基因基础理论研究的深入带动了相关技术的飞速发展。1973年，科恩等把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，首次获得体外重组DNA的分子克隆。桑格等发明的双脱氧链终止法（chain termination method）为重组DNA片段进行序列分析奠定了基础。在微生物学方面，由于细菌生长迅速，容易控制，因而将基因导入微生物细胞内适合进行大规模生产，解决了生产重组DNA的产量和成本问题。DNA克隆、测序技术和微生物学三方面相结合，促成了基因工程科学的诞生。基因工程（genetic engineering），又称DNA重组技术，是对DNA进行人为的设计和改造，通过体外DNA重组构建设想的DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有遗传特性的一种技术手段。随着对基因表达调控认识的加深和基因工程技术安全性等方面的提高，基因工程的应用已经从基础研究转向对一些困扰人类健康的遗传疾病进行治疗，即基因治疗。在基因治疗短短的数十年历史中，有成功的案例，然而也发生过以生命为代价的失败和惨痛教训。近年来，尤其是自2012年CRISPR技术的发现，基因治疗再次被推向生命科学领域讨论的热点。由于我国在临床基因治疗方面较为开放的政策，我国的临床CRISPR研究处于世界前沿。在现阶段，由于还没有任何一个基因治疗技术具有成功的保障，因此选择的患者均是对其他治疗手段无效的重症患者。从理论上，基因治疗无疑是治疗基因缺陷病的根本手段。然而，由于基因治疗的安全性和未知因素等原因，切忌盲目性、不遵循技术发展规律和国家相关法规的急进式应用，避免历史悲剧的重演。

基因治疗（gene therapy）是一种以预防和治疗疾病为目的的人类基因工程技术，是以正常有功能的基因置换或增补缺陷基因，改变患者遗传物质为基础的生物医学治疗。基因治疗通常采用的方式为受体细胞经体外修饰后再次输入患者体内，或将基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞内发生遗传学变化，其结果就像给基因做了一次手术，因此可以形象地称它为“分子外科”。随着科技的发展，基因治疗的概念有了较大的扩展，目前的观点认为凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展疾病治疗的方法都可称为基因治疗，其研究内容也从遗传病扩大到肿瘤、心血管病、神经系统疾病、代谢病及传染病（如艾滋病）等多种疾病。

基因治疗是基因工程发展的必然产物。20世纪70年代罗杰斯发现乳头状病毒感染能够导致血液精氨酸水平下降，推测此现象是由病毒表达所致，并首次提出用病毒感染来治疗遗传病的观点。1980年科林将正常人的β株蛋白的基因转入2例珠蛋白生成障碍性贫血（地中海贫血）重症患者的骨髓细胞，然后回输患者体内，这是人类历史上第一次基因治疗尝试。由于当时基因治疗尚未经过研究论证，理论上也没有经过广泛讨论的基础，加上这次实验经过长期的观察，虽然没有毒副作用，但临床症状也未见明显改善，这一做法在当时遭到了强烈批评。但基因治疗的实验研究并没有因此而停止。

1989年，罗森博格等经美国国立卫生研究院（NIH）重组 DNA顾问委员会（Recombinant DNA Advisory Committee，RAC）以及美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准，用反转录病毒将细菌的新霉素抗性基因（ neo ^R）导入人的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），并将TIL输回人体内，TIL集中在肿瘤部位表达 neo ^R达3周之久，首次提示改变人体细胞遗传物质的可行性，为此后的临床研究提供了重要基础。1990年9月NIH的布莱泽等将正常腺苷脱胺酶基因（ADA）利用反转录病毒载体成功导入一名由于ADA基因缺陷所致的重症免疫缺陷的4岁女孩的淋巴细胞内，体外培养后回输入患儿体内。经7次注射，患儿体内ADA水平达到正常人的25%，免疫功能逐渐恢复。这一临床案例说明缺陷型病毒载体能安全地将基因转移至淋巴-造血系统并发挥疗效，是人类历史上第一个成功的基因治疗临床试验，标志着基因治疗临床应用阶段的开始。

