第一节 免疫学的重要研究方向与前沿热点
一、免疫学的重要研究方向和发展趋势
目前国际免疫学研究主要有三大方面,一是基础免疫学研究,二是临床免疫学研究和应用,三是免疫学技术的研发与应用。综合来看,基础免疫学研究主要包括以下十个方面:①免疫系统的形成机制、免疫器官与免疫细胞的组成,以及不同种类免疫细胞和亚群的形成过程与相互之间的调控机制;②抗原的结构特性与免疫识别、免疫应答的关系与机制;③免疫细胞感受外界危险信号、识别抗原的物质结构基础;④天然免疫应答的细胞与分子机制;⑤获得性免疫应答的细胞与分子机制;⑥免疫耐受及免疫负向调控的方式与机制;⑦免疫效应分子的结构、功能与作用机制;⑧免疫细胞的功能调控及其信号转导机制;⑨免疫细胞的迁移触发、迁移过程与定居机制;⑩免疫记忆细胞形成及其分子机制。临床免疫学涉及的内容非常广泛,分支学科也很多,主要围绕着重大疾病,如感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及器官移植排斥等的发生发展机制、诊断、病程的动态观察、预后分析、治疗和预防措施等开展应用性研究。具有挑战性的研究内容也很多,例如,肿瘤免疫逃逸机制与肿瘤防治新方法的设计,以及如何提高肿瘤早期特异性免疫诊断,急性感染与免疫病理现象,慢性感染与免疫耐受现象(例如,机体为何不能有效识别、清除HBV感染而导致慢性乙型肝炎),器官移植排斥的预警与免疫药物以及免疫调节控制,自身免疫性疾病的诊断与治疗等。免疫学技术的发展与应用在促进基础免疫学理论研究的同时,也极大地推动了生命科学、生物技术及其产业化的发展,特别是疫苗、单克隆抗体、基因工程细胞因子、免疫抑制药物、免疫细胞治疗等的发展与应用,为生命科学和人类健康做出了巨大贡献,也催生了具有巨大市场效益的生物技术产业。
近10年来,免疫学研究的一个重要发展趋势是整合与细化,整合之处在于将免疫学理论和实践与其他生命科学与医学学科的技术及科学问题相交叉,创建新的基础免疫学理论和新型免疫学技术,并应用免疫学理论与方法去研究和解决生物医学领域中的重大难题,特别是各种组学技术的应用,使得系统生物学的理念融合入免疫学,从而推动了系统免疫学的发展与应用;细化之处在于基础免疫学、临床免疫学、免疫学技术这三个方面的研究继续向纵深发展,使得人们对于免疫学的细胞、分子、基因网络的组成和动态调控以及作用机制的认识更加细微与精密。
目前,国际免疫学的发展趋势体现在如下几个方面:①基础免疫学研究更加深入和广泛:对免疫学的研究从原来的细胞水平深入到分子和基因水平,免疫学理论得到极大的丰富和完善,与此同时也产生了很多新的研究方向和热点,如免疫细胞的分化发育、功能调控及其信号机制,新型免疫细胞及其亚群的发现,其功能的调节作用,抗原识别、活化的分子结构基础,免疫特异性应答的细胞与分子机制,包括免疫效应细胞与效应分子杀伤靶细胞的机制、免疫调节(负性)的方式及其机制,自身免疫耐受的机制,免疫记忆细胞形成与分子机制,新型免疫分子的发现、其结构和功能等。②临床免疫学在临床的价值更为明显,免疫学几乎已经渗透到临床的每一个角落,采用免疫学技术和方法研究和治疗疾病越来越得到重视;目前,临床免疫学研究的热点包括应用基础免疫学的研究成果阐释肿瘤、感染、移植排斥、自身免疫性疾病等重要疾病的发生机制,特异性预防和治疗措施的建立,新型疫苗的研制、开发,以及免疫相关生物制品的研制和应用等。③基础免疫学与临床免疫学结合更加紧密,基础研究与应用研究并重且紧密结合,两者相辅相成:基础免疫学为众多免疫相关性疾病的发生机制和治疗的研究提供理论指导,如HIV疫苗研制、类风湿关节炎的靶向药物治疗等。另一方面,临床免疫学的实际问题为基础免疫学发展提出了新的需求,如Tetramerpeptide检测CTL技术的发展、人源化实验性动物模型的建立,以研究人类疾病的发病。④免疫学与其他多种医学与生命学科的交叉融合,极大地促进了免疫学和其他学科的发展,如免疫学和生物信息学、结构生物学的交叉在分子、原子水平研究免疫识别、免疫反应的发生机制,这些都有助于从基础免疫学方面加深对经典免疫学理论的认识,这种交叉也带动了多种其他医学与生命学科的发展。免疫学的基础理论研究更加拓宽和丰富,对免疫系统如何在复杂的内、外环境之中有序运作也有了更加深入的认识;对如肿瘤、自身免疫病、慢性感染等重大疾病的发病机制的阐释及治疗策略的革新取得了长足进展;免疫学在生命科学中的重要意义日益彰显;与其他各生命学科的交叉、融合逐渐深入,研究的思路和视角更加系统和宏观。
二、免疫学研究的前沿热点
目前免疫学研究的热点很多,本章仅简要介绍十三个方面的前沿热点,前面五个方面的热点涉及免疫学基本性关键科学问题,随后的四个方面内容涉及学科交叉中的免疫学研究热点。接着介绍了临床免疫与转化医学研究,包括肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等疾病防治以及肠道相关免疫、干细胞应用等免疫转化研究。后面三个方面介绍了备受生物医学领域关注的新技术体系在免疫学研究领域的应用。
