第二节　蔬菜检验方法

一、新鲜蔬菜的取样方法

1.取样的一般要求

新鲜的蔬菜样品不论进行现场常规鉴定还是送实验室做品质安全检测，一般要求随机取样。在某些特殊情况下，例如，为了查明混入的其他品种或者任意类型的混杂，允许进行选择取样，取样之前要明确取样的目的，即明确样品的鉴定性质。抽取混合样本，不能以单株（或单个果实）作为检测样本。抽样过程中，应及时、准确记录抽样的相关信息。所抽样本应经被抽单位或个人确认，生产地抽样时应调查蔬菜生产、管理情况，市场抽样应调查蔬菜来源或产地。

采集的货物样品，应能充分代表该批量货物的全部特征。从样品中剔除损坏的部分（箱、袋等），损坏和未损坏部分的样品分别采集。

2.取样准备

①抽样前应制定抽样方案。

②应事先准备好抽样袋、保鲜袋、纸箱、标签、封条（如需要）等抽样用具，并保证这些用具洁净、干燥、无异味，不会对样本造成污染。抽样过程不应受雨水、灰尘等环境的污染。

③抽样人员应不少于2人。抽样人员应持个人有效证件（身份证、工作证等）、抽查文件、记录本、抽样单和调查表等。

3.取样时间

（1）生产地

根据不同品种在其种植区域的成熟期来确定，蔬菜取样应安排在蔬菜成熟期或蔬菜即将上市前进行。

（2）批发市场

宜在批发或交易高峰时期取样。

（3）农贸市场和超市

宜在抽取批发市场之前进行。

4.取样方法

（1）生产地

当蔬菜种植面积小于10hm2（1hm2=104m2）时，每1～3hm2设为一个抽样单元；当蔬菜种植面积大于10hm2，每3～5hm2设为一个抽样单元。当在设施栽培的蔬菜大棚中抽样时，每个大棚为一个抽样单元。每个抽样单元内根据实际情况按对角线法、梅花点法、棋盘式法、蛇形法等方法采取样本，每个抽样单元内抽样点不应少于5个，每个抽样点面积为1m2左右，随机抽取该范围内的蔬菜作为检测用样本。

生产地取样一般每个样本取样量不低于3kg，单个个体大于0.5kg时，抽取样本不少于10个个体，单个个体大于1kg时，抽取样本不少于5个个体。取样时，应除去泥沙、黏附物及明显腐烂和萎蔫部分。

（2）批发市场

①批量货物的取样准备。批量货物取样，要求及时，每批货物要单独取样。如果由于运输过程发生损坏，其损坏部分（盒子、袋子等）必须与完成部分隔离，并进行单独取样。如果认为货物不均匀，除贸易双方另行磋商外，应当把正常部分单独分出来，并从每一批中取样鉴定。

②抽检货物的取样准备。抽检货物要从批量货物的不同位置和不同层次进行随机取样。

a.包装产品。堆垛取样时，在堆垛两侧的不同部位上、中、下或四角抽取相应数量的样本。对有包装的产品（木箱、纸箱、袋装等），按照表4-1随机取样。

b.散装产品。应视堆高不同从上、中、下分层取样，每层从中心及四周五点取样。取样量与货物的总量相适应，每批货物至少取5个抽检货物。散装产品抽检货物总量或货物包装的总数量按照表4-2抽取。在蔬菜或水果个体较大情况下（大于2kg/个），抽检货物至少由5个个体组成。

③农贸市场和超市。同一蔬菜样本应从同一摊位抽取。

（3）填写抽样单

抽样人员要与被检单位代表共同确认样本的真实性和代表性，抽样完成后，要现场填写抽样单，抽样单一式三份，由抽样人员和被检单位代表共同签字或加盖公章，一份交被检单位，一份随样品，一份由抽样人员带回。

5.样本的封存和运输

（1）样本的封存

样本封存前要将“随样品”的抽样单一并放在袋内，将样本封存，粘好封条，要求标明封样时间，封条应由双方代表共同签字。

（2）样本的运输

样本应在24h内运送到实验室，否则应将样本冷冻后运输。原则上不准邮寄和托运，应由抽样人员随身携带。在运输过程中应避免样本变质、受损或遭受污染。

6.样本缩分

（1）场所

场所应通风、整洁、无扬尘、无易挥发化学物质。

（2）混合样品或缩分样品的制备

混合样品的制备：混合样品必须集合所有抽检货样品，尽可能将样品混合均匀。缩分样品通过缩分混合样品获得。

对混合货样或缩分样品，应当现场检测。为了避免受检样品的性状发生某种变化，取样之后应当尽快完成检验工作。

二、大白菜总灰分及水溶性灰分碱度的测定

1.定义

①总灰分：按照本方法规定的条件，灼烧100g试样所得残灰的质量（g）。

②总灰分的碱度：按照本方法规定的条件，中和100g试样所得的灰分所需的酸，以毫克当量计。

③水溶性灰分的碱度：按照本方法规定的条件，中和100g试样所得的灰分水浸出物所需的酸，以毫克当量计。

总灰分和水溶性灰分的碱度也可以按碱指数表示。

④碱指数：按照本标准规定的条件，中和从试样中所得的1g灰分所需的0.1mol/L酸溶液的体积（mL）。

2.原理

①总灰分：在（525±25）℃下用灼烧重量法测定。

②总灰分的碱度：在（525±25）℃下灰化制品，加过量的硫酸标准溶液，然后在指示剂存在的情况下，用氢氧化钠标准溶液反滴定。

③水溶性灰分的碱度：在（525±25）℃下灰化制品，用热水浸出灰分，然后在指示剂的存在下用硫酸标准溶液中和水浸出物。

3.试剂与仪器

全部试剂均为分析纯，均用不含二氧化碳的蒸馏水配制。

①c（1/2H2SO4）=0.1mol/L硫酸标准溶液。

②0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。

③指示剂：加10g/L甲基蓝溶液4mL于100mL的1g/L甲基橙溶液中。

④坩埚：30～50mL的石英坩埚或瓷坩埚（一次性使用）。

⑤马福炉（muffle furnace）。

4.检测过程

（1）总灰分的测定

①坩埚的恒重。用稀盐酸（1+4）将坩埚煮1～2h，洗净置于马福炉内（525±25）℃下灼烧30min，待炉温降至200℃以下时，将坩埚移入干燥器中，冷却至室温称重，准确至0.0001g，重复灼烧至恒重。

