EB病毒在鼻咽癌诊断、治疗和预后评估中的价值
吴海军 赵充
中山大学肿瘤防治中心
EB病毒（epstein-barr virus，EBV），又称人类疱疹病毒4型（Human herpesvirus 4，HHV-4），是一种人类特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒，由Epstein和Barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名EB病毒。EBV在人群中具有广泛的感染性，主要的传播途径为唾液，世界人口的90%以上都存在EBV的潜伏感染，或成为EBV携带者。人群中EBV感染大多发生在幼年时期。EBV感染后，在口咽部和涎腺的上皮细胞内增生，然后感染B淋巴细胞，可终生潜伏在人体淋巴组织中，形成潜伏性感染；当人体免疫力低下时，这些潜伏于淋巴组织中的EBV会再度活跃而形成复发感染。根据感染的细胞类型不同，EBV相关疾病可分为免疫细胞性疾病如传染性单核细胞增多症、淋巴瘤和上皮细胞性疾病如鼻咽癌、胃癌和涎腺癌等。
一、EB病毒与鼻咽癌的关系
鼻咽癌是起源于鼻咽上皮的一种恶性肿瘤，其发病具有明显的地域性。在欧美等西方国家，该病的发病率较低，年发病率小于1/10万人口；在东南亚国家，年发病率超过15/10万人口，而在中国南方诸省，尤其是广东省，年发病率高达30～80/10 万人口以上。自1976年Henle G通过研究首次发现鼻咽癌患者血清中存在EBV核抗原（VCA）及早期抗原（EA）相关的IgG、IgA抗体，且在多个其他研究证明人鼻咽癌组织和细胞中均能检测到EBV核抗原和EBV-DNA后，EBV感染与鼻咽癌的关系就受到了广泛的关注。随后，研究人员在鼻咽上皮癌前病变中发现了EBV藏匿；采用原位杂交技术发现除正常的鼻咽黏膜上皮细胞外，其余鼻咽肿瘤组织细胞均可检测到EB病毒编码的RNAs；以及鼻咽癌细胞中检测到EBV特异潜伏基因持续表达，相关潜伏病毒蛋白（LMP-1、2）在细胞基因表达和生长中起到非常重要的作用，导致癌细胞高度侵袭性和恶性生长等，证实了EBV在鼻咽癌的发生、发展中发挥了重要的作用。近十余年来，在我国华南、香港和台湾等地区大规模的调查以及大量的临床研究中均发现，血清EBV的抗体VCA-IgA、EA-IgA的滴度以及血清/血浆EBV-DNA定量水平在鼻咽癌发病前、早期病变、疾病进程、治疗及转归的过程中均会发生相应的规律性改变。至此，血清EBV的相关抗体以及血清/血浆EBV-DNA作为相关肿瘤分子标志物在鼻咽癌中的应用日益到重视。越来越多的证据表明，它们不仅在鼻咽癌的筛查、诊断中有较高的应用价值，对于个体化治疗策略的制定、疗效的评估及预后的预测等方面也发挥了极为重要的作用。
二、EB病毒相关肿瘤标志物在鼻咽癌筛查和诊断中的价值
在门诊初诊的患者中，70%左右已达中晚期。中晚期鼻咽癌患者的治疗疗效明显低于早期患者，因此，提高早诊率是提高鼻咽癌治疗疗效、减少医疗成本的关键因素。对高发区人群进行筛查是提高早诊率的有效手段之一。因鼻咽活检的有创性以及影像学检查成本高等原因，使其并不能作为鼻咽癌常规的筛查手段。鼻咽癌与EBV感染高度相关，被EBV感染的细胞具有EBV的基因组，并可产生多种抗原，如：EBV核抗原（EBV-specified nuclear antigens，EBNA）、早期抗原（early antigen，EA）、膜抗原（membrane antigens，MA）、衣壳抗原（viral capsid antigens，VCA）、淋巴细胞识别膜抗原（LYDMA）等。研究发现，除LYDMA外，鼻咽癌患者EBNA、EA、MA、VCA均能刺激机体产生相应的lgG和lgA抗体，并可在患者的血清中检测到这些抗体存在。由于血液学检查创伤小、成本低、可重复性强等优点，研究这些抗原抗体，对于高发区人群鼻咽癌筛查及鼻咽癌的早期诊断可能具有非常重要的价值。研究显示，血清中EBV的IgG抗体阳性通常表示曾经感染过EBV，并不能作为鼻咽癌的特异性分子标志物；而EBV的VCA-IgA、EAIgA和EBV的DNA多聚酶（EBV-DNase）抗体则是鼻咽癌高度特异的分子标志物。