(一)免疫识别的结构基础与相关活化及调控机制研究
免疫识别是诱导和触发机体免疫应答或免疫耐受的重要免疫过程,是免疫学研究中的一个关键科学问题。
以往人们对于获得性免疫(T细胞与B细胞)中免疫识别的细胞与分子机制研究较多,例如不同抗原结构(包括蛋白抗原、多肽抗原、表位抗原结构)对免疫识别的影响。目前,对抗原结构的研究多集中于抗原表位(epitope)的结构特点。根据其识别特征的不同,抗原表位分为B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位、MHC限制表位等;根据其免疫效应的差异,抗原表位分为免疫保护性表位和非免疫保护性表位,后者包括毒性或抑制性、优势非中和性、病理与自身反应性表位;根据免疫刺激能力的不同,抗原表位分为优势表位和弱势表位。同一抗原分子中存在着多种不同的抗原表位,且不同表位之间存在着相互作用,弱势表位在一定条件下可转变为优势表位;不同抗原表位的组合可决定免疫应答的性质、强度及持续时间。这些研究为新型分子疫苗的设计和研发提供了理论基础。
免疫识别研究领域另一个重要的热点是天然免疫(innate immunity)的识别机制,主要研究抗原提呈细胞(包括树突状细胞、巨噬细胞),以及NK细胞、粒细胞等如何识别病毒、细菌等病原体感染以及随后触发的免疫与炎症过程及其调控。天然免疫识别由病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)及其受体介导,而PAMP受体属于模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)家族,PRR家族成员还包括 Toll样受体家族(Toll-like receptor,TLR)、维甲酸诱导基因Ⅰ样受体家族(retinoic-acidinducible gene I-like receptor,RLR)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor,NLR)等,PRR的结构基础及调控机制是免疫识别领域另一研究热点。
1.TLR信号通路活化及调控机制
TLR在识别PAMP中起重要作用,是一种重要的模式识别受体,主要表达于巨噬细胞和DC表面,构成机体抵御病原体入侵的第一道屏障。TLR是一种进化上高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白,目前发现并克隆了十多种哺乳动物的TLR分子,它们选择性识别不同的PAMP分子,如TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9分别识别病原微生物的LTA、dsRNA、LPS、flagellin、CpG基序。目前已报道了11种人TLR和13种小鼠TLR。根据不同的亚细胞定位,TLR可以分为细胞膜表面TLR(主要包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6等)和细胞内TLR(目前发现的有TLR3、TLR7/8、TLR9)两大类。TLR与各自配体结合后可通过大致相似的信号转导途径诱导目的基因的活化表达,但不同TLR因其结合相对特异的接头蛋白而激发相应的生物学效应。目前公认的TLR信号通路根据接头蛋白的不同分为MyD88(myeloid different factor 88)依赖和TRIF依赖(或者称为MyD88非依赖)两条不同的信号转导途径。大部分的TLR与特定的配体结合后,通过TLR胞内段的TIR结构域募集同样含有TIR结构域的接头分子MyD88,随后通过MyD88的死亡结构域(death domain,DD)与IRAK(IL-1 receptor-associated kinase)家族蛋白分子结合成为信号转导复合物。该复合物继续募集并活化下游TRAF6分子,最终通过激活MAPK和NF-κB等转录因子,激活促炎细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达。然而,TLR3和TLR4还存在着另一种MyD88非依赖信号转导途径,即通过接头蛋白TRIF或者TRAM募集TRAF3和TRAF6,然后分别通过TBK1和TAK1诱导NF-κB的晚期活化和IRF-3的核转位,调控炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达。TLR不仅启动天然免疫应答,控制炎症反应的性质、强度和持续时间,而且可以通过上调抗原提呈细胞表面的共刺激分子和MHCⅡ分子的表达,促进DC成熟,调节获得性免疫应答的强度和类型,成为连接天然免疫和获得性免疫应答的枢纽。
