第七节　肝豆状核变性与铜蓝蛋白

1948年，Holmberg在血清中发现了一种呈天蓝色并携带大部分血清铜的蛋白质，因此命名为铜蓝蛋白（caeruloplasmin or ceruloplasmin，CP）。CP（EC 1.16.3.1）存在于所有脊椎动物血清中，为一种携带了95%以上血清铜的α2-糖蛋白唾液酸酶，主要在肝脏中合成。CP是一种急性时相反应蛋白，当生物体发生感染、炎症或损伤时，诱发了肝脏内CP的大量表达致使血清CP浓度升高。细胞内铜的浓度并不影响前铜蓝蛋白（Apo-CP）的合成和分泌，但是在CP合成过程中，铜的缺失可引起肝脏合成的Apo-CP以一种不稳定的缺乏酶活性的前蛋白（apoprotein）的形式进入血液并很快被代谢。

CP是一种具有氧化酶活性的α2-球蛋白，其参与铁代谢、氧化应激反应和组织血管生成等生理过程，对机体组织器官维持正常的生理功能不可或缺。由于人体血浆中90%以上的铜以与CP结合的形式存在，CP也是体内重要的铜代谢相关蛋白。20世纪50年代，Scheinberg和Bearn等分别发现WD患者存在CP合成障碍，血清CP水平明显低于正常。由于血清CP水平减低可见于95%以上的WD患者，是WD的特征性生化改变，也是主要的诊断指标之一。

一、铜蓝蛋白的结构与生化特性

人CP基因定位于3q25，全长约50kb，由19个外显子和18个内含子组成，其cDNA编码一种由1046个氨基酸组成的分子量约132kD的α2-球蛋白（图3-15、图3-16）。与内含子相比，外显子的长度要短很多，大概在107～267bp的范围内，而内含子一般都>400bp，最长可达10kb。基因的启动子和终止子分别位于第1和第19外显子。外显子与内含子之间的连接序列在24～220bp的范围，这些序列与5′端、3′端共有序列一致，用于连接转录后的基因片段。

在1972年，Ryden等经过研究，得出铜蓝蛋白为单亚基蛋白的结论，但仍有不少报道认为铜蓝蛋白为多亚基蛋白。后来，Kingston的研究得到了与Ryden相同的结果，并且指出铜蓝蛋白易被蛋白酶水解从而断裂为3段，这3段的分子量分别为67kD（480个氨基酸残基）、50kD（405个氨基酸残基）和19kD（159个氨基酸残基），而这些断裂后的肽段就容易被误认为亚基。1983年，Takahashi等人不仅测出了铜蓝蛋白的氨基酸序列，并且进一步阐明了其高级结构。3条肽段的排列顺序为：67kD为氨基末端，50kD为中间部分，19kD为羧基末端，在3条肽段之间起连接作用的氨基酸分别为精氨酸和赖氨酸。在整条肽链上，还有4条葡萄糖胺寡糖链。存在于铜蓝蛋白上的6～7个铜离子大致分为3种类型。第一种类型的铜离子有3个，位于3段主要片段的C端。这类铜离子由于与半胱氨酸的巯基相互作用呈现蓝色，在610nm处有最大吸收，这就是铜蓝蛋白的特征吸收峰为610nm的原因。第二种类型的铜离子有1或2个，其数量是变化的，与3个组氨酸残基相互作用。第三种类型的铜离子有2个，组成了一个双核体，在330nm处有最大吸收峰。其中每个铜离子又与3个组氨酸以静电原子桥的形式相互作用。

大量研究表明，CP的表达主要集中于肝脏，然后经血液运输至其他器官。近来研究显示，除了肝脏，CP在子宫上皮细胞、淋巴细胞、纤维细胞、乳腺细胞以及癌细胞中均有表达。尽管在这些细胞中CP的表达量不及肝脏细胞，但是经过诱导以后表达量可以成倍增长，甚至有些在正常情况下不表达CP的细胞在诱导以后也能表达。如Thomas等发现小鼠子宫上皮细胞在正常情况下会表达少量CP，但在发情周期的CP mRNA的水平陡然上升，达到最大值。在小鼠怀孕或切除子宫后，CP的表达水平也随之变化，说明CP的表达水平与动物的繁殖行为有密切关系。Kunapu等研究了CP在癌细胞中的表达情况，发现结肠癌与胸腺癌细胞的CP表达量是正常肝细胞前者3倍多。这些研究结果显示CP的表达与动物体生理状况密切相关。

二、铜蓝蛋白的生理功能

1.CP与发育

Korzh等克隆表达了斑马鱼CP基因，研究了CP在斑马鱼肝脏形成过程中发挥的作用。他们的研究发现，CP基因的表达在原肠胚形成后以及卵黄囊中早期肝细胞中就开始了，并且在CP基因未能表达时，斑马鱼肝脏的形成也受到了影响。因此，CP是肝脏形成过程中的重要指标之一。