1991年，薛京伦等对血友病B患者采用在皮下植入含有正常凝血因子Ⅸ的自身皮肤成纤维细胞，成功地改善了4例血友病B患者的临床症状，达到预期目标，这是我国开展的首例基因治疗案例，也是国际上对血友病B患者进行的首次基因治疗临床试验。后续的国际国内的一系列研究对治疗的途径也进行了大胆的探索，取得了一定进展。例如，成功实现将效应基因导入人的造血干细胞。由于造血干细胞处于造血细胞发育阶段的上游，并且寿命较长。从理论上讲，这些改造后的造血干细胞可以源源不断地制造新生的、没有遗传缺陷的血细胞。

近年来，研究人员已经开始尝试将严重危害人类健康的多基因病如肿瘤和病毒性疾病作为基因治疗研究对象。进入21世纪，在巨大的应用前景的推动下，世界各地产生了许多以基础研究为目的的实验室和以临床研究为目的的基因治疗公司。2004年由我国研制生产的，世界上首个获准上市的基因治疗药物——重组人p53腺病毒注射液（今又生）得到原国家食品药品监督管理总局批准，获得国家一类新药证书，用于治疗鼻咽癌、头颈部鳞癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等40余种肿瘤。

需要特别指出的是，基因治疗的发展并非一帆风顺。发生在1999年的杰西·基辛格（Jesse Gelsinger）事件和2003年的儿童继发白血病事件使基因治疗研究在世界范围内受到了一次沉重的打击，临床研究被叫停，一些实验室因此而终止研究，基因治疗研究陷入十多年低迷期。基辛格是一名患先天性鸟氨酸氨甲酰基转移酶病症的患者。该病是一种致死性的X连锁隐性遗传病，往往引起新生男婴患儿的死亡。1999年9月 17日，基辛格在首次接受基因治疗实验后，因强烈的免疫反应和多器官衰竭致死。基辛格是世界上首位因基因治疗导致丧生的患者。美国FDA和NIH的调查认为，在基辛格事件上存在着明显的急于上临床、忽视实验规则等重大安全隐患。随后发生在2003年的5位接受基因治疗的儿童罹患白血病的事件则与基因治疗中病毒载体的安全隐患有关。

慢病毒（lentivirus）载体是在前期反转录病毒的基础上发展出的新一代、更安全有效的病毒载体。2009年，慢病毒首次被用于临床治疗，治疗对象为患有单基因疾病——X连锁肾上腺脑白质营养不良（X-linked adrenoleukodystrophy）的患者。之后，有超过300个临床试验使用了慢病毒载体。截至2016年12月，尚未有受试者患癌的报道。总体而言，规范基因治疗的临床相关研究和开发新型病毒载体仍然是目前基因治疗中的两大焦点。

根据靶细胞的类型，基因治疗可分为生殖细胞基因治疗（germ cell gene therapy）、体细胞基因治疗（somatic cell gene therapy）和增强细胞基因治疗（enhancement gene therapy）。生殖细胞基因治疗是将外源正常基因转入精子、卵子或受精卵，矫正有缺陷的基因而达到治疗遗传病的目的。体细胞基因治疗是应用体细胞基因工程技术将某个基因植入人体，从医学上校正该患者的遗传缺陷。增强细胞基因治疗既可以改变体细胞的遗传物质，也可以改变卵子、精子或早期胚胎细胞的遗传物质。从理论上讲，将受精卵早期胚胎细胞作为治疗目标进行生殖细胞的基因治疗是可行的，但受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变势必影响后代，伦理学障碍和技术上的困难使生殖细胞基因治疗目前仍为禁区。体外受精的发展也许可以推动人类生殖细胞基因治疗的研究。体细胞基因治疗只涉及体细胞的遗传转变，不影响下一代，现已被广泛接受作为严重疾病的治疗方法之一，在现代伦理道德上是可行的，方法上易于实行，而且已取得了可喜的成果。

根据基因导入的方式，可将基因治疗分为体内基因导入（in vivo）和体外基因导入（ex vivo）两种形式。前者指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸体的DNA直接导入体内。后者指在体外将外源基因导入培养的自体细胞或特定的细胞，经筛选后将能表达外源基因的受体细胞重新输回受试者体内。尽管体外基因导入比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂难度大，即使临床可用，必须设立专门机构，不利于推广与产业化；体内基因导入途径是一种更接近于临床实际情况的方式，操作简便、容易推广，然而这类方法尚不成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题。