正常情况下,TLR受到很多正向或者负向信号通路的调控,使之维持在适度的活化水平,TLR信号过度活化或活化不足都会导致机体功能异常和(或)疾病的发生。目前已经发现TLR信号通路的很多负向调控分子,如短片段的MyD88s可以和MyD88竞争性结合TIR结构域,阻抑下游信号;STAT1活化后的SOCS3可同时抑制TLR4通路中MyD88依赖的TRAF6活化和MyD88非依赖的TRAF3活化;磷脂酶SHP2则抑制TLR4-TRIF通路中TBK1的活性;E3连接酶TRIAD3A通过促进TLR自身的泛素化抑制TLR信号。同时,作为TLR信号转导通路中的正向调控分子,酪氨酸激酶Btk增强TLR4和TLR9信号通路中NF-κB p65亚基的磷酸化,促进下游基因的表达[9]。
近来,对于TLR通路的正向调控机制认识更为深入。例如,Pin1(Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase 1)可被TLR7及TLR9的激动剂诱导活化,并能与IRAK1相互作用,促进IRF-7的活化,进而诱导Ⅰ型IFN产生[10]。抗病毒蛋白Viperin在pDC(plasmacytoid dendritic cell)中被TLR7或TLR9激活后,能与IRAK1及TRAF6相互作用,促进IRAK1泛素化,进而介导IRF-7的活化及其下游Ⅰ型IFN的产生[11]。转录抑制子DREAM能够结合到去泛素化酶A20基因的下游调控元件(downstream regulatory elements,DRE)区域,抑制A20基因表达,从而促进TLR4及TNF介导的NF-κB活化及内毒素休克[12]。这些研究进一步揭示了TLR受体介导的炎性细胞因子和Ⅰ型IFN产生途径的调控机制,并为相关疾病的治疗提供了新的思路。
TLR信号通路的负向调控机制一直是免疫学研究的热点。研究者新近报道了数个TLR信号负调蛋白,如孤儿核受体SHP(short heterodimer partner)、RIP140、p110δ等。SHP能通过抑制NF-κB的p65亚基的活化以及TRAF6的多聚泛素化,抑制TLR信号触发的炎性细胞因子产生,揭示了代谢相关分子与免疫系统的密切关系[13]。另一个能抑制内毒素休克的蛋白是RIP140(receptor-interacting protein 140)。LPS刺激诱导Syk激酶磷酸化RIP140,促进RIP140与NF-κB的RelA亚基相互作用,继而招募E3连接酶SCF降解RIP140,从而抑制炎性细胞因子基因表达,参与内毒素耐受的发生[14]。此外,PI3K的p110δ异构体诱导TLR4内化,与细胞膜上的TIRAP分离,并引起TIRAP降解。p110δ失活可增强TIRAP信号、促进炎性细胞因子产生,并抑制TRAM信号和抗炎细胞因子(IL-10、IFN-β)的分泌[15]。
TLR和RLR信号通路在识别病原体感染,激活天然免疫及后续适应性免疫应答过程中都发挥重要作用,然而对不同的PRR之间如何相互作用以调控适应性免疫应答的分子机制尚不了解。研究显示,RLR活化选择性抑制Il12b(编码IL-12p40)转录,而TLR活化则能促进Il12b表达。RLR信号促进转录因子IRF-3结合Il12b启动子区域,从而干扰TLR信号触发的Il12b转录活化,进而抑制TLR诱导的Th1和Th17型免疫应答。该研究揭示了抗病毒天然免疫应答对细菌感染的抑制作用及机制,对临床感染性疾病发病机制及干扰策略的认识提供了新的视角[16]。
2.NLR信号通路活化及调控机制
近期的研究表明,在天然免疫反应中除了TLR起重要的识别作用外,其他类似的模式识别受体还包括识别胞内细菌等感染的NLR(NOD-like receptor),不同的NLR识别相应的病原体,激活下游caspase-1,通过caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行剪切,从而释放大量的IL-1β和IL-18[17,18]。NOD2是NLR家族中的重要一员,之前的研究认为NOD2是重要的胞内识别细菌的PRR,能识别细菌壁的主要成分PGN,以及其最小的免疫活性单元MDP,并通过下游的RICK蛋白活化NF-κB和MAPK,从而触发抗细菌免疫和炎症反应。NOD2也能识别胞内病毒ssRNA,通过结合线粒体上的MAVS,激活IRF-3,促进IFN-β产生,参与机体抗病毒免疫,这补充了以往对于NLR仅参与抵抗胞内细菌感染的认识[19]。研究证明NOD2在抗病毒反应中是必需的,这一结果在NOD2缺陷小鼠的肺泡巨噬细胞、骨髓来源巨噬细胞和MEF中得到了进一步证实。在ssRNA和RSV刺激早期,细胞中NOD2的表达既显著上升,也佐证了其在抗病毒反应中的重要性。随后发现胞质中的NOD2识别并结合了RSV来源的ssRNA,活化后的NOD2通过下游MAVS分子活化IRF-3,产生干扰素,进而发挥抗病毒作用,其中,NBD和LRR结构域在NOD2与MAVS的相互作用中是必需的。最后,体内试验发现NOD2敲除小鼠干扰素的产生显著下降,RSV病毒载量增加,肺部病理变化加重,感染后小鼠存活率显著降低。这一发现将NOD2从过去认为的胞内细菌识别受体重新定位为类似RIG-I的病毒ssRNA的胞内识别受体。研究者认为NOD2在病毒感染的早期发挥作用,随后才由RIG-I发挥作用。NOD2这一新功能的发现将对呼吸道疾病尤其是目前H1N1病毒感染的预治和研究有一定的指导性作用。
