使用。目前国内外对细菌素的研究已经比较深入，除了已经广泛研究的乳酸链球菌肽(nisin)，还有乳球菌素(lactococcin)、片球菌素(pediocin)、明串珠菌素(canonic)、肉食杆菌素(carnobacteriocin)、植物菌素(plantadcin)、乳杆菌素(lactocin)等(Tagg,1976)。细菌素高产菌株的筛选、育种和发酵条件的优化是目前细菌素研究的重点。

（一）传统诱变育种

微生物育种，无论是从自然变异中选择或是人工诱变选择都是建立在遗传和变异的基础上，而遗传和变异是生物界生命活动的基本属性之一。诱变育种是以人工诱变基因突变为基础的最主要的微生物育种方法，是各国沿用至今的有效方法，尤其是在发酵工业中绝大多数优良高产菌株都是采用诱变育种的方法获得的。对nisin生产菌的诱变育种的方法有：紫外线诱变，微波诱变等。

1．紫外线诱变

是最早使用、应用最广、效果明显的微生物诱变方法，这种方法诱变率高，而且不易回复突变，是微生物育种中最常用和有效的诱变方法之一。紫外线诱发微生物突变的波长范围为200~300nm，最有效的波长为253.7nm，当紫外线照射微生物细胞时，DNA强烈吸收此光谱而引起突变或杀伤作用。我们一般采用15W紫外灯照射，15W的紫外灯放射出来的光谱大约有80%集中在诱变最有效的253.7nm。紫外线对微生物诱变的量，在灯的功率和距离一定的情况下，剂量大小由照射时间决定。

2．微波诱变

是一种新兴的、操作简单又比较安全的诱变育种方法。微波是高频交变的电磁波，具有传导能力和很强的穿透力，能够造成水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动，这种震动会引起菌体内DNA分子间强烈的摩擦，使DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损，使DNA结构发生变化，从而引起变异（李豪，2005）。由于微波具有传导作用和极强的穿透力，所以在诱变过程中究竟是微波辐射直接作用DNA引起变异，还是因为穿透力使细胞壁通透性增加导致DNA交换而引起突变，到目前为止还不是很明确。但是微波育种可以避免化学试剂和某些物理诱变方法对人体造成伤害，这是微波诱变育种的优点。

（二）现代分子生物学手段育种

1．Genome shuffing技术育种

随着分子生物学和科学技术的发展进步，在上个世纪末提出了一种将传统诱变和原生质体融合的新兴菌种改良技术(genome shuffing)，其原理是首先通过传统诱变筛选得到若干正向突变菌株，然后将这些突变菌株作为递推式原生质体融合的出发菌株库，经多次原生质体融合后，株内基因组间发生随机重组，最终通过适当的筛选方法获得改良菌株。1996年，Stoyanova等(Stoyanova,1998)将两个同源低产nisin产生菌L.lactic 729和L.lactic 1605进行原生质体融合，筛选出的融合子的nisin产量比融合前提高了10~14倍。实践表明，Genome shuffing技术在选育高产nisin菌株方面效果显著。

2．基因工程方法育种

近年来，随着分子生物学理论和技术的日益完善，以及对各种细菌素生物合成途径和代谢调节认识的深入，越来越多科学家利用基因工程手段对细菌素产生菌进行遗传改造而获得高产菌株。目前，主要是通过对nisin生物合成的相关基因进行过表达或增加其拷贝数来提高nisin合成能力。而II类细菌素中的片球菌素PediocinPA-1的基因工程育种，则应用PCR方法扩增编码成熟pediocin PA-1的基因片段转化大肠杆菌高效表达系统，是目前常用的基因工程生产体系。