基因治疗的策略很多，并且随着基因治疗范围的扩大和新兴技术发展的推动，会有更多的基因治疗策略产生。根据宿主病变的不同，基因治疗的策略也不同，这就要求人们根据实际应用中不同的治疗目的来灵活选择。常用基因治疗的策略概括起来主要有下列五种：

免疫调节（immunoregulation）指将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。

基因抑制（gene constraint）或基因失活（gene inactivation）指导入外源基因去干扰、抑制有害的基因表达。基因抑制主要是通过小干扰 RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）等技术手段通过与靶基因同源的RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是通过siRNA或ASO与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。RNA干扰（RNA interfering，RNAi）是一种利用人工合成的，与靶基因或RNA互补的一段核苷酸，通过碱基互补配对原则结合于靶基因RNA上，使靶RNA发生特异性的降解，导致其相应的基因敲减（或沉默）的技术。整个作用过程首先是双链RNA（double strand RNA，dsRNA）注射进入细胞，在 Dicer酶的切割下形成小干扰 RNA（short interfering RNA，siRNA），之后 siRNA与 RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，指导RISC与其序列高度同源的 mRNA结合，使其发生降解，达到基因沉默的目的。反义寡核苷酸（ASO）是在RNA干扰基础上发展起来的一种基因沉默技术。ASO可以是与靶序列互补的单链 RNA，也可以是DNA。单链RNA发挥作用机制同 siRNA。单链DNA与靶RNA结合进而被核糖核酸酶RNase H切割，达到沉默该基因的作用。由于细胞核内存在RNase H，因此ASO较siRNA更适合沉默核内转录本。目前，美国FDA已批准两种反义寡核苷酸药物（衍生物）福米韦生（fomivirsen）和米泊美生（mipomersen）分别用于巨细胞病毒性视网膜炎（cytomegalovirus retinitis）和纯合子家族性高胆固醇血症（homozygous familial hypercholesterolemia）的治疗。

基因代替（gene replacement）是指在基因组水平上去除整个变异基因，用有功能的正常基因取而代之，使致病基因得到永久的更正。

基因修正（gene correction）指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留，使缺陷基因在原位得到特异性修复。

基因添加/增强（gene augmentation）指将正常功能的基因转移到有基因缺陷或基因丢失的细胞中以表达正常产物，从而弥补缺陷基因的功能，近十年来已经发展了许多有效的方法可将目的基因导入真核细胞，并获得表达。这一方案适宜隐性单基因疾病的治疗。

基因治疗首先需要分离出特异性基因和获得携带该基因的载体或细胞，然后将该外源基因有效导入体内，最后需要目的基因能产生足够量的产物。因此基因治疗需要考虑目的基因、受体细胞和基因载体的选择。目的基因一般是疾病发生根源，而且该基因在细胞内能够完整地、稳定地整合并能适时适量地表达蛋白质。受体细胞最好选择组织特异性细胞，要易于从体内取出，且成活率高。离体的细胞要能接受外源基因转染，并能安全输送回体内。基因表达载体有质粒载体（非病毒载体）和病毒载体两大类。病毒载体的构建原则与质粒载体相似，但进入靶细胞的方式不同。在基因治疗中多是将目的基因与病毒载体重组后，再感染靶细胞，以便将目的基因带入靶细胞，并得到表达。然而，由于病毒载体在临床上存在自身免疫源性和生物安全等问题，在使用中务必谨慎，严格遵守基因治疗的相关管理条例，使用安全与有效的病毒载体。

基因治疗中的常用载体系统有病毒载体和非病毒载体两种。最常用的病毒载体有反转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。由于病毒载体的基因转运能力强，是早期和目前仍被广泛使用的载体系统。然而，病毒载体携带目的基因的容量有限，在临床上存在自身免疫源性和生物安全等问题，尤其在1999年出现的因使用病毒载体进行基因治疗致死案例之后，使得研发人员对以病毒为载体的基因治疗方案更加谨慎。非病毒载体传递基因的方法包括物理法和化学法，具有低毒、低免疫反应、携带基因的容量不受限制等优点。