NLR家族蛋白作为一类重要的PRR,能识别病原体并激活天然免疫应答。NLR在控制TLR及RLR触发的炎性细胞因子产生和干扰素产生过程中起着重要的调控作用。LPS刺激能迅速诱导NLRX1蛋白泛素化,并与TRAF6解离,进而与IKK复合物相互作用,最终抑制TLR触发的NF-κB活化[20]。NLRX1不仅能够负向调控LPS诱导的TRAF6-NF-κB信号通路,还能够调节流感病毒诱导的RIG-I-MAVS通路,进而抑制Ⅰ型IFN介导的抗病毒免疫[21]。NLRP4能招募E3连接酶DTX4降解TBK1激酶,进而负向调控dsRNA或DNA诱导的Ⅰ型IFN反应[22]。NRLP6能抑制TLR介导的MAPK及NF-κB活化,并抑制机体抵抗单核细胞增生李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌感染[23]。NLRC3能通过调控TRAF6和NF-κB活化负反馈调节TLR信号[24]。NLRC5能抑制TLR及RLR介导的NF-κB活化[25]。NALP12能负向调控肿瘤非经典NF-κB通路,进而抑制肿瘤发生及肿瘤局部炎症反应[26]。NLRX1能和线粒体蛋白TUFM(mitochondrial Tu translation elongation factor)相互作用,负向调控病毒感染引起的Ⅰ型IFN产生,同时促进自噬[27]。这些研究对深入了解PRR家族成员间的互相调节机制以及NLR参与免疫应答调控、维持免疫耐受具有重要意义。
3.RLR信号通路活化及调控机制
另一类受到关注的PPR则是细胞内的病毒RNA识别受体RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5),最新的研究表明RIG-I和MDA5分别识别不同类型的病毒,RIG-I主要识别副黏液病毒,而MDA5主要识别微小RNA病毒[28,29]。当RIG-I/MDA5识别其相应配体后招募含CARD结构域的接头分子IPS-1,最终引起IRF-3/IRF-7以及NF-κB的活化,诱导大量的Ⅰ型IFN的产生,激发机体抗病毒应答。RIG-I对于5'ppp-RNA的特异性识别是保证天然免疫系统对外源性RNA特异性应答的机制之一。RIG-I同样能识别5'双磷酸RNA(5'pp-RNA)进而激活抗病毒免疫应答。这种5'pp-RNA存在于一些病毒当中,而不存在于未感染细胞中,因此,RIG-I对于5'pp-RNA的识别同样是机体鉴别自我及非我来源RNA的重要机制[30]。
与TLR信号通路相似,RIG-I介导的信号通路受到精密调节,以确保适时、适度的抗病毒效应。人类OASL(IFN-inducible oligoadenylate synthetases-like)蛋白能通过与RIG-I共定位发生相互作用,增强RIG-I介导的IFN表达,进而促进机体抗病毒免疫应答[31]。MAVS(mitochondrial antiviral signaling,又称为IPS-1/CARDIF/VISA)是RIG-I、MDA5及NOD2信号通路中重要的接头蛋白,介导下游IRF-3磷酸化及NF-κB活化,诱导Ⅰ型IFN产生。RIG-I与5'-ppp RNA及K63泛素链结合后,诱导MAVS形成庞大的阮病毒样聚合体,活化IRF-3及下游Ⅰ型IFN产生[32]。MAVS蛋白的阮病毒样构象转换能激活并放大抗病毒免疫应答。此外,MAVS蛋白来源于双顺反子mRNA,该mRNA还编码MAVS的剪切变异体miniMAVS。miniMAVS能够拮抗全长MAVS介导的抗病毒免疫效应。该研究揭示了双顺反子mRNA对于抗病毒免疫应答的重要调控作用[33]。
外源性或内源性DNA触发的STING活化是激活天然免疫应答的关键环节,然而STING过度活化会产生免疫损伤。胞内DNA来源的环二核苷酸(cyclic dinucleotide)通过激活丝/苏氨酸激酶ULK1(ATG1),促进STING发生Ser366位磷酸化,抑制IRF-3活化,从而以负反馈的方式抑制天然免疫应答过度活化[34]。
4.新型胞浆DNA受体