同时，随着细菌细胞间信号转导研究的深入，科学家还发现很多细菌都能够依靠分泌某种化学分子来进行信号转导并协调群体行为。细菌依赖信号分子密度识别的一种细胞间相互交流通讯机制，可调控基因表达，这种现象被称为细菌的群体感应(quorum sensing, QS) (Bassler,1999)（详见第7章第二节）。很多细菌会低水平地合成并分泌自诱导小分子信号分子，细菌通过这些信号分子进行信息的交流；当信号分子处于低浓度状态时，它不足以诱导目的基因的表达；信号分子的浓度随着细菌浓度的增大而增大，当这个信号分子的浓度到达阈值时，就会诱导一些结构基因表达，同时也会诱导其自身合成基因的表达，产生更多的信号分子来诱导结构基因和自身基因大量表达，这种正反馈机制也可以用来诱导细菌素的高产。目前研究已证实多数II型细菌素的生物合成由QS系统调控。植物乳杆菌中的L. p lantarum C11、L.p lantarum WCFS1和L.plantarum NC8中细菌素的生物合成与QS系统调控密切相关。其中植物乳杆菌C11的调节操纵子plnABCD编码一个自动调整的系统，激活自身转录，同时促进另外4种位于pln基因座的操纵子转录，plnABCD分别编码自诱导肽（成熟自PlnA）、HPK(PlnB)和两种高度同源的反应调节器PlnC和PlnD。这类细菌素的群体感应的基因调控机制一般按以下几个步骤：自诱导前提肽段在核糖体内合成，并结果特殊的转录修饰和加工，形成有活性的自诱导肽，由ABC转运系统运输到细胞外。随着细胞的生长，自诱导肽在细胞外积累，到一定量后便激活细胞膜上的PlnB蛋白——组氨酸蛋白激酶并与其结合，在保留的组氨酸残基处自磷酸化，硫酸基团则被运输给作为调节因子的PlnC和PlnD基因编码的蛋白PlnC和PlnD。被磷酸化后的调节因子特意结合到目标启动子，阻遏或激活目标蛋白的表达，使自诱导肽和细菌素产生。所以可以通过外加自诱导肽，让自诱导肽的浓度到达阈值，从而促进细菌素的高产。

鉴于目前细菌素工业化生产的实际情况，需要选择合适的育种技术和生物学手段来获得优质高产的细菌素表达菌株。随着生命科学技术和工业微生物技术的发展，细菌素规模化生产和应用将有广阔的前景。

（三）细菌素发酵技术

目前细菌素的应用研究存在细菌素产量低等问题，细菌素的发酵技术是细菌素应用的一个关键技术。由于只有nisin是被批准工业化生产的细菌素，本文着重以nisin为例介绍关于细菌素产生菌的发酵技术。

1．菌种的筛选

产nisin原始生产菌株大多是从乳制品中分离的，少量从蔬菜和肉类的样品中经多次分离后得到的。最终的工业生产用菌株大多是通过对原始菌株的诱变得到的。其诱变方法主要是进行物理化学复合诱变，诱变后随机筛选出菌株进行培养确定生产能力。该方法工作量大，操作繁琐。因此，至今已报道的有采用双层平板法进行初筛，减小了工作量，提高了筛选高产菌的几率。还有利用基因技术对nisinZ的产生菌进行定点突变并对突变体的性质进行了研究，但该方法还没有大范围的采用；还有根据乳链菌肽抗性与乳糖发酵紧密联系的原理对乳链菌肽抗性菌株进行了筛选；当然还有通过构建产nisin的基因工程菌得到高产nisin的菌株(Cheigh,2005)。

2．培养基成分及发酵条件

nisin的发酵生产主要是通过乳酸链球菌菌株培养基加碳源（通常是蔗糖）、氮源（如蛋白胨、酵母粉）、无机盐类和吐温等得到；发酵的效果主要受碳源和氮源的影响，另外，磷酸盐、阳离子、表面活性剂和抑制剂的种类和含量等对生产也有很大的影响。

（1）碳源

nisin发酵中最佳的碳源是葡萄糖和蔗糖，利用葡萄糖和蔗糖发酵可得到最大的nisin产量，另外，木糖也是合适的碳源。一些研究表明，间歇补充碳源有利于提高nisin产量。