反转录病毒（retrovirus，RV）是 RNA病毒，是基因治疗中最早被应用的载体，也是现阶段使用最为广泛的病毒载体系统。反转录病毒载体的主要优点是：①整合效率高，能够有效整合到宿主细胞基因组内，使携带的外源基因持续、稳定表达；②表达谱广，具有广泛的宿主范围，如骨髓干细胞、成纤维细胞、肝细胞、心血管细胞等；③免疫反应较低；④携带外源基因的容量较大，可达10～15kb；⑤感染效率高，尤其适用于处于分裂增殖状态的细胞。然而，由于反转录病毒的DNA复制中间体在整合入细胞染色体时为随机的，故外源基因也会随机插入细胞染色体中，其表达会受插入位点两侧的DNA序列影响，并有可能引起插入突变。此外，反转录病毒靶向性差，在体内滴度较低。

慢病毒（lentivirus）载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）为基础发展起来了一种新型载体，是反转录病毒的一个亚类。慢病毒不仅具有普通的反转录病毒的表达力持久和宿主范围广泛的优点，而且对非分裂细胞也具有感染能力，是目前研究较为深入、发展较快的一种病毒载体。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中，具有重要的临床价值。

腺病毒（adenovirus，AD）是一种大分子双链无包膜DNA病毒。腺病毒载体的主要优点是：①适用范围广，可感染分裂期和非分裂期的细胞。因此，可以将携带外源基因的重组腺病毒载体直接注入组织中，实现原位组织细胞感染。一些改良的腺病毒具有可以增殖并继续感染周围肿瘤细胞的专一特性，故这种载体常用于装载自杀基因以杀死肿瘤细胞；②感染效率高，最高可达 100%；③病毒滴度高，腺病毒易于制备、纯化和浓缩，病毒滴度可高于反转录病毒1万倍以上；④体内运送途径广泛，腺病毒可以制成胶囊或药液，通过口服、喷雾、滴注等方法进行；⑤不整合至宿主细胞染色体，腺病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞内，并转移至细胞核内，但由于其基因组保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中，因而比较安全。然而，恰恰是由于腺病毒不能整合到宿主染色体上，不能持续表达所需产物，表达时间短暂，体内应用一般只持续2～4周，因而适用于瞬时转基因的疾病治疗，如肿瘤。此外，腺病毒也能够诱导机体产生免疫反应，限制其重复使用的次数。

由于腺病毒本身基因组较大（基因组为 30～36kD），构建载体相对较为复杂。目前人们已致力于Ad载体的改造，现已发展到第三代。经改造的新一代腺病毒载体一方面通过仅保留了腺病毒必要作用元件，大大降低了载体本身的大小，另一方面同时保留了腺病毒容量大的优点，并使其细胞毒性和免疫原性大幅度减弱，增加了目的基因的表达时间。国内外学者致力于探讨动物腺病毒是否能够用来代替人类腺病毒进行基因治疗，已取得一些可喜结果，值得关注。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体是目前动物病毒中最简单的一种缺陷型单链线状DNA微小病毒（provirus），其主要优点包括：①既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，更容易在S期转入细胞；②无致病性，人类为自然宿主，安全性较高；③腺相关病毒基因组可克隆入质粒，载体构建简单；④可将外源基因定点整合人类19号染色体长臂，减少插入突变的可能性，基因表达稳定且持续性长。然而，腺相关病毒载体存在感染效率低，外源基因容量小，病毒蛋白对细胞有一定的毒性等缺点。

最新研究表明以往腺相关病毒的产生需要整合/辅助质粒和腺病毒的两次转染，现可应用多聚赖氨酸将整合辅助质粒相连接，然后再通过Ad5的单克隆抗体与缺陷型的腺病毒连接，构成腺病毒-多聚赖氨酸-整合/辅助腺病毒相关病毒质粒的复合体，一次转染包装细胞，不仅发挥了腺病毒相关病毒的作用，而且利用了腺病毒的高转染性，从而提供了效率，简化了操作，并提高了滴度。

非病毒系统本身为阳离子，与负电荷DNA通过静电力结合后电荷仍为正，可有效地与带负电荷的细胞膜发生作用，并主要通过内吞作用进入细胞。主要有阳离子聚合物、阳离子多肽和阳离子类脂（脂质体）。其中，脂质体包含一组生理pH下带正电荷的类脂，能与负电DNA通过静电结合，已成为目前研究最多的非病毒载体之一。此外，也有最简单的非病毒载体介导的基因递送系统使用了“裸”DNA（naked DNA），将它们直接注入特定的组织，尤其是肌肉，结果看到了显著的基因表达，尽管这种表达较病毒载体低，但由于方法简便，使得它成为基因治疗临床试验中一种比较流行的非病毒载体（占总试验数 14%）。