以往人们对于RNA识别受体包括膜结合型识别受体(位于内体的TLR3、TLR7)和胞质中的识别受体(RIG-I、MDA-5、LGP2)研究得比较多,而对于DNA识别受体的研究不够深入。其实,人们很早就观察到DNA病毒感染或组织损伤过程中,外源性病原体DNA或自身DNA在胞质内累积,可触发显著的免疫应答和炎症反应,诱导多种炎性细胞因子如IL-1β和干扰素(如IFN-β)的产生,但是,人们对于该现象的具体机制不十分清楚,长期以来仅仅围绕着TLR9开展研究工作。近年来,人们发现了能够识别病毒DNA的新型模式识别受体,例如,DNA依赖的IFN调节因子激活物(DNA dependent activator of IFN-regulatory factors,DAI)、黑色素瘤缺失因子2(absent in melanoma 2,AIM2)、DNA依赖性RNA聚合酶Ⅲ(DNA-dependent RNA polymeraseⅢ,PolⅢ)。
DAI是第一个被发现的能够识别外源性dsDNA的胞质内DNA感应器,可诱导Ⅰ型IFN产生,触发天然免疫反应[35]。但是,DAI基因缺失小鼠在DNA病毒感染之后仍然能够产生Ⅰ型IFN,因此DAI在天然免疫反应中的确切作用有待于进一步研究。AIM2是第二个被发现的胞质内DNA感应器,据最新报道[36~38],AIM2在结合胞内DNA之后,可通过与含有CARD的凋亡相关微粒样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)结合,形成炎性复合体,活化NF-κB和caspase-1,促进促炎因子的分泌。此研究提示AIM-2是一个重要的下游形成炎症复合物的胞内DNA感应器,然而,该效应并不能直接诱导IFN-β的产生。AIM2针对不同病原体的识别机制尚不明确,Nature Immunology同期的两篇的报道针对这一问题进行了深入探索。弗朗西斯菌经 DNA受体cGAS识别后能诱导干扰素诱导基因(interferon-stimulated gene,ISG)GBP2和GBP5的表达,这两种GBP蛋白进而攻击胞内细菌使其溶解并释放DNA供AIM2识别,活化下游caspase-1并引发细胞炎症坏死[39,40]。这提示了一种受干扰素诱导的宿主GBP通过释放胞内菌DNA进而活化AIM2的新模式。此外,RNA多聚合成酶Ⅲ(PolⅢ),能够识别细菌及病毒释放的存在于胞内的poly(dA:dT)DNA,并将其转化为5'-ppp dsRNA,继而经由RIG-I途径诱导IFN-β的产生,抑制PolⅢ可以抑制由DNA转染或者DNA病毒感染所导致的IFN-β产生[41,42]。但是,阻断此类分子之后并不能完全阻断对病原体生长的抑制作用,提示体内还存在尚未被发现的能够直接识别外源DNA的受体[43]。
胞浆DNA受体IFI16(Gamma-interferon-inducible protein 16)能与病毒DNA基序直接结合,并通过招募STING(stimulator of interferon gene)激活下游IRF-3及NF-κB通路,介导IFN-β的产生[44]。有趣的是IFI16和AIM2都属于PYHIN(pyrin and HIN domain-containing protein)家族成员,且二者都能识别胞浆DNA,介导IFN-β或IL-1β的产生,提示PYHIN蛋白在胞浆DNA识别中的重要作用。另一个胞浆DNA受体是DDX41。DDX41属于DEXDc(DEAD-like helicases superfamily)家族成员。DC中DDX41能与外源性DNA及STING蛋白结合,并诱导转录因子NF-κB及IRF-3活化,介导Ⅰ型IFN产生[45]。而深入研究发现,IFN诱导的E3泛素连接酶TRIM21能结合并促进DDX41发生K48泛素化降解,从而抑制胞内dsDNA诱导的IFN-β产生[46]。病原体DNA被其受体识别之后一般引起Ⅰ型IFN产生,而Ku70是一个诱导Ⅲ型干扰素IFN-λ1产生的胞浆DNA受体[47]。Pull-down实验表明Ku70能与胞浆DNA结合,下调Ku70表达能阻断IFN-λ1分泌,同时,IFN-λ1的产生依赖于IRF1及IRF-7的转录活化。LRRFIP1被证明是一个能够识别病原体DNA的胞浆DNA受体,能够通过激活β-catenin信号通路活化IRF-3途径,诱导Ⅰ型干扰素的产生,参与抗病毒天然免疫应答[48]。
环GMP-AMP合酶(Cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)是近期发现的一个新型DNA识别分子,能识别并结合胞内DNA,催化cyclic GMP-AMP(cGAMP)合成,激活STING/IRF-3通路,进而促进Ⅰ型IFN产生,启动抗病毒天然免疫应答[49,50]。cGAS是HIV及其他逆转录病毒的胞内识别分子,通过cGAMP/STING途径诱导Ⅰ型IFN产生[51]。cGAS基因缺陷会抑制DNA感染后成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞分泌Ⅰ型IFN,从而对HSV病毒更为易感。且cGAMP对抗原特异性T细胞应答和抗体生成具有促进效应[52]。dsDNA刺激下,cGAS发生构象转化,形成可接近的催化口袋结构,催化cGAMP形成环G(2',5')pA(3',5')p结构,发挥第二信使功能[53]。以往研究认为只有长度大于40bp的单链DNA(dsDNA)能激活免疫应答,近期的研究对这一观点提出了挑战。研究发现HIV-1病毒来源的含未配对鸟苷翼的短片段DNA(称为Y形DNA结构)能够有效活化DNA受体cGAS,从而诱导Ⅰ型IFN分泌[54]。这种仅含有12到20bp的Y形DNA结构能够高效、特异性地增强cGAS的酶活性,介导机体对HIV-1的识别。