②试样的制备。均匀地混合实验室样品。如样品经密闭冷冻保存，则必须令其解冻，温度回升至室温后均匀取样。

③试验部分。称新鲜大白菜5.10g，称准至0.001g，置于一预先恒重的坩埚内。

④炭化。以小火加热使样品充分炭化至无烟。

⑤灰化。将炭化完全的试样放入马弗炉中，于（525±25）℃下灰化直至无炭化物残留为止。待炉温降至200℃以下时，将坩埚移入干燥器中，冷却至室温称重，称准至0.0001g，重复灼烧至恒重。

（2）灰分碱度的测定

①总灰分碱度的测定。准确吸取约10～15mL的硫酸标准溶液处理灰化中所得的灰分，定量地移入200mL的锥形瓶中，用少量热水漂洗坩埚，在电热板上煮沸加液至透明，然后冷却至室温，加2滴混合指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液由浅紫色变为橙黄色。

②水溶性灰分的碱度。加约20mL热水于灰化所得的灰分中，全部移入一漏斗中的毯纸内，然后用少量热水洗涤滤纸上的残留物，将洗涤液并入滤液，待滤液冷却后加2或3滴混合指示剂，用硫酸标准溶液滴定至溶液由橙黄色变为浅紫色。

5.结果表示

（1）计算方法和公式

①总灰分。以灼烧100g试样所得的灰分质量表示：

　　（4-1）

式中　X——总灰分，%；

m1——试样灰化后所得灰分的质量g；

m——试样的质量，g。

②总灰分的碱度

a.总灰分的碱度。以100g试样中的毫克当量数表示，按下式计算：

　　（4-2）

b.总灰分的碱指数。以每克灰分所需的0.1mol/L酸溶液的体积（mL）表示，按下式计算：

　　（4-3）

式中　A——总灰分的碱度，毫克当量；

n——总灰分的碱指数；

N1——硫酸标准溶液的浓度；

V1——在“总灰分碱度的测定”中所加的硫酸标准溶液的体积，mL；

N2——氢氧化钠标准溶液的物质的量浓度；

V2——在“总灰分碱度的测定”中所加的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

m——试样的质量，g；

m1——试样灰化后所得灰分的质量，g。

③水溶性灰分的碱度

a.水溶性灰分的碱度。以100g试样中毫克当量数表示，按下式计算：

　　（4-4）

b.水溶性灰分的碱指数。以每克灰分的0.5mol/L酸溶液的毫升数表示，按下式计算：

　　（4-5）

式中　Aw——水溶性灰分的碱度；

nw——水溶性灰分的碱指数；

N1——硫酸标准溶液的物质的量浓度；

V'1——在“水溶性灰分的碱度”中所加入的硫酸标准溶液的体积，mL；

m'——试样的质量，g；

m'1——试样灰化后所得灰分的质量，g。

液体样品的结果以100mL试样中的含量表示。

若符合重复性的要求，取两次测定的算术平均值作为结果。结果保留到小数点后二位。

（2）重复性

同一分析者同时或相继两次测定的结果的相对误差均不超过5%。

本标准中的恒重要求均为两次测定之差不超过0.0005g。

三、芹菜中粗纤维的测定（GB/T 5009.10—2003）

1.原理

芹菜试样在硫酸作用下，试样中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解除去后，再用碱处理，除去蛋白质及脂肪酸，剩余的残渣为粗纤维。如其中含有不溶于酸碱的杂质，可灰化后除去。

2.试剂

①1.25%硫酸。

②1.25%氢氧化钾溶液。

③石棉：加5%氢氧化钠溶液浸泡石棉，在水浴上回流8h以上，再用热水充分洗涤，然后用20%盐酸在沸水浴上回流8h以上，再用热水充分洗涤，干燥，在600～700℃中灼烧后，加水成为混悬物，储存于玻塞瓶中。

3.分析步骤

①称取20～30g捣碎的芹菜试样（或5.0g干试样），移入500mL锥形瓶中，加入200mL煮沸的1.25%硫酸，加热使微沸，保持体积恒定，维持30min，每隔5min摇动锥形瓶一次，以充分混合瓶内的物质。

②取下锥形瓶，立即用亚麻布过滤后，用沸水洗涤至洗液不呈酸性。

③再用200mL煮沸的1.25%氢氧化钾溶液，将亚麻布上的存留物洗入原锥形瓶内，加热微沸30min后，取下锥形瓶，立即以亚麻布过滤，以沸水洗涤2～3次后，移入已干燥称量的G2垂融坩埚或同型号的垂融漏斗中，抽滤，用热水充分洗涤后，抽干。再依次用乙醇和乙醚洗涤一次。将坩埚和内容物在105℃烘箱中烘干后称量，重复操作，直至恒量。

如试样中含有较多的不溶性杂质，则可将试样移入石棉坩埚，烘干称量后，再移入550℃高温炉中灰化，使含碳的物质全部灰化，置于干燥器内，冷却至室温称量，所损失的量即为粗纤维量。

④结果按式（4-6）进行计算。

　　（4-6）

式中　X——试样中粗纤维的含量；

G——残余物的质量（或经高温炉损失的质量），g；

m——试样的质量，g；

计算结果表示到小数点后一位。

4.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

四、蔬菜中维生素C含量的测定

1.原理

染料2，6-二氯靛酚的颜色反应表现两种特性，一是取决于其氧化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态变为无色，二是受其介质的酸度影响，在碱性溶液中呈深蓝色，在酸性介质中呈浅红色。

用蓝色的碱性染料标准溶液，对含维生素C的酸性浸出液进行氧化还原滴定，染料被还原为无色，当到达滴定终点时，多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色，由染料用量计算样品中还原型抗坏血酸的含量。