基因编辑（gene editing）是对目标基因进行改造，实现对基因组上特定DNA片段的敲除、加入和变异等的技术。2007年荣获诺贝尔生理学或医学奖的“基因敲除（gene knockout）”技术就是一种常用的基因编辑技术。基因编辑技术的应用十分广泛，由于实现了对基因的定向编辑，因而能够有目的地对靶基因的功能逐个进行基础研究，也是临床基因治疗的重要技术手段。随着近年来新型特异靶向基因编辑技术的发展，可将基因编辑技术分为传统的基因打靶技术和新型特异靶向基因编辑技术。

传统的基因打靶技术以同源重组和胚胎干细胞技术为基础。同源重组（homologues recombination）指当外源DNA片段与受体细胞基因组片段同源性高时，同源DNA区部分可与受体细胞DNA的相应片段发生交换的过程。传统的基因打靶技术首先将含有同源序列的外源基因导入受体胚胎干细胞，使染色体基因组上的序列与外源基因之间发生同源重组互换，从而将外源基因定点整合到受体细胞基因组上特定位置，实现受体细胞基因敲除、敲入或者改造。传统的基因打靶技术还能够建立条件性和诱导性基因编辑，实现对基因的时空编辑。传统的基因打靶技术已经十分成熟，为分子遗传学、发育生物学和医学等的发展提供了十分有效的研究手段。然而，传统的基因打靶技术依赖于早期胚胎中形成嵌合体生殖细胞的能力，同源重组效率较低，需要两代繁育时间才能够获得纯合子敲除后代，周期较长。

近年来，随着科技的发展，出现了一些不以同源重组或胚胎干细胞技术为基础的新型特异靶向基因编辑技术，包括锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和成簇规律间隔短回文重复（clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat，CRISPR）系统。与传统的 ES打靶技术相比，这些新技术保留了定点修饰的特点，而基因编辑更为简单、高效、成本更低。ZFNs、TALENs和CRISPR的基因编辑原理类似（图1-11、表1-2），均需首先在受体细胞基因组DNA上产生定点断裂，继而通过激活受体细胞体内的天然修复机制，对切口进行修复实现基因编辑的目的。非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组修复（homologous recombination，HR）是 DNA双链断裂损伤（double strand break，DSB）的两种主要修复通路，其中NHEJ为主要方式。NHEJ是一种低保真的修复过程，断裂的DSB在修复过程中往往发生碱基随机丢失或者插入，造成蛋白编码基因的移码突变或者顺式作用元件失活，从而实现插入突变、缺失突变或者靶基因失活。HR是一种相对高保真的DSB修复过程，在含有同源臂重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过HR完整地整合到受体细胞的靶位点，实现定点定向变异或者插入，而不产生随机变异。如果在一个基因的两侧同时产生DSB，在含有同源臂重组供体存在的情况下，可以进行基因替换。

ZFNs由锌指蛋白（ZFP）和FokⅠ核酸内切酶两部分组成。其中，由ZFP构成DNA识别域，识别靶基因特异性DNA位点并与之结合，近而由 FokⅠ执行剪切功能，使靶位点产生DSB。ZFNs可以用于多种物种的基因编辑，然而目前的技术对获得高亲和性的ZFNs需要投入大量的时间和人力。

TALENs技术同样需要FokⅠ核酸内切酶，不同的是，锌指蛋白被转录激活因子样效应物取代，执行特异识别DNA序列的功能。TALENs包括两个TALEN蛋白，分别靶向正义链和反义链上的靶标位点，而后与FokⅠ融合形成二聚体，在靶向序列中间的间隔序列（spacer）处对DNA进行切割，造成DSB。TALENs受上下游序列选择性的影响较小，设计性更强。