5.新型胞浆RNA受体
近来,对胞浆RNA识别机制的研究有了新的进展。RLR家族成员RIG-I及MDA5,以及NLR家族成员NOD2能识别胞浆RNA,激活抗病毒免疫应答。IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)能识别病毒来源的5'-ppp RNA,发挥抗病毒作用[55]。5'-三磷酸基团(5'-ppp)是病毒RNA被RIG-I识别的结构基础[56],IFIT1能特异性与5'-ppp RNA相互结合,并与IFIT家族的其他成员结合形成庞大的蛋白复合体,介导对病毒侵袭的抵抗作用[57]。此外,DDX1-DDX21-DHX36复合体[58]和DHX9[59]是在髓系DC(myeloid dendritic cell,mDC)中表达的胞浆RNA受体。DExD/H解旋酶家族的三个成员,DDX1、DDX21及DHX36能通过与TRIF蛋白形成复合体,识别胞浆中的dsRNA,进而介导Ⅰ型IFN产生。此外,DExDc解旋酶家族的另一个成员DHX9也能参与识别mDC中的dsRNA。DHX9能特异性识别poly I:C的dsRNA基序,并与 IPS-1(IFN-beta promoter stimulator 1,又称为MAVS/VISA/Cardif)相互作用,进而活化NF-κB及IRF-3通路,并介导Ⅰ型IFN及促炎因子的产生。
不同于其他类型的PAMP,DNA及RNA不仅广泛表达于病原体特别是病毒中,也同时表达于宿主细胞中。天然免疫系统对宿主DNA或RNA的识别与自身免疫性疾病及炎症性疾病密切相关,胞浆RNA受体如何区分外源性RNA及内源性RNA是天然免疫应答的关键环节。例如,RIG-I对于5'-ppp RNA的特异性识别是保证天然免疫系统对外源性RNA特异性应答的机制之一。近期报道阐明了RIG-I识别5'-ppp RNA及dsRNA的结构基础,揭示了病毒RNA活化RIG-I信号途径的分子机制[60-62]。此外,研究发现2'-O-核糖甲基化(ribose 2'-O-methylation)是天然免疫系统区分自身及外源RNA的结构基础。在高等真核生物mRNA及许多病毒RNA中都存在2'-O-核糖甲基化,缺失2'-O-甲基化转移酶的痘病毒及冠状病毒突变体对IFN以及IFIT蛋白的抗病毒效应更为敏感,提示病毒RNA的2'-O-核糖甲基化能帮助病毒逃避宿主IFIT1介导的抗病毒效应[63]。缺失2'-O-甲基化转移酶的冠状病毒突变体能依赖RNA受体MDA5诱导更高水平的Ⅰ型IFN,因此病毒mRNA的2'-O-核糖甲基化是一个病毒辅以逃避MDA5依赖的Ⅰ型IFN反应的结构基础,高等真核生物mRNA的2'-O-核糖甲基化是机体区别自身及外源RNA的分子基础[64,65]。
6.其他类型PRR介导的免疫识别
体内蛋白质大多以糖基化的形式存在,多糖的免疫识别具有重要的免疫学意义,对于机体如何识别多糖分子的研究近年来也取得了重要进展。除了人们熟知的能够识别多糖分子的CR3和清道夫受体之外,C类凝集素受体(C-type lectin receptor,CLR)家族成员分子Dectin-1也能够识别β-葡聚糖,在介导吞噬和抗真菌感染中起重要作用;此外,Dectin-2也参与抗真菌天然免疫。虽然已经发现Syk依赖性的Dectin-1信号转导在天然免疫中起重要作用[66~67],但Dectin-1等非TLR所触发的下游信号转导机制还不是十分清楚,而且健康机体也存在一定水平的抗多糖抗体,对于其生理与病理意义还不是十分清楚。
转录因子芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)通过识别环境中的有毒物质诱导机体产生解毒酶并调控免疫细胞分化和功能。近期研究显示AhR能识别细菌的色素组织,进而降解细菌的毒力因子并调节细胞的细胞因子及趋化因子产生,从而增强机体抗细菌免疫应答。这揭示了一个全新的模式识别受体——AhR及一种全新的病原相关分子模式——细菌色素[68]。AhR还是介导内毒素耐受的关键因子[69],并能抑制皮肤炎症[70]。
天然免疫中上述PPR的亚细胞定位,在不同细胞亚群中的表达,识别病原体的种类、方式及其效应机制,尤其是在宿主免疫防御、炎症和疾病中的作用尚需深入探讨,不同的天然免疫识别受体之间存在着交叉或者互补的信号转导通路,提示它们可以感受病原微生物的危险信号、参与识别自我与非我,并且能相互协同或互相调节以形成调控网络,在天然免疫中发挥独特的功能。
