第一节　原料的选择、处理及有效成分的提取

供生产生化药物的生物资源主要有动物、植物、微生物的组织、器官、细胞及代谢产物。利用发酵工程和细胞工程分别对微生物和动植物细胞进行大规模培养是获得生化制药原料的重要途径。基因工程、酶工程和蛋白质工程等的应用更是对生化制药新资源的开发起到了不可估量的作用。生化药物的提取与分离方法因原材料、药物的种类和性质不同而存在很大差异。总的来说，其提取纯化一般分为5个步骤：预处理、固液分离、提取、精制和成品加工（包括干燥、制丸、挤压、造粒、制片等步骤），如图1-1所示。

生化药物提取的每一步都可采用多种单元操作。一般情况下，原材料中产品浓度越低，其提取纯化的成本越高，操作步骤越多，提取收得率也越低，因此，在提纯过程当中，要尽量选用产品含量较高的原材料，并尽可能减少操作步骤。

一、原料选取与保存

生化药物生产原料的选择原则主要是：有效成分含量高，原料新鲜；原料来源丰富，易得，原料成本低；原料中杂质含量较少等。这就涉及生物品种、组织器官的类型及生物的生长期等因素的影响。如制备催乳素，不能选用禽类、鱼类，应以哺乳动物为原材料；制备胃蛋白酶只能选用胃为材料；制备凝乳酶只能以哺乳期小牛、仔羊的第四胃为材料，而不能用成年牛、羊的胃。而难分离的杂质会增加工艺的复杂性、影响收率、质量和经济效益，所以应避免与产品性质相似的杂质对提纯过程的干扰。如制备磷酸单酯酶时，以前列腺为材料可使操作简化，而不宜以胰脏为材料。因胰脏中除了磷酸单酯酶外，还含有与其性质相近的磷酸二酯酶，两者难于分开。此外，在选择生物材料时，最好能一物多用，综合利用。如以胰脏为材料可同时进行弹性蛋白酶、激肽释放酶、胰岛素与胰酶等的生产。

植物原料确定后，要选择合适的季节、时间、地点后采集并就地去除不用的部分，将有用部分保鲜处理；动物材料采集后要及时去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；对于微生物原料，要将菌体细胞与培养液及时分开后进行保鲜处理。

保存生物材料的主要方法有冷冻法，常用-40℃速冻，此法适用于所有生物原料；有机溶剂脱水法，常用有机溶剂丙酮制成“丙酮粉”，此法适用于原料少而价值高、有机溶剂对产品没有破坏的原料，如脑垂体等；防腐剂保鲜法，如对于发酵液、提取液等液体原料，加入乙醇、苯酚等对其进行保存。

二、生化药物提取

1.物质性质与提取

提取是利用目的物的溶解特性，将其于细胞的固形成分或其他结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。如果是将目的物从某一溶剂系统转入另一溶剂系统则称为萃取，即液-液提取。如用溶剂从固体中抽提物质叫做液-固提取，也叫浸取。据所用溶剂温度的不同，浸取可分为浸渍（用冷溶剂溶出固体材料中的物质）和浸煮（用热溶剂溶出目的物）。

许多生化药物具有生物活性、其稳定性受pH、温度、离子强度、金属离子、提取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响。生物药物对剪切力很敏感，分子量越大，其稳定性就越差，在分离纯化过程中，条件就应当越温和。一些组分的浓度非常低，在待处理物料中的含量往往低于杂质含量，如胰岛素在胰脏中的含量约为万分之二，而胆汁中的胆红素含量也仅有万分之五到八。生物材料中组成庞大的生化杂质与目的物的理化性质如溶解度、相对分子质量、等电点等都十分接近，所以分离、纯化比较困难，尤其是提纯过程中有效成分的生理活性处于不断变化中，其可被生物材料自身的酶系所分解破坏，或为微生物活动所分解，也可能在制备过程中受到酸、碱、重金属离子、机械搅拌、温度、甚至空气和光线的作用而改变其生理活性，所有这些都对生化药物的提取分离方法提出了很高的要求。

2.提取的溶剂系统

提取时，首先要根据活性物质的性质，选择提取溶剂。

（1）对水溶性、盐溶性生物物质的提取　可以用酸、碱、盐水溶液为提取溶剂，这类溶剂提供了一定的离子强度、pH范围及相当的缓冲能力，如植酸钙镁是用稀硝酸溶液提取，肝素是用氯化钠溶液提取。

（2）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取　有时可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有机溶剂作为提取溶剂时，根据产物存在的状态可分为液-液提取和固-液提取。

① 液-液提取也即萃取，是利用溶质在互不相溶的两相中分配系数的不同而进行提取分离的方法。在一定温度和压力下，溶质分配在两个不相溶的溶剂中达到平衡后，溶质在这两相的浓度比为一常数K，此常数称为分配系数。操作过程中，分配系数K越大，提取效率也越大，萃取就越容易进行完全。当K值较小时，可以采取分次加入溶剂、连续对此提取来提高萃取率。

萃取剂的选择依据主要是对所要萃取的组分有较大的溶解度和良好的选择性。根据相似相溶的原理，应选择与目的物结构相近的溶剂。在工业上还要考虑价格低廉、挥发性小、毒性小、来源广等特点，以及萃取剂对产品的选择性能、与原溶剂不相溶、两相有较大密度差、萃取剂易于回收等。不同的萃取剂对溶质的萃取效果不同。如疏水性的青霉素G和青霉素V酸性很强，其pKa值为2.5～3.1，相对分子质量分别为334和350，适宜用有机溶剂从发酵液中萃取，在pH2.5～3.0范围内，用乙酸戊酯和乙酸丁酯作为萃取剂的萃取效率高（见表1-1）。