CRISPR为成簇规律间隔短回文重复序列，广泛存在于细菌与古生菌中，是用于清除外来入侵者遗传物质的一种免疫防御系统。CRISPR/Cas系统主要是由一个CRISPR基因与编码Cas蛋白的操纵子组成的。其中，根据CRISPR/Cas系统中参与的Cas蛋白的不同，可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3种类型。类型Ⅱ目前被广泛用于真核生物的基因编辑。Cas9蛋白是类型Ⅱ的代表，其功能为参与crRNA的成熟，以及在 tracrRNA：crRNA：Cas9三元复合物中的crRNA指导下对目的序列进行切割。真核生物没有天然的CRISPR系统，在应用中，需要设计一段单链引导 RNA（single guide RNA，sgRNA）以代替 crRNA-tracrRNA复合物，并且与Cas9蛋白结合，实施靶序列的定向切割。与其他基因编辑技术相比，CRISPR系统操作更简单、成本更低、时效性更高。此外，CRISPR不仅可以靶向编辑单个基因，还可以通过设计组合多条不同的sgRNA，一次性对多个基因位点进行编辑，因此迅速成为一种全世界范围内广泛应用的基因编辑技术，具有令人瞩目的应用潜力。自2013年CRISPR技术被证明能够有效地应用于哺乳动物体系进行基因编辑以来，新的CRISPR技术不断涌现，例如针对载体DNA片段过大而发明的“分裂的”Cas9分子（split Cas9）体系，能够对 Cas9蛋白的细胞内亚定位进行调控的雷帕霉素诱导体系等。目前，利用CRISPR技术的临床基因治疗已经开始展开。虽然我们对CRISPR/Cas系统的功能机制已经较为清楚，但是CRISPR技术并未完全解决脱靶副作用，也同样面临载体安全性的问题。同时，如此强大的一项基因编辑技术是否会被滥用而面临的伦理学等方面的问题不容忽视。现阶段，国际国内多家公司正以CRISPR等基因编辑技术为基础，研发适合临床基因治疗的优化方案，它们究竟能给基因治疗领域带来何种影响，我们将拭目以待（表1-2）。

随着人类基因组的开发，目前已发现的遗传病达6000余种，由于受到种种因素的限制，到目前为止，仅有20多种遗传病被作为基因治疗的研究对象。单基因遗传病的治疗是针对缺陷基因用相应有功能的基因替换，从而恢复细胞正常生理功能，以达到治疗目的，是基因治疗最明显的应用。其最终目的是通过基因稳定转移到可分化细胞（干细胞），以确保功能矫正的永久性。

在单基因遗传病方面的试验有1/3是囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）的，这是欧洲和美国最常见的单基因遗传病，该病患者的平均预期寿命低于40岁，因而成了基因治疗的主要研究对象之一。其次是腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）缺乏导致的重度联合免疫缺陷病（severe combined immunodeficiency disease，SCID）。这方面的研究约占整个单基因遗传病试验的20%。其他单基因遗传病方面的试验有20多例，多数试验都是通过检测蛋白看到了转移基因的瞬时表达，但没有明显疗效。Alessandro等对2例酶替代治疗无效的ADA-SCID患者进行临床基因治疗试验，用重组反转录病毒载体体外转染CD34 ⁺骨髓 HSCs，在非清髓性情况下进行自体骨髓移植，随访360天，临床表现良好，不需要ADA替代治疗，无毒副作用，此研究评价基因治疗的疗效，推动了临床基因治疗试验的发展。

基因治疗目前已经由最初的单基因遗传病治疗为主推广至多基因病治疗，其中在肿瘤中的研究最为引人注目。肿瘤的基因治疗主要可以分为免疫基因治疗、癌基因或抑癌基因治疗和药物敏感基因治疗等。其中，通过抑制癌基因或激活抑癌基因、恢复肿瘤局部的抗肿瘤免疫功能，恢复细胞周期调节基因、恢复机体对肿瘤转移的抑制等方法的工作原理是恢复异常表达或缺失的体细胞基因的功能而达到消除或者抑制肿瘤发展的效果。特别值得一提的是肿瘤免疫治疗。近几年来随着以PD-1抑制剂为代表的肿瘤免疫治疗研究的快速发展，肿瘤免疫治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别是针对一些致死率高、对传统治疗手段不敏感的恶性肿瘤甚至有更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中一个重要的组成部分。然而，和其他基因治疗一样，肿瘤基因治疗在实际应用过程中最大的障碍是高效、导向的载体系统和基因（或抗体等）导入后的有效调控等。此外，大多数新型的肿瘤基因治疗方法，如肿瘤靶向治疗不仅价格昂贵，也存在耐药和毒副作用的危险，并不适合所有的患者，有比较明确的适应证和适用人群，需精准判断。以下对肿瘤基因治疗发展过程中常用的一些治疗方法进行介绍：