2.仪器设备

①高速组织捣碎机：8000～12000r/min。

②分析天平。

③滴定管：25mL、10mL。

④容量瓶：100mL、50mL。

⑤锥形瓶：100mL、50mL。

⑥吸管：10mL、5mL、2mL、1mL。

⑦烧杯：250mL、50mL。

⑧漏斗。

3.试剂（凡未加说明者均为分析纯）

（1）浸提剂

①偏磷酸：2%溶液（质量浓度）。

②草酸：2%溶液（质量浓度）。

（2）抗坏血酸标准溶液（1mg/mL）

称取100mg（准确至0.1mg）抗坏血酸，溶于浸提剂中并稀至100mL，现配现用。

（3）2.6一二氯靛酚（2，6-二氯靛酚吲哚酚钠盐）溶液

称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中，然后称取2，6-二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却定容至250mL，过滤至棕色瓶内，保存在冰箱中。每次使用前，用标准抗坏血酸标定其滴定度。即吸取1mL抗坏血酸标准溶液于50mL锥形瓶中，加入10mL浸提剂，摇匀，用2，6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色15s不褪色为止。同时，另取10mL浸提剂做空白试验。

滴定度按式（4-7）计算：

　　（4-7）

式中　T——每毫升2，6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数，mg/mL；

c——抗坏血酸的浓度，mg/mL；

V——吸取抗坏血酸的体积，mL；

V1——滴定抗坏血酸溶液所用2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL；

V2——滴定空白所用2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL。

（4）白陶土（或称高岭土）

白陶土对维生素C无吸附性。

4.测定步骤

（1）样液制备

称取具有代表性样品的可食部分100g，放入组织捣碎机中，加100mL浸提剂，迅速捣成匀浆。称10～40g浆状样品，用浸提剂将样品移入100mL容量瓶，并稀释至刻度，摇匀过滤。若滤液有色，可按每克样品加0.4g白陶土脱色后再过滤。

（2）滴定

吸取10mL滤液放入50mL锥形瓶中，用已标定过的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉红色15s不褪色为止。同时做空白试验。

5.结果计算

①计算公式。维生素C含量按式（4-8）计算：

　　（4-8）

式中　V——滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL；

V0——滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL；

T——2，6-二氯靛酚染料滴定度，mg/mL；

A——稀释倍数；

W——样品重量，g。

②平行测定的结果。用算术平均值表示，取三位有效数字，含量低的保留小数点后两位数字。

③平行测定结果的相对相差。在维生素C含量大于20mg/100g时，不得超过2%，小于20mg/100g时，不得超过5%。

五、蔬菜中亚硝酸盐的测定

（一）紫外分光光度法

1.原理

用pH=9.6～9.7的氨缓冲液提取样品中硝酸根离子，同时加活性炭去除色素类，加沉淀剂去除蛋白质及其他干扰物质，利用硝酸根离子和亚硝酸根离子在紫外区219nm处具有等吸收波长的特性，测定提取液的吸光度，其测得结果为硝酸盐和亚硝酸盐吸光度的总和，鉴于新鲜蔬菜、水果中亚硝酸盐含量甚微，可忽略不计。测定结果为硝酸盐的吸光度，可从工作曲线上查得相应的质量浓度，计算样品中硝酸盐的含量。

2.试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682—2008规定的一级水。

（1）试剂

①盐酸（HCl，ρ=1.19g/mL）。

②氨水（NH3·H2O，25%）。

③亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6·3H2O］。

④硫酸锌（ZnSO4·7H2O）。

⑤正辛醇（C8H18O）。

⑥活性炭（粉状）。

（2）试剂配制

①氨缓冲溶液（pH=9.6～9.7）：量取20mL盐酸，加入到500mL水中，混合后加入50mL氨水，用水定容至1000mL，调pH值至9.6～9.7。

②亚铁氰化钾溶液（150g/L）：称取150g亚铁氰化钾溶于水，定容至1000mL。

③硫酸锌溶液（300g/L）：称取300g硫酸锌溶于水，定容至1000mL。

（3）标准品

硝酸钾（KNO3，CAS号为7757-79-1）：基准试剂，或采用具有标准物质证书的硝酸盐标准溶液。

（4）标准溶液配制

①硝酸盐标准储备液（500mg/L，以硝酸根计）：称取0.2039g于110～120℃干燥至恒重的硝酸钾，用水溶解并转移至250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液硝酸根质量浓度为500mg/L，于冰箱内保存。

②硝酸盐标准曲线工作液：分别吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL硝酸盐标准储备液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。此标准系列溶液硝酸根质量浓度分别为0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L和12.0mg/L。

3.仪器和设备

①紫外分光光度计。

②分析天平：感量0.01g和0.0001g。

③组织捣碎机。

④可调式往返振荡机。

⑤pH计：精度为0.01。

4.分析步骤

（1）试样制备

选取一定数量有代表性的样品，先用自来水冲洗，再用水清洗干净，晾干表面水分，用四分法取样，切碎，充分混匀，于组织捣碎机中匀浆（部分少汁样品可按一定质量比例加入等量水），在匀浆中加1滴正辛醇消除泡沫。

（2）提取

称取10g（精确至0.01g）匀浆试样（如制备过程中加水，应按加水量折算）于250mL锥形瓶中，加水100mL，加入5mL氨缓冲溶液（pH=9.6～9.7）、2g粉末状活性炭，振荡（往复速度为200次/min）30min。定量转移至250mL容量瓶中，加入2mL 150g/L亚铁氰化钾溶液和2mL 300g/L硫酸锌溶液，充分混匀，加水定容至刻度，摇匀，放置5min，上清液用定量滤纸过滤，滤液备用。同时做空白实验。

（3）测定

根据试样中硝酸盐含量的高低，吸取上述滤液2～10mL于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。用1cm石英比色皿，于219nm处测定吸光度。

（4）标准曲线的制作

将标准曲线工作液用1cm石英比色皿，于219nm处测定吸光度。以标准溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制工作曲线。

5.结果计算

硝酸盐（以硝酸根计）的含量按式（4-9）计算：

　　（4-9）

式中　X——试样中硝酸盐的含量，mg/kg；

ρ——由工作曲线获得的试样溶液中硝酸盐的质量浓度，mg/L；

V1——提取液定容体积，mL；

V3——待测液定容体积，mL；

m——试样的质量，g；

V2——吸取的滤液体积，mL。

结果保留2位有效数字。

6.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（二）离子色谱法

1.原理

采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器或紫外检测器检测，保留时间定性，外标法定量。

2.试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

（1）试剂

①乙酸（CH3COOH）。

②氢氧化钾（KOH）。

（2）试剂配制

①乙酸溶液（3%）：量取乙酸3mL于100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。

②氢氧化钾溶液（1mol/L）：称取6g氢氧化钾，加入新煮沸过的冷水溶解，并稀释至100mL，混匀。

（3）标准品

①亚硝酸钠（NaNO2，CAS号为7632-00-0）：基准试剂，或采用具有标准物质证书的亚硝酸盐标准溶液。

②硝酸钠（NaNO3，CAS号为7631-99-4）：基准试剂，或采用具有标准物质证书的硝酸盐标准溶液。

（4）标准溶液的制备

①亚硝酸盐标准储备液（100mg/L，以N计，下同）：准确称取0.1500g于110～120℃干燥至恒重的亚硝酸钠，用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

