第三节 干细胞起源的细胞融合假说
1911年，Aichel第一次提出肿瘤进展过程中的细胞融合理论：细胞融合引起染色体数量异常，进而引起肿瘤形成。他认为非整倍体可能是肿瘤细胞和侵入的白细胞发生融合产生的，认为额外的染色体和染色体数量上的异常导致转移表型的出现。几十年以后，Meckler和Goldenberg分别独立提出了相同的理论：转移是由肿瘤细胞和白细胞融合产生的。现在几个实验室报道融合可以使细胞出现非整倍体和获得高转移潜能。1984年LaGarde 和Kerbel也做出总结：融合可能导致肿瘤细胞基因表达发生重要改变。这些过程导致了已经有显著缺失或获得恶性侵袭的肿瘤细胞亚群的进展，并因此可能是产生大规模基因型和表型变异的遗传机制。如果与肿瘤细胞发生融合的正常宿主细胞正好是一个淋巴造血干细胞，那么它可能对使肿瘤细胞获得异常的转移特性并获得干细胞特性。因此，不合适的细胞融合可能有助于CSCs的形成（图3-7）。
细胞融合是生物发育过程中重要的一环。在发育过程中，相同细胞的融合产生了多核的巨细胞、骨、肌及胎盘。不同细胞的融合产生异核体，导致细胞分化。异核体随时间的推移趋于稳定，并且融合细胞的功能和特征也被体现出来。在成体中也可观察到细胞融合。循环的HSCs可以和肝细胞、心肌细胞、少突胶质细胞和蒲肯野纤维等融合。肝再生和组织修复过程中，异核体具有重要的功能。
许多肿瘤细胞存在融合基因。肿瘤细胞间或肿瘤细胞和正常宿主细胞间的混乱融合能够使细胞产生新的特性，并且肿瘤细胞和正常成体细胞的融合可以产生比亲本更具恶性的细胞。如增殖速度加快、转移能力增强，耐受凋亡信号，包括化疗药物。进一步的证据表明，肿瘤相关巨噬细胞，通过他们高的融合基因潜能，可能在肿瘤细胞融合中具有重要作用。假设，在高融合的环境下，突变吸引干细胞过来，参与了细胞融合的发生，这可能导致基因重新程序化并产生CSCs。
已知的侵袭和转移的途径很多。然而，从非转移的细胞群体中产生的转移细胞仍然不能够被人们所理解。引起上皮中肿瘤或黑色素瘤细胞脱离邻近细胞采取迁移表型，穿过基底膜进入真皮层，进入血液循环或淋巴，经过渗出，在淋巴结、远隔组织或器官形成新的肿物的机制是什么？长期以来认为在宿主选择性压力作用下，不稳定的肿瘤基因组在不具有转移能力的原位肿瘤里产生了具有转移能力的细胞。这一观点继续为设想的肿瘤进程提供了最好的框架。然而很难设想这个过程是如何通过持续、渐进的转移表型的突变产生的，这些突变表型要求在原位肿瘤激活或沉默大量基因。解决这一问题的方法是激活控制多条信号途径和起始前转移级联反应的管家调控基因。这一点已经在发育过程中EMT管家调节子的报告中证实，如SNAIL、SLUG、SPARC和TWIST在侵袭和转移过程中有相似的作用。在这个过程中，它们激活了与细胞黏附和转移相关的间质途径。例如，在乳腺癌中，TWIST激活microRNA-10b，而microRNA-10b又反过来引起前转移基因RHOC的表达，它增加了受影响细胞的转移潜能。然而，诸如TWIST等的管家调节子在肿瘤中自我上调的机制仍然不是很清楚。目前认为，至少在某种条件下，这种情况是可以通过肿瘤细胞和BMDCs的融合产生。尽管从上皮到间质基因表达的过渡确实是侵袭和转移的特征，表达的基因经常与迁移的BMDCs相似，如巨噬细胞和其他髓系细胞。迁移的BMDCs和肿瘤细胞发生融合共同表达融合后的基因组为这种现象提供了可能的解释。按照这一观点，融合理论比以往提出的任何理论更接近于统一肿瘤进展的解释。融合代表了一种非突变机制，它可以解释与恶性相关的基因缺失表达模式。巨噬细胞-肿瘤细胞融合的研究已经阐明了在亲本和融合细胞中的基因表达模式。在这种细胞中，基因表达反应了髓系基因和肿瘤细胞基因的结合，这些都是以解除细胞分裂为背景的。实际上，许多与肿瘤进展相关的分子和特征是通过正常的髓系细胞表达的，如血管生成、移动、趋化和趋向性、免疫信号、基质解除和重塑、对低氧的耐受和对化疗药物的耐受。肿瘤细胞发生融合可能对转移细胞的非整倍体和基因重排有作用。毫无疑问，动物和人肿瘤的研究表明，在体内这种融合是转移的来源。