有证据表明，血清EBV的VCA-IgA、EA-IgA在鼻咽癌发病前就已经能够检测到，且在病程的早期其滴度即会明显升高。1984-1986年中国台湾一项针对9699位健康男性的血液样本进行EBV VCA-IgA和EBV-DNase抗体检测的结果发现，VCA-IgA阳性者患鼻咽癌的相对危险性为阴性的22倍，EBV-DNase抗体阳性者患鼻咽癌的相对危险性为阴性的3.5倍，两者均阳性者患鼻咽癌的相对危险性是两者均阴性者的32.8倍。季明芳等1986年采用免疫酶联法对鼻咽癌高发区广东省中山市30～59岁的42 048名健康人进行了血清VCA-IgA的筛查；对VCA-IgA阳性人群进一步做EA-IgA检测并每年监测一次，对VCA-IgA和EA-IgA双阳性或VCA-IgA高滴度者行鼻咽脱落细胞检查，必要时行病理组织活检；所有人随访至1999年年底，结果13年共检出鼻咽癌患者159例，其中VCA-IgA阳性人群鼻咽癌的发病率约为阴性人群的20倍；VCA-IgA阳性人群在较长时间维持较高的鼻咽癌患病风险，是筛查的重点。
目前，尽管血清VCA-IgA、EA-IgA和EBV-DNase抗体已广泛应用于鼻咽癌的筛查，并显著提高了早诊率。然而，对于鼻咽癌的诊断，由于他们普遍存在敏感性和特异性不高、阳性预测值较低的缺点，并未能作为诊断鼻咽癌可靠的分子标志物。血浆EBV-DNA的定量检测被认为是辅助诊断鼻咽癌较为敏感的方法。随着荧光定量PCR的出现，其具有的不需扩增后处理、快速、准确等优点，使其成为鼻咽癌分子标志物中研究的重点。研究显示，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA阳性率为58%～96%，而在健康对照者中其阳性率仅有7%～12%。血浆EBV-DNA定量诊断鼻咽癌的敏感性和特异性高达95%、98%，明显高于VCA-IgA、EA-IgA和EBV-DNase抗体。此外，俞霞等对广东省中山市16 712名居民中的血浆样本鼻咽癌筛查中还发现，在鼻咽癌初诊患者、高危人群、低危人群中，血浆EBV-DNA阳性率依次降低，具有统计学差异。由此可见，在鼻咽癌早期诊断方面，血浆EBV-DNA定量不但较VCAIgA、EA-IgA和EBV-DNase抗体检测更为敏感和准确，还可作为高危人群VCA-IgA、EA-IgA和EBV-DNase抗体筛查后诊断鼻咽癌的一种有效补充手段。
尽管采用调强适形放疗使鼻咽癌患者局控率得到了明显地提高，但仍有10%左右的患者出现局部复发，尤其是局部晚期患者，局部复发率高达15%～20%。局部复发后二程放疗鼻咽坏死、出血以及严重放射性损伤的风险大大升高，特别是对于复发病灶较大的患者。临床上若能尽早发现局部复发并予以及时地治疗，则有望提高复发患者的生存率和生活质量。研究发现，治疗后肿瘤完全消退的患者血浆EBV-DNA持续低水平或检测不到，但在出现复发时，血浆EBV-DNA将会重新升高；放疗后复发鼻咽癌患者血浆EBV-DNA的中位拷贝数显著高于治疗后持续缓解患者。此外，Lo YM等对复发鼻咽癌患者血浆EBV-DNA进行检测，发现复发患者血浆EBVDNA中位拷贝数位为32 350copies/ml，而持续完全缓解患者血浆EBV-DNA中位数为0 copies/ml，并且在复发患者出现症状或临床可检测到的肿瘤前6个月左右，血浆EBV-DNA水平已经开始上升。Liang FY等比较了EBV-DNA与MRI在鼻咽癌患者放疗后颅底复发诊断中的价值，发现血清EBV-DNA检测特异度、阳性预测值、阴性预测值高于MRI，联合EBV-DNA与MRI可以提高诊断颅底复发的特异性和阳性预测值。可见，血浆EBV-DNA与鼻咽癌复发关系密切。针对治疗后的患者，在随诊过程中进行常规临床检查和影像学检查的基础上，辅以血浆EBV-DNA的检测可帮助临床及早发现治疗后复发。