②硝酸盐标准储备液（1000mg/L，以N计，下同）：准确称取1.3710g于110～120℃干燥至恒重的硝酸钠，用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

③亚硝酸盐和硝酸盐混合标准中间液：准确移取亚硝酸根离子（N）和硝酸根离子（N）的标准储备液各1.0mL于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，每升此溶液含亚硝酸根离子1.0mg和硝酸根离子10.0mg。

④亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液：移取亚硝酸盐和硝酸盐混合标准中间液，加水逐级稀释，制成系列混合标准使用液，亚硝酸根离子浓度分别为0.02mg/L、0.04mg/L、0.06mg/L、0.08mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L、0.20mg/L；硝酸根离子浓度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L。

3.仪器和设备

（1）离子色谱仪：配电导检测器及抑制器或紫外检测器，高容量阴离子交换柱，50μL定量环。

（2）食物粉碎机。

（3）超声波清洗器。

（4）分析天平：感量为0.1mg和1mg。

（5）离心机：转速≥10000r/min，配50mL离心管。

（6）0.22μm水性滤膜针头滤器。

（7）净化柱：包括C18柱、Ag柱和Na柱或等效柱。

（8）注射器：1.0mL和2.5mL。

注：所有玻璃器皿使用前均需依次用2mol/L氢氧化钾和水分别浸泡4h，然后，用水冲洗3～5次，晾干备用。

4.分析步骤

（1）试样预处理

将新鲜蔬菜试样用自来水洗净后，用水冲洗，晾干后，取可食部切碎混匀。将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆，备用。如需加水应记录加水量。

（2）提取

称取蔬菜试样5g（精确至0.001g，可适当调整试样的取样量），置于150mL具塞锥形瓶中，加入80mL水，1mL1mol/L氢氧化钾溶液，超声提取30min，每隔5min振摇1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min，取出放置至室温，定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000r/min离心15min，上清液备用。

（3）仪器参考条件

①色谱柱：氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的二乙烯基苯-乙基苯乙烯共聚物基质，烷醇基季铵盐功能团的高容量阴离子交换柱，4mm×250mm（带保护柱4mm×50mm），或性能相当的离子色谱柱。

②淋洗液：氢氧化钾溶液，浓度为6～70mmol/L；洗脱梯度为6mmol/L30min，70mmol/L 5min，6mmol/L 5min；流速为1.0mL/min。

③抑制器：电导检测器，检测池温度为35℃；或紫外检测器，检测波长为226nm；进样体积为50μL（可根据试样中被测离子含量进行调整）。

（4）测定

①标准曲线的制作。将标准系列工作液分别注入离子色谱仪中，得到各浓度标准工作液色谱图，测定相应的峰高或峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

②试样溶液的测定。将空白溶液和试样溶液注入离子色谱仪中，得到空白溶液和试样溶液的峰高或峰面积，根据标准曲线得到待测液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度。

5.结果计算

试样中亚硝酸离子或硝酸根离子的含量按式（4-10）计算：

　　（4-10）

式中　X——试样中亚硝酸根离子或硝酸根离子的含量，mg/kg；

ρ——测定用试样溶液中的亚硝酸根离子或硝酸根离子浓度，mg/L；

ρ0——试剂空白液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度，mg/L；

V——试样溶液体积，mL；

f——试样溶液稀释倍数；

1000——换算系数；

m——试样取样量，g。

试样中测得的亚硝酸根离子含量乘以换算系数1.5，即得亚硝酸盐（按亚硝酸钠计）含量；试样中测得的硝酸根离子含量乘以换算系数1.37，即得硝酸盐（按硝酸钠计）含量。

结果保留2位有效数字。

6.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

7.其他

亚硝酸盐和硝酸盐检出限分别为0.2mg/kg和0.4mg/kg。

（三）分光光度法

1.原理

亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。

试样在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由测得的亚硝酸盐总量减去试样中亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。

2.试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682—2008规定的一级水。

（1）试剂

①亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6·3H2O］。

②乙酸锌［Zn（CH3COO）2·2H2O］。

③冰醋酸（CH3COOH）。

④硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）。

⑤盐酸（HCl，ρ=1.19g/mL）。

⑥氨水（NH3·H2O，25%）。

⑦对氨基苯磺酸（C6H7NO3S）。

⑧盐酸萘乙二胺（C12H14N2·2HCl）。

⑨锌皮或锌棒。

⑩硫酸镉（CdSO4·8H2O）。

硫酸铜（CuSO4·5H2O）。

（2）试剂配制

①亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000mL。

②乙酸锌溶液（220g/L）：称取220.0g乙酸锌，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000mL。

③饱和硼砂溶液（50g/L）：称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用。

④氨缓冲溶液（pH=9.6～9.7）：量取30mL盐酸，加100mL水，混匀后加65mL氨水，再加水稀释至1000mL，混匀，调节pH值至9.6～9.7。

⑤氨缓冲液的稀释液：量取50mLpH=9.6～9.7氨缓冲溶液，加水稀释至500mL，混匀。

⑥盐酸（0.1mol/L）：量取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL。

⑦盐酸（2mol/L）：量取167mL盐酸，用水稀释至1000mL。

⑧盐酸（20%）：量取20mL盐酸，用水稀释至100mL。

⑨对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL 20%盐酸中，混匀，置棕色瓶中，避光保存。

⑩盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中，混匀，置棕色瓶中，避光保存。

硫酸铜溶液（20g/L）：称取20g硫酸铜，加水溶解，并稀释至1000mL。

硫酸镉溶液（40g/L）：称取40g硫酸镉，加水溶解，并稀释至1000mL。

乙酸溶液（3%）：量取冰醋酸3mL于100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。

（3）标准品

①亚硝酸钠（NaNO2，CAS号为7632-00-0）：基准试剂，或采用具有标准物质证书的亚硝酸盐标准溶液。

②硝酸钠（NaNO3，CAS号为7631-99-4）：基准试剂，或采用具有标准物质证书的硝酸盐标准溶液。

（4）标准溶液配制

①亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL，以亚硝酸钠计）：准确称取0.1000g于110～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