在从人髓母细胞瘤和胶质瘤中分离的CSCs中观察到了染色体紊乱的现象。有趣的是，这两个报道都描述了非整倍体的CSCs群体，而髓母细胞瘤和胶质瘤干细胞有不同的核型，包括不同的非整倍体癌干细胞群体的存在。这就产生一个问题：肿瘤的非整倍体是从何而来？在许多肿瘤非整倍体的早期表现表明非整倍体的获得非常快。通常的观点是：一套关键突变影响控制基因组稳定性的分子，这些分子反过来导致非整倍体的出现。然而，有众多报道表明细胞可以通过细胞融合获得其他细胞的表型。例如，小鼠的骨髓细胞可以和胚胎干细胞发生融合并自发的采取受体细胞的表型，没有详细的遗传分析，可能被作为转分化或去分化的解释。另外，体外神经干细胞和胚胎干细胞融合，融合细胞注射到鼠胚泡。融合细胞获得了组织特异性特征和宿主细胞的分化潜能。许多融合细胞是非整倍体。然而，也不排除融合细胞经历减数分裂产生二倍体。因此，一个二倍体细胞也可能是一个融合细胞。
融合也可能发生在不同的肿瘤细胞，也可能发生在肿瘤细胞和正常体细胞之间。这可能是一个小概率事件，但在肿瘤进展中可能具有重要作用（图3-8）。
细胞融合可能产生细胞的多样性。细胞和环境因素可能诱导肿瘤细胞和正常细胞的细胞融合。大多数细胞要么死亡要么静默，但小部分可能增殖，产生新的肿瘤和对肿瘤血管生成起作用的细胞。有证据表明实体瘤内的内皮细胞遗传异常。这些细胞表现为非整倍体，具有多条染色体和多个中心体。这提示在肿瘤细胞和内皮细胞间可能发生了细胞融合。
融合发生在肿瘤细胞吞噬、肿瘤相关的巨噬细胞或其他吞噬细胞的凋亡体出现之后。体外肿瘤细胞吞噬过程中，出现癌基因的水平转移。病毒可以诱导肿瘤细胞融合。Syncytin蛋白可以使子宫内膜癌和乳腺癌发生融合。蛋白激酶AKT2的慢性激活导致人肾上皮细胞多核化和细胞融合的发生。细胞内化的细胞—细胞侵袭机制可能也引起细胞融合的发生。融合的一个基本的要求是，融合细胞的膜要充分接近。这伴随着受体—配体的相互作用，这在病毒—细胞融合、巨噬细胞—巨噬细胞融合形成破骨细胞和巨细胞过程中可以看到。至于巨噬细胞，它的一些基因也参与了细胞融合。在破骨细胞的形成中，参与融合的三个受体系统是巨噬细胞融合受体MFR、CD44及DC-STAMP。CD44是一个未知的融合配体，在融合的早期阶段也瞬时表达。通过Ⅰ型基质金属硫蛋白酶去除膜表面CD44胞外结构域，可能使细胞靠近发生融合。DC-STAMP是一个趋化因子样受体，在巨噬细胞融合产生破骨细胞和巨细胞过程是必需的。尽管DC-STAMP的配体还不能确定，但细胞因子CCL2是一个候选配体，CCL2是破骨细胞和巨细胞形成过程中的一个重要成分。巨噬细胞可能因此通过它们天生的融合能力和肿瘤细胞融合。同样，肿瘤细胞可能也易于发生融合。因为它们表达融合相关的受体和配体。例如，CD44在肿瘤细胞广泛表达，是细胞表面透明质酸受体并与不良预后相关。CD44也是公认的几种实体瘤干细胞表面标记物。CD47和CCL2（包括CCL2受体）在许多不同的肿瘤表达，在浆细胞和黑色素瘤细胞表面也可检测到，这就满足了融合的一项要求。
另外，融合细胞的产生也可能是细胞与细胞通过细胞内连接形成的瞬时跨膜蛋白和细胞器交换的结果，这种连接通常直径为50～800nm。在体外，在体细胞已经观察到这种连接。
在体内，肿瘤细胞和很多细胞发生融合，包括基质细胞、上皮细胞和内皮细胞。关于肿瘤细胞和宿主细胞的融合的报道大多提示巨噬细胞或其他BMDCs作为融合的一种细胞成分。例如，当MDAY或A9小鼠肉瘤和同种的骨髓一起植入小鼠体内时，可以产生BMDCs和肿瘤细胞的融合细胞。在自发转移到肺的恶性黑色素瘤细胞的发育过程中也可以看到这种现象发生（图3-9）。Balb/c裸鼠是一种拥有酪氨酸蛋白激酶纯合突变的白化鼠，它是黑色素生成过程中的一种限速酶。尽管移植到这种鼠体内的恶性黑色素瘤细胞克隆能够在遗传上产生野生型酪氨酸激酶（C/C），但事实上细胞仍产生少或没有黑色素从而形成无色素肿瘤。虽然转移发生频繁，但肿瘤通常较小，在肺部无色素并且可以被鼠所耐受。然而，在一个实验中，一只鼠在种植部位附近的尾部真皮产生了可以产生黑色素的肿瘤（图3-9A）。