（2）氮源

nisin的合成需要利用大量的氨基酸，因此氮源的种类直接影响着nisin的产量，一般选用胰蛋白、酪蛋白的水解物、植物蛋白胨、玉米浆等为氮源生产nisin。经研究表明，以大豆蛋白胨、酵母膏、鱼粉、棉子粉作氮源较为理想。此外，在基本培养基（以蔗糖为碳源添加8种必需氨基酸和5种维生素）中添加nisin前体氨基酸如半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸等，有助于发酵液中nisin产量的提高。

（3）其他因素

无机磷酸根能够影响某些nisin生产菌的产量，KH2PO4被认为是最佳的磷源；金属离子也是影响nisin发酵的因素，Ca2+能促进nisin的生物量及活性增加，Mn2+则会减少nisin约1/3的产量(Matsusaki, et al.,1996)。

（4）pH

在最优化的发酵条件下，可使乳酸菌菌体产量和nisin产量达到最优值。目前工业化生产中，最佳的发酵温度为30℃, pH的控制一般为5.8~6.3，由于菌种和培养基的不同，最佳pH值略有差异，目前控制pH值的方法有流加NaOH溶液和去除发酵过程中所产生的乳酸(Yu,2002)，这两种方法均可使nisin的产量得到大幅度的提高。生产中可通过将最后稳定的酸性p H值反复碱化至初始p H值（中间的间隔时间大约为6小时）而使nisin产量翻倍。

3．发酵类型

目前工业化生产nisin大多采用分批发酵的形式，操作简单，能够获得较高的nisin产量，一般维持在4500~6000IU/mL，但是生物量和nisin的生成容易受到高浓度底物和代谢产物累积的制约，发酵终点不易判断，生产效率低。

采用连续化工业生产可以通过调节培养基而解决这个制约的问题，从而提高目标物的产率。另外还有应用膜技术进行细胞循环的连续化发酵技术，即将产生的nisin不断地分离出反应器，减少了代谢产物的抑制，产率略高于分批发酵和无细胞循环的连续发酵。用回收细胞进行的连续发酵（用陶瓷膜保留细菌素）可在高稀释度下生产nisinZ，在生产能力上有一定改善。但是连续发酵培养基的灭菌操作复杂，发酵过程中容易染菌，对设备要求高。

孔健等(2001)以海藻糖为载体对nisin生产菌进行的固定化细胞连续发酵，实现了反应器中细胞浓度的增大，可以在稀释率高于菌株最大生长率的条件下进行连续培养，提高了生产效率，并且发酵液中的游离细胞少，有利于产品的分离纯化。固定化培养有高产率、高细胞浓度、长期操作稳定等优点，但是固定化培养的缺点是单位效价较低，目前固定细胞颗粒的稳定性和连续培养时间，仍然是首先需要解决的问题。

补料分批发酵方式可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成的底物抑制，葡萄糖的阻遏效应以及因菌体生长过旺而导致的nisin合成原料的不足，又比连续培养更易操作和更精确；应用于实际生产中可以避免原料的浪费，缩短生产周期，提高最终产物的浓度，对于降低生产成本，提高生产效率有着深远的意义。目前，对于nisin的补料分批发酵有非反馈控制和反馈控制两类。前者完全是凭借经验操作，可以是一次补加营养液，也可以少量多次补加，还可以连续流加补料；而流加补料又分为恒速流加、变速流加和指数流加三种，这种非反馈控制的补料操作简单，但带有一定的盲目性，重复性较差。后者是根据一、两个可在线检测的参数（如基质糖残留量、pH值和溶解氧浓度等）设定控制点，分为恒pH、恒残糖，恒溶氧等多种补料方式，相对盲目性要小得多，重复性较好。