②硝酸钠标准溶液（200μg/mL，以硝酸钠计）：准确称取0.1232g于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移入500mL容量瓶中，并稀释至刻度。

③亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）：临用前，吸取2.50mL亚硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

④硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL，以硝酸钠计）：临用前，吸取2.50mL硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

3.仪器和设备

①天平：感量为0.1mg和1mg。

②组织捣碎机。

③超声波清洗器。

④恒温干燥箱。

⑤分光光度计。

⑥镉柱或镀铜镉柱。

a.海绵状镉的制备：镉粒直径0.3～0.8mm。将适量的锌棒放入烧杯中，用40g/L硫酸镉溶液浸没锌棒。在24h之内，不断将锌棒上的海绵状镉轻轻刮下。取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层溶液。用水冲洗海绵状镉2～3 次后，将镉转移至搅拌器中，加400mL盐酸（0.1mol/L），搅拌数秒，以得到所需粒径的镉颗粒。将制得的海绵状镉倒回烧杯中，静置3～4h，期间搅拌数次，以除去气泡。倾去海绵状镉中的溶液，并可按下述方法进行镉粒镀铜。

b.镉粒镀铜：将制得的镉粒置于锥形瓶中（所用镉粒的量以达到要求的镉柱高度为准），加足量的盐酸（2mol/L）浸没镉粒，振荡5min，静置分层，倾去上层溶液，用水多次冲洗镉粒。在镉粒中加入20g/L硫酸铜溶液（每克镉粒约需2.5mL），振荡1min，静置分层，倾去上层溶液后，立即用水冲洗镀铜镉粒（注意镉粒要始终用水浸没），直至冲洗的水中不再有铜沉淀。

c.镉柱的装填：如图4-1所示，用水装满镉柱玻璃柱，并装入约2cm 高的玻璃棉，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下，加入海绵状镉至8～10cm［图4-1（a）］或15～20cm［图4-1（b）］，上面用1cm 高的玻璃棉覆盖。若使用装置B，则上置一储液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。

如无上述镉柱玻璃管时，可以25mL酸式滴定管代用，但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。

当镉柱填装好后，先用25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤，再以水洗2次，每次25mL，镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。

d.镉柱每次使用完毕后，应先以25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤，再以水洗2次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。

e.镉柱还原效率的测定：吸取20mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氨缓冲液的稀释液，混匀后注入储液漏斗，使流经镉柱还原，用一个100mL 的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不应超过6mL/min，在储液杯将要排空时，用约15mL水冲洗杯壁。冲洗水流尽后，再用15mL水重复冲洗，第2次冲洗水也流尽后，将储液杯灌满水，并使其以最大流量流过柱子。当容量瓶中的洗提液接近100mL时，从柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混匀。取10.0mL还原后的溶液（相当10μg亚硝酸钠）于50mL 比色管中，以下按4.（3）自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起操作，根据标准曲线计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于95%为符合要求。

f.还原效率计算按式（4-11）计算：

　　 （4-11）

式中　X——还原效率，%；

m1——测得亚硝酸钠的含量，μg；

10 ——测定用溶液相当亚硝酸钠的含量，μg。

如果还原率小于95%时，将镉柱中的镉粒倒入锥形瓶中，加入足量的盐酸（2moL/L）中，振荡数分钟，再用水反复冲洗。

4.分析步骤

（1）试样的预处理

同紫外分光光度法中分析步骤的试样制备。

（2）提取

称取5g（精确至0.001g）匀浆试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于250mL具塞锥形瓶中，加12.5mL50g/L饱和硼砂溶液，加入70℃左右的水约150mL，混匀，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。定量转移上述提取液至200mL容量瓶中，加入5mL 106g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL 220g/L乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。

（3）亚硝酸盐的测定

吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用1cm 比色杯，以零管调节零点，于波长538nm 处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。

（4）硝酸盐的测定

①镉柱还原：先以25mL氨缓冲液的稀释液冲洗镉柱，流速控制在3～5mL/min（以滴定管代替的可控制在2～3mL/min）；吸取20mL滤液于50mL烧杯中，加5mL pH=9.6～9.7氨缓冲溶液，混合后注入储液漏斗，使流经镉柱还原，当储液杯中的样液流尽后，加15mL水冲洗烧杯，再倒入储液杯中。冲洗水流完后， 再用15mL水重复1次。当第2次冲洗水快流尽时，将储液杯装满水，以最大流速过柱。当容量瓶中的洗提液接近100mL时，取出容量瓶，用水定容刻度，混匀。

②亚硝酸钠总量的测定：吸取10～20mL还原后的样液于50mL比色管中，然后按4（3）自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起操作。

5.结果计算

（1）亚硝酸盐含量的计算

亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量按式（4-12）计算：

　　 （4-12）

式中　X1——试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

m2 ——测定用样液中亚硝酸钠的质量，μg；

1000——转换系数；

m5——试样质量，g；

V1——测定用样液体积，mL；

V0——试样处理液总体积，mL。

结果保留2位有效数字。

（2）硝酸盐含量的计算

硝酸盐（以硝酸钠计）的含量按式（4-13）计算：

　　（4-13）

式中　X2——试样中硝酸钠的含量，mg/kg；

m1——经镉粉还原后测得总亚硝酸钠的质量，μg；

1000——转换系数；

m2——试样的质量，g；

V3——测总亚硝酸钠的测定用样液体积，mL；

V2——试样处理液总体积，mL；

V1——经镉柱还原后样液的测定用体积，mL；

V4 ——经镉柱还原后样液总体积，mL；

X1 ——由式（4-12）计算出的试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg；

1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数。

结果保留2位有效数字。

6.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

六、蔬菜有机磷农药残留量的测定——速测卡法

1.原理

胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断样品中是否有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