鼻咽癌具有极易发生远处转移的生物学特点，远处转移是治疗失败的主要模式。龚晓昌检测了360例根治放疗后鼻咽癌患者血浆EBV-DNA水平，结果发现，360例患者中87例血浆EBV DNA检测阳性，在此87例检出阳性者中，45例证实为远处转移。此后有多个研究对放疗后缓解患者、放疗后远处转移患者血浆EBV-DNA进行了检测，结果均发现，发生远处转移的患者血浆EBV-DNA阳性率与中位浓度显著高于持续缓解患者。因此，监测治疗后患者血浆EBV-DNA水平对于早期发现远处转移有重要的价值。对于远处转移的诊断，病理活检为金标准，但是往往因为转移灶较小、转移灶位置远离体表、位于重要器官内部或紧邻重要正常组织或器官等原因难以取得转移灶的病理组织，因此，体格检查以及超声波、X线、CT、MRI、全身骨扫描等影像学检查是筛查患者有无远处转移最常用的临床检查手段。然而，这些检查手段对于部分转移病灶尤其是较小的转移灶存在敏感性和特异性不高以及假阳性等缺陷。近年来，随着影像技术的发展，18F-FDG PET/CT已普遍应用于临床。由于18F-FDG PET/CT在恶性肿瘤远处转移的诊断上具有较高的敏感性，目前已成为发现和诊断鼻咽癌远处转移的重要手段之一。但其存在价格昂贵、检查过程中存在辐射性等缺点，限制了它的广泛使用。Ren YY等根据不同危险因素筛选最需要行全身18F-FDG PET/CT检查诊断是否发生远处转移的患者，结果发现治疗前血浆EBV-DNA>9000copies/ml是远处转移的最佳预测值；同时发现，具备治疗前血浆EBV-DNA≥9000copies/ml、N3、T4中的两项或以上的患者具有更高的远处转移风险，有针对性地对这些患者行全身18F-FDG PET/CT检查能获得更好的诊断效益比。He SS等人的研究也发现治疗前血浆EBV-DNA≥6750 copies/ml对初诊骨转移的诊断有一定的预测价值。因此，在体格检查和影像学检查的同时配合血浆EBV-DNA检测，对于早期发现鼻咽癌远处转移患者具有重要的价值。
三、EB病毒相关肿瘤标志物在鼻咽癌治疗中的价值
不同的患者对放化疗的敏感性不同，治疗的效果也不尽相同，如何预测治疗疗效是医师和患者都关心的问题。EBV的抗体VCA-IgA、EA-IgA由于在人体内的半衰期长，即使体内EBV清除后仍有较长时间在血液中维持较高的浓度，因此难以成为疗效监测和评价的指标。文献报道，鼻咽癌治疗过程中血浆EBV-DNA的变化可判断治疗敏感性。在一项紫杉醇+卡铂诱导化疗及顺铂同时期放化疗治疗局部晚期鼻咽癌的Ⅱ期前瞻性临床研究中发现，治疗结束后取得肿瘤完全缓解的患者血浆EBV-DNA均≤500copies/ml。此外，有研究发现，血浆EBV-DNA水平在放疗开始后迅速下降或治疗结束前已下降至检测不到的患者，近期疗效多为完全缓解；而治疗期间血浆EBV-DNA持续较高水平则很可能提示治疗结束后存在肿瘤残留；对于已经发生复发或转移的患者，姑息化疗前血浆EBV-DNA水平低于2.33×105copies/ml者预后较好，并且一程姑息化疗后血浆EBV-DNA水平迅速下降或姑息化疗后血浆EBV-DNA无法检测到的患者预后明显更好。可见，血浆EBV-DNA在判断治疗的敏感性、疗中疗效的监测等方面具有较好的临床应用前景，可为治疗中及时调整治疗策略提供参考。
Hou X等分析了69位鼻咽癌患者治疗前后血浆EBVDNA与肿瘤负荷、预后的关系，结果发现治疗结束前血浆EBV-DNA>20 000copies/ml的患者远处转移发生率明显高于EBV-DNA<20 000copies/ml的患者。Lee VH等前瞻性分析了放疗结束后8周及6个月时EBV-DNA定量对生存的预测作用，结果发现放疗结束后8周及6个月血浆EBV-DNA均为阴性的局部晚期患者有更好的生存结局，且放疗结束后6个月血浆EBV-DNA是否可检测到是3年各生存指标的唯一独立预后因素，该研究提示当放疗结束8个月后血浆仍能检测到EBV-DNA时，可能需要及时的辅助治疗。Twu CW等回顾性分析了625例有放疗前及放疗后血浆EBV-DNA定量检测资料患者，85例患者放疗结束后1周血浆中仍可检测到EBVDNA，其中33例患者联合替加氟和或丝裂霉素C、表柔比星、顺铂辅助化疗作为试验组，其余52例放疗后未接受进一步化疗患者作为对照组，中位随访5年，结果发现对于放疗结束后1周血浆中仍可检测到EBV-DNA 的患者联合辅助化疗可以显著降低远处转移率（P=0.0034），5年总生存提高了42.9%（P<0.0001）。