工业生产中，常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。通常情况下，萃取操作多用于抗生素、核苷酸等小分子药物的提取。

② 固-液提取也称为浸取，在许多行业有着广泛的应用，在生物工业、制药工业也常用到浸取操作，所使用的浸取溶剂是多种多样的，如表1-2所示。

为了高效、快速地从固体中将目的物浸取出来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合适的溶剂是很重要的，溶剂选择的主要依据是“相似相溶”原理，这与溶剂萃取有相通之处。

浸取较常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂和乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂，如用醇醚混合物提取辅酶Q10，用氯仿提取胆红素等。在提取制备过程中，药物产品中有时也会残留微量有机溶剂，如青霉素等抗生素产品，但因药物的治疗效果远比微量残留溶剂可能引起的副作用显著得多，所以可供挑选的溶剂范围较宽。

生物材料是由细胞组成的，可溶性物质通常在细胞内，为加速浸取的过程，往往要对原料进行预处理，恰当地粉碎原料，以缩短固体或细胞内部溶质分子向其表面的扩散距离。同时，在浸取之前应先将植物的叶、茎、化和根等物料干燥，使细胞膜破裂，从而使药品成分更易浸取出来。

无论用哪种溶剂系统对目的物进行提取，在提取过程中都要尽量增加目的物的溶出度，并尽可能减少杂质的溶出度，同时充分重视目的物在提取过程中的活性变化。如对蛋白质类药物要避免高温、强烈搅拌、大量泡沫、强酸、强碱及重金属离子等的作用使其变性失活，并且采用一定的措施保持它们的生物活性，如用合适的缓冲系统、添加保护剂及抑制某些水解酶的作用等；对酶类药物的提取要防止辅酶的丢失和温度、pH等其他失活因素的干扰；多肽类及核酸类药物需注意避免酶的降解作用，提取过程中，应在低温下操作，并添加合适的酶抑制剂；对脂类药物应通过添加抗氧剂、通氮气及避光等措施减少与空气的接触，防止其氧化作用。除此之外，还要考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间，并注意提取的温度、pH、变性剂等因素的影响。只有这样，才能保证活性物质提取充分且不变性。

三、细胞破碎

一些微生物在代谢中将产物分泌到细胞之外的液相中，如胞外酶（细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等），提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得澄清的滤液再进一步纯化即可。但是，还有很多生化物质位于细胞内部，如胞内酶（青霉素酰化酶、碱性磷酸酶等）都位于细胞内部，必须在纯化前先将细胞破碎，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯。

细胞破碎的目的是破坏细胞外围，使胞内物质释放出来，其方法很多，按是否使用外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。机械法包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X-press法等。其中的高压匀浆法是当前较为理想的大规模破碎细胞的常用方法，所用设备是高压匀浆器，由高压泵和匀浆阀组成。其可破碎酵母菌、大肠杆菌、假单胞菌、黑曲霉菌等。操作时，将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，从而造成细胞的破碎。操作中，影响细胞破碎的主要因素是压力、温度和悬浮液通过匀浆器的次数。在工业生产中，通常采用的压力是55～70MPa；要达到90%以上的破碎率，菌悬液一般要通过匀浆器至少两次。在机械破碎过程中，由于消耗的机械能转化为热量会使温度上升，易造成生物产品受热破坏，所以在大多数情况下要采用冷却措施。非机械法有酶溶法、化学渗透法、反复冻融法、干燥法等，其中化学渗透法和酶溶法应用最广泛。采用化学法时，所选择的溶剂（酸、碱、有机溶剂等）对预提取的生化物质不能有损害作用，且操作后要从产品中除去这些试剂，以保证产品的纯净。采用酶溶法时，要选择好特定的酶和适宜的操作条件；由于溶菌酶价格较高，一般仅适用于小规模应用；自溶法价格低，在一定程度上能用于工业规模，但对不稳定的微生物易引起所需物质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。总之，每种方法的应用都有一定的局限性，目前人们仍在探寻新的细胞破碎方法，如激光破碎法、高速相向流撞击法等，细胞破碎的方法有待不断深入和完善。

四、固液分离

固液分离是药物生产中经常遇到的重要单元操作，提取液、发酵液、细胞破碎后所得的菌悬液及某些中间产品和半成品等都需进行固液分离。固液分离的方法很多，有重力沉降、离心分离和过滤等。在生化药物的提纯过程中，用的较普遍的是离心和过滤。

离心分离是利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液分离或浓缩。离心技术在生物制药行业中应用较广泛，如从培养液中分离收集细胞、去除细胞碎片、收集沉淀物等。与其他固液分离法比较，离心分离具有分离速度快、分离效率高、液相澄清度好等优点。同时，设备投资高、能耗大、连续排料时固相干度不如过滤设备也是其不可避免的缺点。

经过滤和离心处理后，目的产物存在于滤液或离心上清液中，液体的体积很大，浓度很低，可用吸附法、沉淀法、离子交换法、萃取法、超滤法等对其进行提取，目的主要是对所处理溶液进行浓缩，同时，也起到了一定的纯化作用。

经提取过程初步纯化后，液体的体积大大减少，但杂质仍然较多，需要进一步精制。初步纯化中的某些操作，如沉淀、超滤等也可应用于精制。蛋白质、酶等大分子物质精制常用色谱或电泳分离，小分子物质的精制则可利用结晶操作。

精制后的目的产物根据其应用要求，有时还需要浓缩、无菌过滤和去热原、干燥等步骤。对于此中涉及的分离技术将在后面内容中逐一介绍。