2.试剂

①固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡）。

②pH=7.5缓冲溶液：分别取15.0g磷酸氢二钠 ［Na2HPO4·12H2O］与1.59g无水磷酸二氢钾［KH2PO4 ］，用500mL蒸馏水溶解。

3.仪器

①常量天平。

②有条件时配备37℃±2℃恒温装置。

4.分析步骤

（1）整体测定法

①选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上。

②取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。

③将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合反应。

④每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。

（2）表面测定法（粗筛法）

①擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。

②取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。

③放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。

④将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合反应。

⑤每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。

5.结果判定

结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（为阳性）、未抑制（为阴性）表示。

与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。

对阳性结果的样品，可用其他分析方法进一步确定具体农药品种和含量。

6.附则

①灵敏度指标：速测卡对部分常见农药的检出限及我国限量标准见表4-3。

②符合率：在检出的50份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应该在80%以上。

7.说明

葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，减少干扰因素。

七、蔬菜有机磷农药残留的检测——酶抑制法（GB/T 5009.199—2003）

1.原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

2.试剂

①pH=8.0缓冲溶液：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。

②显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，在4℃冰箱中保存。

③底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。

④乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3min的吸光度变化DA0值应控制在0.3以上。摇匀后置于4℃冰箱中保存备用，保存期不超过四天。

⑤可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的DA0值应控制在0.3以上。

3.仪器

①分光光度计或相应测定仪。

②常量天平。

③恒温水浴或恒温箱

4.分析步骤

（1）样品处理

选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min，待用。

（2）对照溶液测试

先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值DA0。

（3）样品溶液测试

先于试管中加入2.5mL样品提取液，其他操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值DAt。

5.结果计算

（1）结果计算

检测结果按公式计算：抑制率=［（DA0-DAt）/DA0］×100%

式中　DA0——对照溶液反应3min吸光度的变化值；

DAt——样品溶液反应3min吸光度的变化值；

（2）结果判定

结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。

对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。

6.附则

①灵敏度指标：酶抑制法对部分农药的检出限见表4-4。

②符合率：在检出的抑制率≥50%的30份以上样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应该在80%以上。

7.说明

①葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，减少色素的干扰。

②当温度条件低于37℃，酶反应的速率随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相应延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试，3min吸光度变化差值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照测试3min吸光度变化差值在0.3以下的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。

八、蔬菜有机磷类、拟除虫菊酯类和有机氯类农药残留量的测定——气相色谱检测法

（一）蔬菜中有机磷类农药多残留的测定

1.原理

试样中有机磷类农药经乙腈提取，提取溶液经过滤、浓缩后，用丙酮定容，用双自动进样器同时注入气相色谱仪的两个进样口，农药组分经不同极性的两根毛细管柱分离，火焰光度检测器（FPD 磷滤光片）检测，用双柱的保留时间定性，外标法定量。

2.试剂与材料

除非另有说明，在分析中仅使用的是分析纯的试剂和GB/T 6682中规定的至少二级的水。

①乙腈。

②丙酮，重蒸。

③氯化钠，140℃烘烤4h。

④滤膜，0.2μm，溶剂膜。

⑤铝箔。

⑥农药标准品，见表4-5。

⑦农药标准溶液配制。

a.单一农药标准溶液。准确称取一定量（精确至0.1mg）某农药标准品，用丙酮做溶剂，逐一配制成1000mg/L 的单一农药标准储备液，储存在-18℃以下冰箱中。使用时根据各农药在对应检测器上的响应值，准确吸取适量的标准储备液，用丙酮稀释配制成所需的标准工作液。

b.农药混合标准溶液。将54种农药分为4组，按照表4-5中组别，根据各农药在仪器上的响应值，逐一准确吸取一定体积的同组别的单个农药储备液，分别注入同一容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，采用同样方法配制成4 组农药混合标准储备溶液。使用前用丙酮稀释成所需质量浓度的标准工作液。

3.仪器设备

①气相色谱仪，带有双火焰光度检测器（FPD 磷滤光片），双自动进样器，双分流/不分流进样口。

②分析实验室常用仪器设备。

③食品加工器。

④旋涡混合器。

⑤匀浆机。

⑥氮吹仪。

4.分析步骤

（1）试样制备

按GB/T 8855—2008 抽取蔬菜、水果样品，取可食部分，经缩分后，将其切碎，充分混匀放入食品加工器中粉碎，制成待测样，放入分装容器中于-20～-16℃条件下保存，备用。

（2）提取

准确称取25.0g试样放入匀浆机中，加入50.0mL乙腈，在匀浆机中高速匀浆2min后用滤纸过滤，滤液收集到装有5～7g氯化钠的100mL具塞量筒中，收集滤液40～50mL，盖上塞子，剧烈振荡1min，在室温下静置30min，使乙腈相和水相分层。

（3）净化

从具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放入150mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，杯内缓缓通入氮气或空气流，蒸发近干，加入2.0mL丙酮，盖上铝箔，备用。将上述备用液完全转移至15mL刻度离心管中，再用约3mL丙酮分三次冲洗烧杯，并转移至离心管，最后定容至5.0mL，在旋涡混合器上混匀，分别移入两个2mL自动进样器样品瓶中，供色谱测定。如定容后的样品溶液过于混浊，应用0.2μm滤膜过滤后再进行测定。

（4）测定

①色谱参考条件

a.色谱柱。预柱，1.0m，0.53mm内径，脱活石英毛细管柱。两根色谱柱，分别为：

ⅰ.A柱：50%聚苯基甲基硅氧烷（DB-17或HP-50+）1柱，30m×0.53mm×1.0μm，或相当者；

ⅱ.B柱：100%聚甲基硅氧烷（DB-1或HP-1）1柱，30m×0.53mm×1.50μm，或相当者。

b.温度。进样口温度220℃。检测器温度，250℃。柱温，150℃保持2min，以8℃/min升温至250℃保持12min。

c.气体及流量。载气：氮气，纯度≥99.999%，流速为10mL/min。燃气：氢气，纯度≥99.999%，流速为75mL/min。助燃气：空气，流速为100mL/min。

d.进样方式。不分流进样。样品溶液一式两份，由双自动进样器同时进样。

②色谱分析。由自动进样器分别吸取1.0μL标准混合溶液和净化后的样品溶液注入色谱仪中，以双柱保留时间定性，以A柱获得的样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。

5.结果表述

（1）定性分析

双柱测得样品溶液中未知组分的保留时间（RT）分别与标准溶液在同一色谱柱上的保留时间（RT）相比较，如果样品溶液中某组分的两组保留时间与标准溶液中某一农药的两组保留时间相差都在±0.05min内的可认定为该农药。