细胞因子是由免疫细胞和一些非免疫细胞经刺激产生，并分泌到细胞外的一类具有生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子治疗的原理是将细胞因子基因导入体内，发挥细胞因子的免疫调节活性，通过直接（激活抗肿瘤免疫功能）机制达到抗肿瘤目的。其主要包括以下几个方面研究，一是细胞因子基因转染的肿瘤瘤苗的抗肿瘤作用，目前人们已将 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TIL类等的基因转入各种组织类型和具有不同免疫原性的肿瘤细胞制成新型瘤苗，经扩增后输回人体，可以促进肿瘤抗原和主要组织相容性复合体（MHC）的表达，激活机体免疫功能，增强机体免疫反应的能力；二是细胞因子基因转染的抗肿瘤免疫效应细胞的抗肿瘤作用，实际上是以过去的免疫疗法为基础，通过细胞因子基因转染以增强抗肿瘤免疫效应细胞对肿瘤细胞的识别、结合或杀伤效应，以取得更佳的抗肿瘤效果；三是某些易于体内移植和长期存活的载体细胞如成纤维细胞介导的细胞因子基因疗法，其实质是起到一个体内“小工厂”样作用，可使细胞因子在体内持续性生产并存在较长时间以发挥更强的作用；四是直接注射表达细胞因子的重组腺病毒等。其他治疗方法还有直接器官、组织内注射的细胞因子基因疗法等。

“自杀基因”（suicide gene）疗法是通过将“自杀基因”导入肿瘤细胞而对肿瘤细胞进行杀伤的一种基因治疗方法。目前研究的“自杀基因”多数是来源于病毒或者细菌的酶蛋白，这些酶能够将对人体无毒性的前体药物在肿瘤细胞内代谢为毒性产物，执行选择性杀伤肿瘤细胞的功能，属于间接“自杀”疗法。许多“自杀基因”同时还具有旁观者效应（by-stander effect），杀伤邻近未转染的肿瘤细胞。现已发现和克隆的“自杀基因”有多种，除了较早发现的白细胞介素-1β转化酶（ICE）基因外，还有来自单纯疱疹病毒或者水痘-带状疱疹病毒的tk基因、胞嘧啶脱胺酶基因、细胞色素 P450基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因等。

大量研究发现，肿瘤细胞与正常细胞之间在基因表达、酶、信号转导和细胞免疫等方面存在分子生物学上的差异特征，其中一些调节细胞增殖、血管生成的信号转导途径和肿瘤免疫抑制等对肿瘤的生长、迁移和浸润发挥着重要作用。肿瘤分子靶向药物正是利用肿瘤细胞与正常细胞之间的这种分子生物学差异，抑制肿瘤细胞的生长增殖，使其死亡。使用肿瘤分子靶向药物的治疗方法被称为肿瘤靶向治疗。进行肿瘤靶向治疗的一个基本原则是患者必须首先接受基因检测，明确患者肿瘤细胞存在治疗靶点，即相应的基因突变，达到精准攻击癌细胞的目的。目前使用最为广泛的肿瘤分子靶向药物有用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗（trastuzumab，赫赛汀）、非小细胞肺癌的吉非替尼（Gefitinib）、慢性粒细胞白血病的伊马替尼（imatinib）和贝伐珠单抗（bevacizumab/avastin）等，分别针对的是人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、BCR-ABL和VEGF/VEGFR。我国自主研发的一些肿瘤分子靶向药物也已经进入临床试验阶段。

肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别位于肿瘤细胞膜上的相关抗原（如MHC）、激活T细胞，对肿瘤细胞实施攻击和特异性杀伤作用的能力。许多肿瘤细胞表面具有相关免疫抗原，但肿瘤细胞却往往能够逃避免疫反应，这与抗原免疫原性不够、缺乏免疫共刺激分子及缺乏CD4 ⁺细胞的辅助有密切的关系。因此，针对这些问题，肿瘤免疫治疗方案分为两类：一类是通过直接增强肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原、MHC分子或黏附分子的基因表达而提高其免疫原性；另一类是通过刺激免疫效应细胞的间接机制达到增强免疫反应的目的，如肿瘤局部的抗原呈递细胞、T辅助细胞及巨噬细胞。