4．培养新型发酵方式——混菌发酵

将能利用乳酸的酵母菌(Kluyveromyces marxianus)和乳酸菌(Lactococcus lactis)共同培养，并通过控制发酵液中的溶氧浓度来控制发酵过程中的pH值。加碱控制pH值为6.0时，Nisin的产量为58mg/L；与酵母菌共培养时，nisin的产量为98mg/L(3920IU/mL)，是纯培养的1.7倍(Shimizu, et al.,1999)。Liu等将Lactococcus lactis与另一种酵母Saccharomyces cerevisiae共同培养，结果显示，乳酸菌产生的乳酸基本都被酵母菌利用，且pH值维持在6左右，混合培养中nisin的产量为150.3mg/L，是L.lactis纯培养的1.85倍(Liu, et al.,2006)。郭淑文等(2010)以乳清为原料将乳酸链球菌与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混菌共培养，结果表明，混菌发酵对nisin的产生有促进作用，在接种比例为乳酸菌3%(V/V)，酵母菌5%(V/V)，混菌发酵16h时，效价达到782.05IU/mL，远高于单菌发酵。混菌发酵时，酵母菌的存在确实可以促进乳酸菌的生长，比单菌发酵的乳酸菌数高出近5倍；研究还表明，混菌发酵解除了乳酸盐对nisin发酵的抑制作用，这也是混菌发酵促进nisin产生的原因。

加入酵母菌进行混合培养的发酵不但能消耗掉生成的乳酸，同时由于酵母菌不能利用发酵培养基中的乳糖或麦芽糖，从而不会影响nisin的产量，也不增加发酵成本，是一种很有前景的措施。

五、一种乳酸菌的分离与筛选

（一）乳酸杆菌的分离

从不同基质中分离乳酸杆菌时，根据乳酸杆菌所在生长环境的不同以及是否为优势菌可选择不同组分的培养基。

1．MRS培养基

MRS培养基适用于已知乳酸杆菌，是待分离区系的优势菌。目前MRS培养基已经成为国际上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基，常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。

2．RSMA

RSMA培养基是近几年发展起来的一种非选择性培养基，其最大优点是可以使不同菌种在其表面生长并形成颜色各异易于鉴别的菌落。因此，便于乳酸杆菌与其他细菌的鉴别。但此培养的营养成分比较单一，不适于从菌群组成复杂的环境中分离乳酸杆菌。

3．番茄汁琼脂培养基

这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基。此培养基中含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供了必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更易生长。但操作费时费力，目前不常用。

4．其他培养基

某些选择性培养基可用于在菌群复杂的基质（例如肠道）内进行乳酸杆菌的分离。

（二）乳酸杆菌的鉴定

1．属水平的鉴定

此水平的鉴定是乳酸杆菌整体鉴定过程中较为简单且最为基本的步骤，常用的方法是对分纯后的乳酸杆菌培养物进行革兰氏染色、镜检，选择无分叉的G+杆菌。这种菌能在pH4.5的条件下生长，且经过一系列相关试验均为阴性，即可鉴定其为乳酸杆菌属。

2．种水平的鉴定

（1）生化鉴定

此水平的生化试验主要采用糖醇类发酵试验。依据不同乳酸杆菌对糖的利用情况不同进行鉴定。传统的生化鉴定成本较低，但费时费力，且反应管种类较少，所得结果的判定受到限制。近年来，多采用最新研制的可得结果准确可靠的快速生化鉴定系统。但价格昂贵，此两种方法均不适于大规模菌种的鉴定。

（2）基因鉴定

PCR-随机扩增多态性DNA通过对PCR产物的分析检测，以获得基因组DNA在待测区域内的多态性进行鉴别，具有快速、简便、成本相对较低、特异性强等特点，尤其对于鉴别亲缘关系较近的细菌更为有效，但需要相关的标准菌株做参比。

限制性片段长度多态性PCR即RELP，是一种全基因组方法，该方法具有操作简便、快速、终点判断准确等优点，但酶的选择困难且价格昂贵。

PCR-变性梯度凝胶电泳PCR-DGGE可以区分含碱基成分不同而片段大小一致的DNA序列，甚至一个碱基对的不同都会引起DNA片段停留于凝胶的位置各异，具有快速、全面的特点。但此技术也有其限制性。

多重PCR可同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率等优点，但对操作者技术要求较高且多重PCR的结果特异性较差。

3．株水平的鉴定

脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法被认为是乳酸杆菌分类鉴定的最好也是最有效的方法，但费时费力。

思考题

1．什么叫微生物的分离，微生物分离有哪些常用方法？

2．以蛋白酶产生菌为例，设计一种高产蛋白酶菌种选育的整个实验流程，并写出操作的实验原理及方法。

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