（2）结果计算

试样中被测农药残留量以质量分数w计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（4-14）计算。

　　（4-14）

式中　ρ——标准溶液中农药的质量浓度，mg/L；

A——样品溶液中被测农药的峰面积；

AS——农药标准溶液中被测农药的峰面积；

V1——提取溶剂总体积，mL；

V2——吸取出用于检测的提取溶液的体积，mL；

V3——样品溶液定容体积，mL；

m——试样的质量，g。

计算结果保留两位有效数字，当结果大于1mg/kg时保留三位有效数字。

6.精密度

本标准精密度数据是按照GB/T 6379.2—2004规定确定的，获得重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。

7.色谱图

有机磷农药标准溶液的色谱图见图4-2。

（二）蔬菜中有机氯类、拟除虫菊酯类农药多残留的测定

1.原理

试样中有机氯类、拟除虫菊酯类农药用乙腈提取，提取液经过滤、浓缩后，采用固相萃取柱分离、净化，淋洗液经浓缩后，用双塔自动进样器同时将样品溶液注入气相色谱仪的两个进样口，农药组分经不同极性的两根毛细管柱分离，电子捕获检测器（ECD）检测，双柱保留时间定性，外标法定量。

2.试剂与材料

除非另有说明，在分析中仅使用的是分析纯的试剂和GB/T 6682中规定的至少二级的水。

①乙腈。

②丙酮，重蒸。

③己烷，重蒸。

④氯化钠，140℃烘烤4h。

⑤固相萃取柱，弗罗里硅柱（FlorisilPR），容积6mL，填充物1000mg。

⑥铝箔。

⑦农药标准品，见表4-6。

⑧农药标准溶液配制。

a.单个农药标准溶液。准确称取一定量（精确至0.1mg）农药标准品，用正己烷稀释，逐一配制成1000mg/L单一农药标准储备液，储存在-18℃以下冰箱中。使用时根据各农药在对应检测器上的响应值，准确吸取适量的标准储备液，用正己烷稀释配制成所需的标准工作液。

b.农药混合标准溶液。将41种农药分为3组，按照表4-6中组别，根据各农药在仪器上的响应值，逐一吸取一定体积的同组别的单个农药储备液，分别注入同一容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，采用同样方法配制成3组农药混合标准储备溶液。使用前用正己烷稀释成所需质量浓度的标准工作液。

3.仪器设备

①气相色谱仪，配有双电子捕获检测器（ECD），双塔自动进样器，双分流/不分流进样口。

②分析实验室常用仪器设备。

③食品加工器。

④旋涡混合器。

⑤匀浆机。

⑥氮吹仪。

4.测定步骤

（1）试样制备

同蔬菜中有机磷类农药多残留测定中的试样制备部分。

（2）提取

同蔬菜中有机磷类农药多残留测定中的提取部分。

（3）净化

从100mL具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放入150mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，杯内缓缓通入氮气或空气流，蒸发近干，加入2.0mL正己烷，盖上铝箔，待净化。将弗罗里硅柱依次用5.0mL丙酮+正己烷（10+90）、5.0mL正己烷预淋洗，条件化，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用15mL刻度离心管接收洗脱液，用5mL丙酮+正己烷（10+90）冲洗烧杯后淋洗弗罗里硅柱，并重复一次。将盛有淋洗液的离心管置于氮吹仪上，在水浴温度50℃条件下，氮吹蒸发至小于5mL，用正己烷定容至5.0mL，在旋涡混合器上混匀，分别移入两个2mL自动进样器样品瓶中，待测。

（4）测定

①色谱参考条件

a.色谱柱。预柱，1.0m，0.25mm内径，脱活石英毛细管柱。分析柱采用两根色谱柱，分别为：

ⅰ.A柱：100%聚甲基硅氧烷（DB-1或HP-1）1柱，30m×0.25mm×0.25μm，或相当者；

ⅱ.B柱：50%聚苯基甲基硅氧烷（DB-17或HP-50+）1柱，30m×0.25mm×0.25μm，或相当者。

b.温度。进样口温度，200℃。检测器温度，320℃。

柱温，150℃保持2min，以6℃/min升温至270℃保持8min（测定溴氰菊酯保持23min）。

c.气体及流量。载气：氮气，纯度≥99.999%，流速为1mL/min。辅助气：氮气，纯度≥99.999%，流速为60mL/min。

d.进样方式。分流进样，分流比为10∶1。样品溶液一式两份，由双塔自动进样器同时进样。

②色谱分析。由自动进样器分别吸取1.0μL标准混合溶液和净化后的样品溶液注入色谱仪中，以双柱保留时间定性，以A柱获得的样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。

5.结果计算

（1）定性分析

双柱测得的样品溶液中未知组分的保留时间（RT）分别与标准溶液在同一色谱柱上的保留时间（RT）相比较，如果样品溶液中某组分的两组保留时间与标准溶液中某一农药的两组保留时间相差都在±0.05min内的可认定为该农药。

（2）定量结果计算

试样中被测农药残留量以质量分数w计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（4-15）计算。

　　（4-15）

式中　ρ——标准溶液中农药的质量浓度，mg/L；

A——样品溶液中被测农药的峰面积；

AS——农药标准溶液中被测农药的峰面积；

V1——提取溶剂总体积，mL；

V2——吸取出用于检测的提取溶液的体积，mL；

V3——样品溶液定容体积，mL；

m——试样的质量，g。

计算结果保留两位有效数字，当结果大于1mg/kg时保留三位有效数字。

6.精密度

本标准精密度数据是按照GB/T 6379.2的规定确定的，获得重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。

7.色谱图

有机氯标准溶液的色谱图见图4-3。

1—α-666；2—西玛津；3—莠去津；4—δ-666；5—七氯；6—艾氏剂；7—o，p'-DDE；8—p，p'-DDE；9—o，p'-DDD；10—p，p'-DDT；11—异菌脲；12—联苯菊酯；13—顺式氯菊酯；14—氟氯氰菊酯；15—氟胺氰菊酯；16—β-666；17—林丹；18—五氯硝基苯；19—敌稗；20—乙烯菌核利；21—硫丹；22—p，p'-DDD；23—三氯杀螨醇；24—高效氯氟氰菊酯；25—氯菊酯；26—氟氰戊菊酯；27—氯硝胺；28—六氯苯；29—百菌清；30—三唑酮；31—腐霉利；32—丁草胺；33—狄氏剂；34—异狄氏剂；35—乙酯杀螨醇；36—o，p'-DDT；37—胺菊酯；38—甲氰菊酯；39—氯氰菊酯；40—氰戊菊酯；41—溴氰菊酯