此外,一个值得思考的问题是否存在PRR非依赖的天然免疫启动机制?病毒或胞内菌感染后,结合病原的抗体分子被TRIM21识别后能催化K63多聚泛素链形成,刺激NF-κB、AP-1、IRF-3、IRF5及IRF-7信号通路,诱导炎性细胞因子产生及抗病毒免疫应答。这种TRIM21与抗体的相互作用体现了一种PRR非依赖的天然免疫激活机制[71]。对TRIM21-抗体复合体触发的胞内信号传递及其与其他PRR信号通路的交叉调控机制的深入研究将为机体抗病原体天然免疫应答机制提供全新的阐述。
(二)免疫系统发生与免疫细胞发育的研究
淋巴细胞的分化发育与成熟机制一直是基础免疫学的重要研究内容,包括T细胞的胸腺内发育(也包括胸腺外发育)、B细胞发育不同阶段的特征、抗体产生与类别转换等。此外,有关髓系免疫细胞分化发育的机制研究近年来也有了很大突破,包括DC、巨噬细胞及其亚群形成等。
1.T淋巴细胞发育及活化调控机制
胸腺是T淋巴细胞分化成熟的场所。多能造血干细胞在骨髓中分化为淋巴样祖细胞,输入胸腺,经历CD4-CD8-(双阴性,DN)、CD4+CD8+(双阳性,DP)、CD4+CD8-及CD4-CD8+(单阳性,SP)三个阶段以及阳性选择、阴性选择后,发育为表达功能性TCR、具有自身MHC限制性及自身免疫耐受的成熟T细胞,然后进入外周介导适应性免疫应答。胸腺分离的早期T细胞系祖细胞仍然保留B细胞及髓系细胞分化潜能,但不具有巨核细胞-红系分化潜能,提示T细胞谱系的定向发育过程的发生可能从骨髓推移到了胸腺[72]。此外,转录因子Lyl-1也参与T淋巴细胞发育,Lyl-1缺陷导致淋巴多能祖细胞(lymphoid-primed multipotent progenitor,LMPP)、共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitor,CLP)及早期T细胞系祖细胞(early T lineage progenitor,ETP)大量减少,且Lyl-1缺陷的ETP和胸腺祖细胞在CD4-CD8-DN2分化阶段大量凋亡,分化和增殖也受损,进一步研究发现Lyl-1介导的T淋巴细胞发生部分依赖于其转录靶点Gfi1[73],因此Lyl-1可通过影响T细胞系祖细胞生成参与白血病的发生。
胸腺细胞分化发育过程中能与胸腺上皮细胞表面抗原肽-MHCⅠ/Ⅱ类分子复合物以适当亲和力结合的胸腺DP细胞继续发育成SP细胞,不能结合或结合过强结合的DP细胞则凋亡,此为胸腺的阳性选择,使T细胞获得自身MHC限制性。电压门控Na+通道(voltage-gated Na+channel,VGSC)对CD4+T细胞阳性选择具有关键作用,VGSC抑制剂能抑制Ca2+进入CD4+CD8+DP细胞,进而影响CD4+T细胞阳性选择,而通过shRNA干扰VGSC表达能抑制CD4+T细胞阳性选择[74]。经历阳性选择后的SP细胞与胸腺DC、巨噬细胞表面抗原肽-MHCⅠ/Ⅱ类分子发生高亲和力结合者被克隆删除,此过程称为阴性选择,以保证外周T细胞不含有自身反应性T细胞,然而这一过程的具体分子机制尚不清楚,有研究发现阴性选择依赖CD28共刺激信号,缺乏CD28共刺激信号会导致自身反应性胸腺细胞躲避克隆删除,而分化成为失能的CD4-CD8-DN细胞,迁移入小肠,形成CD8α+上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)[75]。
发育成熟的T细胞输入外周T淋巴细胞库,依赖CD3-TCR复合体接受抗原刺激,激活胞内信号转导途径促进T细胞活化。TCR信号活化后,TCR-CD3复合物与其辅助受体(CD4/CD8)簇化,促进Lck簇化并磷酸化TCR和CD3胞内段,然后激活下游ZAP-70分子磷酸化,进而招募并磷酸化接头蛋白LAT,启动T细胞活化信号。TCR-CD3复合物包含大量的功能性ITAM基序,而这一现象的分子机制及生理意义并不清楚。含少量功能性ITAM的TCR-CD3复合体能够介导TCR触发的细胞因子分泌,而含大量功能性ITAM的TCR-CD3复合体可以经Vav1/Notch1/c-Myc通路介导TCR触发的细胞增殖[76],这说明T细胞分泌细胞因子和增殖所需的信号通路有所不同,且受ITAM磷酸化水平调控。此外,组成型激活的Lck的胞内分布受其构象状态调节。当Lck呈开放、活化型构象时诱导Lck簇化,而关闭、活化型构象时则相反[77]。这是一种在TCR早期活化过程中对信号分子分布的内源性调节机制,有助于深入了解TCR信号激活及调节的具体机制。囊泡蛋白VAMP7是介导包含Lat的囊泡转运至TCR活化位点的关键蛋白。VAMP7能够调控Lat磷酸化以及TCR-Lat信号复合体的形成,最终活化T细胞[78]。Regnase-1(又称为Zc3h12a)分子可通过调控免疫细胞活化,抑制自身免疫性疾病的发生,还能抑制巨噬细胞中TLR触发的Il6和Il12b的mRNA的3’UTR区[79],并能在TLR刺激下被IKK复合体磷酸化而降解,从而提高Il6的mRNA水平[80]。Regnase-1还能抑制T细胞效应基因包括c-Rel、Ox40及Il2等mRNA的3’UTR区;TCR信号能促进Malt1降解Regnase-1,从而解除其对T细胞活化的抑制效应[81]。因此,静息T细胞中Regnase-1能控制T细胞活化,抑制自身免疫性疾病的发生,而在TCR信号活化后Regnase-1被Malt1降解而确保有效的TCR信号活化。