除了与肝脏的发育生成有关之外，CP还参与了神经系统的发育生成。由于CP可以调节神经细胞K+通道以及细胞中的一些铁铜依赖性酶的活性，因此Maltais等推测CP可能在神经系统的生成发育过程中起着重要作用。于是，他们以P19小鼠胚胎癌细胞（是一种神经细胞分化模型）为实验材料，将CP加入到新分化的P19神经细胞的培养液中，24小时后这些神经细胞便开始聚集，并且这种聚集的程度与CP的浓度呈正相关，而CP的这种聚集作用对于老化的神经细胞似乎不起什么作用。他们的试验证明，CP可能参与了神经系统的生成。Wang等利用膜片钳技术也证明了CP可以诱导神经细胞的细胞膜产生一次快速而持久的极化作用，并且这种极化作用随着CP的失活而消失。

2.CP与铁代谢

CP在动物体铁代谢与平衡的过程中起着非常重要的作用，假如CP基因缺失或者突变将会导致严重的后果，比如WD、无铜蓝蛋白血症等。Mzhel’skaya利用基因突变技术研究了CP在调节铜铁代谢方面所起的作用。编码CP的基因产生突变以后，CP不能正常表达，于是铁离子代谢受到了干扰，在多个器官都存在铁离子沉积的现象，尤其是在中枢神经系统的神经细胞严重受损。Harris等将CP基因剔除建立了一个无CP的小鼠模型，这些小鼠模型出生时与正常小鼠无任何区别，但随着年龄的增长，小鼠模型体现出一种进程性的铁离子积累。一年以后，模型小鼠的血浆铁蛋白水平比正常小鼠的有了显著的提高，并且在这些小鼠的肝脏和胰脏中铁离子含量为正常小鼠的5～6倍。对肝脏和胰脏的组织学分析发现，在这些组织的网状内皮细胞和肝细胞中，有大量的铁离子沉积。模型小鼠可以正常吸收铁离子，但是铁离子从网状内皮细胞和肝细胞向外转运却受到严重影响。通过以上两个试验可以证明，CP在铁离子代谢及转运方面起着举足轻重的作用。

3.CP的抗氧化作用

众所周知，机体会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）等自由基，这些自由基具有极强的氧化性，如不及时清除就会损害机体。研究表明，CP具有SOD活性，而SOD是最常见的自由基清除剂，因此CP具有清除自由基、抗氧化作用。

Goldstein等发现CP可以抑制亚铁细胞色素C和氮蓝四唑的还原，并且这种抑制能力与CP的浓度呈正相关。Chauhan等发现CP可以防止血浆脂质发生过氧化反应。脂质过氧化反应与动脉粥样硬化、小儿孤独症等有关。研究发现，在这些病症患者的血液中CP含量显著低于正常人，因此，提高这些患者血液中的CP含量也许是治疗或防止这些疾病的方法。

三、铜蓝蛋白与肝豆状核变性的发病机制

由于大多数WD患者血清CP水平明显减低，曾有人提出WD可能为CP编码基因的突变所致。但后来的研究证实，CP基因突变可导致遗传性原血浆铜蓝蛋白缺乏症（hereditary aceruloplasminemia），患者肝、脑等组织出现铁的过量沉积而非铜的沉积。而WD基因的成功克隆，人们最终确认WD的病因非CP基因突变引起，而是因ATP7B基因突变导致其编码产物功能障碍所致。

CP主要在肝细胞中合成，CTR1将铜离子转运进细胞，位于TGN的ATP7B酶结合铜离子并将其传递给未与铜结合的CP前体蛋白（Apo-CP），通常1个CP分子与6～7个铜离子结合，形成具有活性的全CP（holo-CP）释放入血液循环，向组织细胞提供可利用的铜。在血液循环中超过95%的铜由CP携带，其余可由白蛋白、氨基酸等携带。

研究发现，肝细胞中Apo-CP与铜离子结合后，其构象会发生改变，并最终成为具有生理功能的holo-CP（图3-17）。因此，holo-CP和Apo-CP本质上是同一种蛋白的异构体，其区别在于是否与铜离子结合。Terada等发现在WD的动物模型LEC（Long Evans Cinnamon）大鼠血清中只含有Apo-CP而未发现holo-CP成分。Hirano应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native polyacrylamide gel electrophoresis，native-PAGE）成功地从人的血清中分离出Apo-CP和holo-CP，并发现WD患者的holo-CP表达水平明显低于健康对照者，甚至部分患者出现holo-CP成分的缺乏。Hirano等认为，WD患者由于ATP7B基因突变导致肝细胞内铜的跨膜转运障碍，并因此引起Apo-CP不能与铜离子有效结合，出现Apo-CP向holo-CP的转化障碍，肝脏中铜得不到有效利用而逐渐蓄积并最终导致发病。

（程楠　王训）