九、蔬菜中33种农药残留量的测定——液相色谱-串联质谱法

1.适用范围

本方法适用于水果和蔬菜中灭多威、多菌灵、嘧霉胺、甲萘威、克百威、啶虫脒、灭线磷、地虫硫磷、吡虫啉、敌百虫、辛硫磷、磷胺、杀扑磷、苯线磷、除虫脲、氯唑磷、稻丰散、治螟磷、蝇毒磷、哒螨灵、伏杀硫磷、咪鲜胺、烯酰吗啉、嘧菌酯、苯醚甲环唑、甲氨基阿维菌素苯甲维盐、乙草胺、烯啶虫胺、丙草胺、茚虫威、氟虫脲、茚虫威和亚胺硫磷等农药残留的检测。

2.原理

试样用乙腈匀浆提取，盐析离心，Spe-Pak vac柱净化，用乙腈+甲苯（3+1）洗脱农药及相关化学品，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。

3.试剂和材料

水为GB/T 6682—2008规定的一级水。

①乙腈：色谱纯。

②正己烷：色谱纯。

③异辛烷：色谱纯。

④甲苯：优级纯。

⑤丙酮：色谱纯。

⑥二氯甲烷：色谱纯。

⑦甲醇：色谱纯。

⑧微孔过滤膜（尼龙）：13mm×0.2μm。

⑨Sep-Pak vac氨基固相萃取柱：1g，6mL，或相当者。

⑩乙腈+甲苯（3+1，体积比）。

乙腈+水（3+2，体积比）。

0.05%甲酸溶液（体积分数）。

5mmol/L乙酸铵溶液：称取0.375g乙酸铵加水稀释至1000mL。

无水硫酸钠：分析纯，用前在650℃灼烧4h，储于干燥器中，冷却后备用。

氯化钠：优级纯。

农药及相关化学品标准物质：纯度≥95%。

农药及相关化学品标准溶液。

a.标准储备溶液。分别称取5～10mg（精确至0.1mg）农药及相关化学品标准物于10mL容量瓶中，根据标准物的溶解度选甲醇、甲苯、丙酮、乙腈或异辛烷等溶剂溶解并定容至刻度。标准储备溶液避光在0～4℃保存，可使用一年。

b.混合标准溶液。根据每种农药及相关化学品在仪器上的响应灵敏度，确定其在混合标准溶液中的浓度。

移取一定量的单个农药及相关化学品标准储备溶液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。混合标准溶液避光在0～4℃保存，可使用一个月。

c.基质混合标准工作溶液。农药及相关化学品基质混合标准工作溶液是用空白样品基质溶液配成不同浓度的基质混合标准工作溶液，用于做标准工作曲线。

基质混合标准工作溶液应现用现配。

4.仪器

①液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESD）。

②分析天平：感量为0.1mg和0.01g。

③高速组织捣碎机：转速不低于20000r/min。

④离心管：80mL。

⑤离心机：最大转速为4200r/min。

⑥旋转蒸发仪。

⑦鸡心瓶：200mL。

⑧移液管：1mL。

⑨样品瓶：2mL，带聚四氟乙烯旋盖。

⑩氮气吹干仪。

5.试样制备与保存

（1）试样的制备

按GB/T 8855—2008抽取的水果、蔬菜样品取可食部分切碎，混匀，密封，作为试样，标明标记。

（2）试样的保存

将试样置于0～4℃冷藏保存。

6.测定步骤

（1）提取

称取20g试样（精确至0.01g）于80mL离心管中，加入40mL乙腈，用高速组织捣碎机在15000r/min，匀浆提取1min，加入5g氯化钠，再匀将提取1min，在3800r/min离心5min，取上清液20mL（相当于10g试样量），在40℃水浴中旋转浓缩至约1mL，待净化。

（2）净化

在Sep-Pak vac柱中加入约2cm高无水硫酸钠，并放入下接鸡心瓶的固定架上。加样前先用4mL乙腈+甲苯（3+1）预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至净化柱上，并更新鸡心瓶接收。再每次用2mL乙腈+甲苯（3+1）洗涤样液瓶三次，并将洗涤液移入柱中。在柱上加上50mL储液器，用25mL乙腈+甲苯（3+1）洗脱农药及相关化学品，合并于鸡心瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至约0.5mL。将浓缩液置于氮气吹干仪上吹干，迅速加入1mL的乙腈+水（3+2），混匀，经0.2μm滤膜过滤后进行液相色谱-串联质谱测定。

（3）液相色谱-串联质谱测定

①液相色谱-串联质谱测定条件

a色谱柱：超纯硅胶基质反相C18色谱柱（atlantis T3），3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者。

b.流动相及梯度洗脱条件见表4-17。

c.柱温：40℃。

d.进样量：20μL。

e.离子源：ESI。

f.扫描方式：正离子扫描。

g.检测方式：多反应监测。

h.电喷雾电压：5000V。

i.雾化气压力：0.483MPa。

j.气帘气压力：0.138MPa。

k.辅助加热气压力：0.379MPa。

l.离子源温度：725℃。

②定性测定。在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（相对丰度＞50%，允许±20%偏差；相对丰度＞20%～50%，允许±25%偏差；相对丰度＞10%～20%，允许±30%偏差；相对丰度≤10%，允许±50%偏差），则可判断样品中存在这种农药或相关化学品。

③定量测定。本标准中液相色谱-串联质谱采用外标-校准曲线法定量测定。为减少基质对定量测定的影响，定量用标准溶液应采用基质混合标准工作溶液绘制标准曲线，并且保证所测样品中农药及相关化学品的响应值均在仪器的线性范围内。

（4）平行试验

按以上步骤对同一试样进行平行试验。

（5）空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤进行。

7.结果计算

液相色谱-串联质谱测定采用标准曲线定量，标准曲线法定量结果按式（4-16）计算：

　　（4-16）

式中　X——试样中被测组分含量，mg/kg；

ci——从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，μg/mL；

V——试样溶液定容体积，mL；

m——样品溶液所代表试样的质量，g。

计算结果应扣除空白值。

8.精密度

本标准精密度数据是按照GB/T 6379.1—2004和GB/T 6379.2—2004的规定确定的，获得重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。