Xu C等对1230名局部晚期鼻咽癌患者按AJCC第8版分期重新分期后进行回顾性分析，拟建立列线图选择能从新辅助化疗中获益的患者，结果也发现，与同期放化疗相比，中危组患者（N0-2且治疗前血浆EBV-DNA≥1000copies/ml）及高危组患者（N3；N0-2+治疗前血浆EBV-DNA<1000copies/ml+年龄≥54+中性粒细胞淋巴细胞比率>2.7）新辅助化疗有总生存的获益。而Jin YN等的研究表明，对于疗前血浆EBV-DNA定量检测阴性的局部中晚期鼻咽癌患者同期放化疗加或不加新辅助化疗对疗效的影响，结果发现两组患者的5年总生存、无局部区域复发生存、无远处转移生存、无进展生存并无统计学差别，且治疗相关不良反应显著升高；提示疗前血浆EBVDNA阴性的局部中晚期患者发生不良预后风险较低，新辅助化疗并不能带来生存获益。这些研究结果提示，治疗结束时血浆EBV-DNA定量检测对于治疗疗效的判断以及治疗后是否需要进一步辅助治疗有着重要的临床价值。
在远处转移的治疗方案的选择方面，血浆EBV-DNA定量检测也有其独特的作用，He SS等的研究发现，与姑息化疗等治疗方式相比，对疗前碱性磷酸酶ALP≥110U/L及血浆EBV-DNA≥6750 copies/ml的单纯骨转移患者予以骨转移灶放疗有显著的总生存获益。
四、EB病毒相关肿瘤标志物在鼻咽癌预后预测中的价值
鼻咽癌具有明显的异质性，不同临床分期的患者复发或远处转移的风险可能相同，同样地，相同临床分期的患者复发或远处转移的风险可能不同。鼻咽癌的临床分期存在一定的局限性，单纯依靠临床分期并不能很好地预测预后。有研究发现，治疗前血浆EBV-DNA水平高的患者，更容易出现复发且总生存更差；Wang WY的研究显示，疗前血浆EBVDNA≥1500 copies/ml的患者局部区域复发率大于疗前血浆EBV-DNA水平更低患者的2倍；疗前血浆EBV-DNA水平是无复发生存及总生存的独立预后因素。李宇红等的研究发现初治疗前血浆EBV-DNA≥40 000copies/ml与治疗前血浆EBV-DNA<40 000copies/ml患者22个月无复发生存率分别为46.1%与92.9%（P<0.05）。
Leung SF等的研究发现血浆EBV-DNA水平高（>4000copies/ml）的AJCC Ⅱb期患者远处转移率高达35%左右，显著高于Ⅰ/Ⅱa期的患者，并且在发生远处转移的Ⅰ/Ⅱ期鼻咽癌患者治疗前血浆EBV-DNA定量中位值为13 219copies/ml，显著高于未发生远处转移患者的疗前中位值2753copies/ml。可见，即使在早期的患者中，亦存在远处转移高风险的病例，结合血浆EBV DNA可以更好地预测其发生远处转移的风险。Jin YN等分析了疗前血浆EBV-DNA水平与预后的关系，该研究纳入了1036名局部晚期鼻咽癌患者，采用单纯根治性放疗或放化综合治疗，中位随访5年；单因素及多因素分析均证实疗前血浆EBV-DNA水平是总生存、无远处转移生存、无进展生存的独立预后因素；临床分期为Ⅳa/b期且疗前血浆EBV-DNA<1500copies/ml的患者预后与分期为Ⅲ期且疗前血浆 EBV-DNA≥1500copies/ml患者相同，临床分期为Ⅳa/b期且疗前血浆EBV-DNA≥1500copies/ml的患者预后最差。而对于死亡风险，一项纳入了23个临床研究，共10 732位鼻咽癌患者的Meta分析结果表明治疗前血中EBV-DNA高水平（>1500～4000copies/ml）患者死亡风险是低水平患者的2.78倍，治疗后高水平EBV-DNA患者死亡风险是低水平患者的5.43倍。因此，血浆EBV DNA检测，可以辅助临床分期更好地预测发生复发和远处转移的风险。