这只鼠尾部已经被截断并随后看是否发生远处转移。5周后，鼠开始濒死，并在肺部出现大块的色素转移灶（图3-9C）。DNA分析表明转移灶的细胞有C/c表型，表明它们发生融合，并来源于移植的肿瘤细胞和宿主细胞的融合。来源于转移灶的细胞DNA含量增加了30%～40%，体外趋化作用增强，N-乙酰葡糖胺基转移酶V激活增加，并且产生β-1，6-分支酶。它们也产生了粗大的黑素颗粒，包括黑素体和其他细胞器的自噬体，来源于转移灶并确定为融合的形态一致的细胞，表明融合在源种植部位发生（图3-9B）。起源部位的组织病理研究表明它们有巨噬细胞浸润，支持巨噬细胞—肿瘤细胞融合发生的可能性。
BMDCs-肿瘤细胞融合已经有报道。转录激活的恶性核和正常核在来源于黑色素瘤患者的肿瘤相关破骨细胞中观察到。在这些破骨细胞中，30%的核是恶性细胞来源的，表明显著高的破骨细胞—肿瘤细胞融合发生率。这种发现和黑色素瘤病理的潜在相关性仍然不太清楚。其他研究表明同源HSCs移植后，发生的其他恶性肉瘤细胞存在供体细胞的基因。然而，由于技术的原因，确切的供体—受体细胞融合的证据仍然缺乏。在第一个报道的例子中，移植他的未患肿瘤兄弟的HSCs的儿童在移植后发生肾细胞的肿瘤。通过激光捕获显微切割技术和PCR对这个肿瘤的转移淋巴结进行供体基因分析。所有肿瘤细胞都包含有供体特异的A等位基因。表明HSCs以某种形式参与了肿瘤的形成。患者在移植前进行放疗和免疫抑制增加了患者再发肿瘤的可能性和供体BMDCs通过融合整合入患者肿瘤细胞中。然而，因为不能够获得合适的患者特异DNA序列，所以在同一个细胞内供体和患者基因的证据就不容易获得。但是，所有肿瘤细胞产生β-1，6糖苷酶，这是几种肿瘤的风险因素和其他BMDCs-肿瘤细胞杂交的特征。在第二个例子中，起源于男性对女性HSCs移植后产生的早期乳头状肾细胞癌的瘤细胞，表现出17号染色体三体，这是一个在早期肾癌和其他肿瘤常见的异常表现。大约1%的17号染色体三体的肿瘤细胞也包含有Y染色体。如上所述，结合病史，在肿瘤发生后发生了HSCs同肿瘤细胞的融合。然而，也可能是肿瘤单独起源于供体HSCs，而没有发生融合，随后在生长和扩散过程中丢失了Y染色体，这种情况也是不能排除的。但是，值得注意的是，包含有Y染色体和17号染色体三体的肿瘤细胞在肿瘤内配对成簇分布，这与有丝分裂后期子细胞相似，这可能是CSCs产生的一种模式。另外，包含Y染色体的肿瘤细胞在肿瘤中10%左右的地方出现，表明这些细胞的克隆性生长。支持这个现象的有，包含Y染色体的肿瘤细胞与大多数肿瘤细胞不同，表达β-1，6糖苷酶。在另一个报道中，包含Y染色体的肿瘤细胞被发现在两例肠肿瘤和一例以前接受过男性HSC移植的女性肺癌患者体内。XY荧光原位杂交表明没有出现可以支持BMDCs-肿瘤细胞融合细胞存在的XXY或XXXY染色体表型。这可能是一些来源于相似肿瘤细胞的BMDCs通过发育模拟而不是作为直接的肿瘤种子。然而，在上面的例子中，作为供体的Y染色体在具有17号染色体三体的细胞存在，这好似HSCs供体细胞不可能简单的通过模拟肿瘤细胞获得这种非整倍体，这种模拟可能不包括遗传变异。在女性对男性HSCs移植后生成的肿瘤的研究中，肿瘤细胞中被发现具有两条X染色体但没有Y染色体，表明它们至少部分来源于女性供体。然而，这个研究没有报道潜在的存在XXXY或XXY细胞，这些可以表明BMDC-肿瘤细胞融合的存在，也没有排除广泛的Y染色体缺失，这在很多肿瘤中是存在的并作为一些肿瘤XX表型的解释。但上述的XX肿瘤细胞倾向于成簇，表明肿瘤的干细胞样模式。王勇、樊宏斌等用人骨髓源间充质干细胞和人食管癌细胞进行融合试验。结果发现，融合后人食管癌细胞的成瘤能力下降。进一步分析发现，人食管癌细胞也没有获得间充质干细胞的分化能力。因此，间充质干细胞和肿瘤细胞融合可能不是CSCs产生的原因。
尽管目前关于CSCs的起源存在各种不同学说，但都将更新和完善着CSCs学说，并有助于我们揭示肿瘤起源的机制，为最终治疗肿瘤提供新的治疗方法。目前在CSCs学说的指引下，探讨针对CSCs的治疗，将对未来彻底根治肿瘤开创全新的治疗途径。
（樊宏斌）