3.2 结果

建立在优化ISSR扩增体系的基础上，选取100条ISSR引物进行初筛和复筛，最终筛选出12条多态性较好的引物，用于扩增反应。引物由上海生物工程公司合成，引物的碱基序列见表3-2。

表3-2 用于ISSR扩增的引物及引物扩增的条带数

1. ISSR-PCR（内部简单重复序列间扩增）反应体系成分组成：DNA模板2μL; MgCl2 1.2μL; dNTPs 2μL；引物0.6μL; Ta q聚合酶0.2μL; PCR 10×缓冲液2μL；加入ddH2O 12μL; PCR反应的总体积为20μL。

2. PCR热循环仪L9600。

3．热循环仪的温度：起始变性步骤的温度为94℃，维持时间为5min；循环变性步骤的温度为94℃，维持时间为60s；循环退火步骤的温度为54℃，维持时间为45s；退火与延伸步骤之间的变温速率为1℃/s；循环延伸步骤的温度为72℃，维持时间为2min；循环周期总数为45个循环；最后延伸步骤的温度为72℃，维持时间为7min。

4. ISSR-PCR片段的分析：琼脂糖凝胶电泳；电泳缓冲液为0.5×TBE（三羟甲基氨基甲烷+硼酸+乙二胺四乙酸）；所用胶浓度为1.5%；电泳条件为电流50mA、电压130V、泳动时间3h；染料为溴化乙啶（EB），终浓度0.5μg/mL; DNA标记物为100bp DNA plus ladder（MBI公司）[1]。

对100条ISSR引物进行多态性筛选，从中选出扩增效果好、条带清晰、多态性及重复性好的12条引物，对19个竹种的DNA样品进行PCR扩增，扩增结果如图3-1所示。根据表3-2,12条引物共扩增出188个位点，平均每个引物扩增出15.7个，扩增片段多集中在300～5000bp。这说明19个竹种扩增位点较为丰富，多态性显著，具有丰富的遗传多样性，种间差异比较明显，表明ISSR标记能够有效地揭示材料间的多态性。

图3-1 ISSR-02引物对19个竹种ISSR扩增的电泳结果