此外，EBV相关的其他抗原或抗体在远处转移的预测方面也发挥了重要的作用。EBV表达的抗原EBNA-1阳性的患者更容易发生远处转移，总生存与无进展生存均更差。EBVDNA酶出现于病毒的增殖周期，其含量高低可直接出现反映机体内病毒复制的活跃程度。Jie Xu等人回顾性分析了1303位检测了EBV-DNA酶特异性中和抗体的血清抗酶率（AER）的鼻咽癌患者，经过长达10年的随访，确定ROC曲线截点值为58%，结果表明，EBV-DNA酶特异性中和抗体的血清抗酶率水平是总生存、无局部区域复发生存率、无远处转移生存率的唯一独立预后因素。
血浆EBV-DNA作为鼻咽癌的重要分子标志物，联合原发肿瘤其他相关指标可以更好地预测预后。首先，血浆EBVDNA与肿瘤体积存在共同的预后预测价值。Lixia Lu等前瞻性观察180例鼻咽癌患者，研究了肿瘤体积与血浆EBV-DNA对预后的影响，结果不仅发现GTVnx体积≥20cc与GTVnx体积<20cc患者、疗前血浆EBV-DNA≥6800copies/ml与EBVDNA<6800copies/ml患者5年总生存明显不同；还发现原发肿瘤体积小但血浆EBV-DNA水平高的患者预后最差；若血浆EBV-DNA水平低，则无论原发肿瘤体积大小，预后均相对较好。原因可能与血浆EBV-DNA为肿瘤细胞释放入血有关，若肿瘤体积小，但血浆EBV-DNA水平却高，说明EB病毒在肿瘤细胞中高度表达，预后最差，反之亦如此。因此，与肿瘤体积相比，血浆EBV-DNA水平可能是预测预后的更重要的因素。其次，对于血浆EBV-DNA与原发肿瘤SUVmax值的共同预后预测价值，Ting Shen等回顾性分析了194例复发或转移的鼻咽癌患者，分析血浆EBV-DNA与18F-FDG-PET检查的最大标准摄取值（SUVmax）与预后的关系，结果发现血浆EBV-DNA≥21 100copies/ml且SUVmax≥13.55两项指标的患者比只符合单项上述指标或不具有上述指标的患者5年总生存明显更差，血浆EBV-DNA对生存的预测作用优于原发肿瘤SUVmax，对于那些血浆EBV-DNA无法检测到且SUVmax小于8.65的患者仍有相对较好的预后。
五、EB病毒相关肿瘤标志物在鼻咽癌临床应用中存在的问题
在EBV与鼻咽癌相关的所有标志物中，已经明确EBVDNA在鼻咽癌的诊断、治疗策略制定、治疗疗效的监测和预后评估方面最具价值，但目前EBV-DNA在实际临床应用中，仍然存在较多的需要进一步解决的问题：
首先，虽然有研究证实血液中EBV-DNA来源于原发肿瘤组织，但是EBV-DNA释放入血的机制仍不明确。明确其机制，可能有助于寻找减少鼻咽癌远处转移的新治疗方法；
其次，是EBV-DNA定量的检测，可能存在不同的中心检验水平不尽相同，造成不同中心所选取的具有临床意义的临界值也不一样；即使是同一中心，检测结果有时也不能很好地重复。这是因为目前EBV-DNA的检测采用荧光定量PCR的方法，必须采用EDTA抗凝管采集血液，如使用肝素管，可能会抑制反应；采血后可室温保存，但必需6小时内送检；采用荧光定量PCR的方法检测血浆EBV-DNA的检测下限是103，103以下的结果不可靠，或者说不同时间、不同人员的检测都可能会有大的波动，而104以上的结果比较可靠；此外，荧光定量的探针设计，会因为所设计的EBV片段的位置不同，可能会在不同试剂盒之间造成差异；另外，血浆EBV-DNA实验操作过程的质量控制措施也是影响的因素之一，要尽量避免实验室的整体污染和标本、试剂提取过程中的污染，防止操作的误差，并规律性地安插已知浓度的质控品在仪器的不同孔间，排除由仪器造成的检测误差。
最后，虽然有很多回顾性研究或前瞻性研究证实血浆EBV-DNA对治疗方案的选择有重要作用，但如何更好将EBV相关指标应用于鼻咽癌的个体化治疗中仍需要更多的研究。
总结
作为与鼻咽癌高度相关的标志物，EB病毒相关抗原抗体及EBV-DNA在鼻咽癌的筛查、诊断、治疗策略制定及预后预测等方面发挥了重要的作用，也存在一些亟待解决的问题，希望今后进一步进行更深入的研究。
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