T细胞激活依赖于细胞表面的一些受体和配体，即免疫检查点，因而调节免疫检查点可以激活或者抑制T细胞。研究发现，肿瘤细胞能够通过多种机制对T细胞的抗肿瘤活性发挥抑制，例如位于肿瘤细胞膜上的细胞膜蛋白受体Programmed Death-1（PD-1）能够有效地使肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。PD-L1是PD-1的配体。研究发现，PD-1抑制剂能够有效控制约50%的皮肤癌患者的病情进展，对约10%的皮肤癌患者有治愈效果。此外，PD-1抑制剂还发现对24%左右的顽固性非小细胞肺癌患者有临床控制效果。2014年9月4日，美国FDA批准由美国默沙东公司开发的PD-1抑制剂Keytruda（pembrolizumab）用于治疗不再对其他药物响应的晚期或无法切除的黑色素瘤患者，标志着肿瘤免疫治疗时代的开始。其他应用于临床研发的免疫检查点还有 CTLA4、4-1BB、OX40和 CD27。

肿瘤靶向治疗的推广使得在过去的10年里肿瘤治疗方案的选择范围发生了巨大的变化。伴随着对肿瘤分子靶向药物研发的迅速扩大产生了一个新的肿瘤治疗领域“精准肿瘤学（precision oncology）”。需要特别指出的是，肿瘤靶向治疗并不适合所有的患者，有非常明确的适应证（包括肿瘤分期）和适用人群，需精准判断。例如，在肺癌中仅推荐被证明有相应基因突变的晚期非小细胞肺癌患者以靶向治疗为优选方法。肺癌Ⅰ期和Ⅱ期患者禁止使用靶向治疗，因为靶向药物在使用数月至1年左右有可能会发生耐药，当疾病复发时失去继续接受治疗的机会。肿瘤免疫治疗是肿瘤靶向治疗的一种方法，最近几年在抗癌领域中的作用令人瞩目。目前已经衍生出许多免疫相关肿瘤治疗策略，如DC-CIK和CAR-T等疗法。与其他疗法类似，免疫疗法都有具体的适应证，也存在毒副作用和耐药性等问题。目前肿瘤免疫疗法仅作为传统治疗手段的辅助疗法，在具有明确的临床适应证患者中使用。靶向药物的耐药性问题仍然是目前临床疗效的一个瓶颈。

获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由HIV感染引起的全身性免疫系统功能缺陷性疾病。HIV是一种反转录病毒，与靶细胞膜上的CD4分子结合后进入细胞，HIV基因组RNA在反转录酶的作用下，反转录成cDNA，整合至宿主染色体。HIV基因治疗的策略主要有抗病毒基因治疗（细胞内免疫）和基因免疫治疗两方面。前者利用基因重组技术将表达病毒基因的反义核酸或蛋白突变体导入易感细胞内，从而干扰野生病毒的复制和增殖。后者包括体内注射针对HIV-1抗原特异性的携带“自杀基因”的 CD8 ⁺/T细胞，以及将重组的可溶性CD4基因直接注射或导入体外培养的人T细胞再输回体内，从而阻断 HIV和CD4分子结合的治疗方法。近来有些科学家尝试联用上述方法，也取得了较好的疗效。

基因治疗的基本理论依据是中心法则，即基因决定性状的基本法则。从理论上讲，基因治疗是可能治疗所有疾病的万能药。然而，基因治疗所涉及的大量基础科学问题目前尚未完全阐明，在基因操作技术方面，高效原位基因组修复技术还没有开发出来，因此基因治疗仍有很大障碍。此外，由于基因治疗本身存在风险，我国原卫生部药政局已于1993年5月5日颁布了《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》，2003年原国家食品药品监督管理总局颁布《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》。任何基因治疗相关临床试验必须在严格控制的条件下进行。近年来，伴随人类基因组计划的完成以及分子生物学技术的飞速发展，我们对人类基因组中的蛋白编码基因和非编码基因在疾病发生发展的病理生理过程中的作用有了更为深入的了解，反义寡核苷酸和CRISPR等新技术的出现和技术上的日臻完美，我们期待基因治疗在遵循伦理和管理规范的基础上，成为人类攻克疑难病症的一种有效手段。