肠道CD4+T细胞的免疫调节功能对于机体维持对肠道病原菌的免疫耐受十分重要,肠道T细胞失衡可能诱导炎症性肠病、肠道肿瘤等多种疾病的发生发展。目前,大量研究集中于肠道T细胞的分化及功能特点,及其在肠道免疫稳态及肠道炎症调控中的作用机制。肠道CD4+T细胞丢失CD4谱系特异性转录因子ThPOK而表达CD8谱系特异性转录因子,失去向Th17细胞分化及介导肠炎的特性而获得杀伤性T细胞的特点,这一发生在外周的特殊的细胞分化过程依赖TGF-β和维甲酸(retinoic acid,RA)[82],这提示了CD4+T细胞在外周向CD8+T细胞的谱系重定向的特性[83]。这对传统的外周T细胞分化理论提出了挑战,并揭示了肠道微环境通过抑制T细胞向辅助性T细胞分化而重定向为CD4+CD8α+杀伤性T细胞以维持肠道免疫耐受的潜在机制。
CD8+T细胞能通过细胞直接接触的方式或分泌穿孔素、颗粒酶等细胞毒性颗粒杀伤病原体。而记忆性CD8+T细胞能够在感染局部直接识别再次相遇的抗原,分泌IFN-γ,促进局部大量炎性细胞因子分泌,并迅速招募循环中的记忆性CD8+T细胞趋化至感染局部[84]。提示微生物感染局部的记忆性CD8+T细胞能够以一种不同于循环中记忆性CD8+T细胞的方式快速应对再次相遇的抗原,这一发现为疫苗设计提供了新的思路。
淋巴细胞活化过程伴随胞内代谢分子的快速变化。免疫细胞如何调控胞内的代谢通路、影响炎症部位的代谢活性以及代谢信号如何影响免疫细胞活化是目前免疫学研究的又一热点。抗原刺激及TCR信号活化后,T细胞上调其胞内氨基酸转运蛋白Slc7a5,介导T细胞摄取大型中性氨基酸(large neutral amino acid,LNAA),继而通过mTORC1活化和c-Myc的表达促进T细胞扩增及分化[85]。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein,SREBP)能够促进CD8+T细胞增殖过程中的脂质合成,从而对CD8+T细胞克隆增殖活化发挥关键作用[86]。而效应记忆性CD8+T细胞(effector memory CD8+T cell)在TCR及共刺激信号或同源抗原刺激后迅速经 Akt和 mTORC2途径活化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),促进糖酵解,诱发快速大量的IFN-γ分泌[87]。随着感染或疾病的进展,CD8+T细胞的细胞毒杀伤功能会逐渐减弱,否则会导致不必要的免疫损伤。肿瘤抑制基因von Hippel-Lindau(VHL)通过抑制缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)的表达,进而控制细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)中关键性转录因子及效应分子的表达,抑制慢性感染中CTL介导的免疫病理损伤[88]。
2.B淋巴细胞发育及功能成熟
B细胞是机体适应性免疫应答的重要效应细胞,通过产生抗体介导体液免疫应答;B细胞缺陷导致一系列原发性免疫缺陷病。B细胞在骨髓中经历pro-B细胞、pre-B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞(初始B细胞)等阶段发育成熟,进入外周。这个过程受E2A、EbF1及Pax5等转录因子及IL-7及Flt3配体(Flt3L)等的共同调控[89]。翻转酶ATP11C在早期B细胞发育中发挥关键作用[90,91]。小鼠X染色体连锁的ATP11C突变导致B细胞发育障碍。Atp11c突变小鼠pre-pro-B细胞数目正常,而pro-B细胞及pre-B细胞数目进行性减少。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)正常情况下定位于细胞膜内叶,以提供信号蛋白的锚定位点,而PS外翻常见于细胞凋亡情况下。翻转酶ATP11C参与控制PS定位于细胞膜内叶。这揭示了磷脂活动与B细胞发育的内在联系,为人类原发性免疫缺陷病治疗带来新的研究方向。CD10是人类淋巴系细胞的标志之一,骨髓中有一群造血干细胞来源的CD10-CD62Lhi祖细胞具有B细胞定向潜能,可能是骨髓中淋巴细胞发育的最早阶段[92]。此外,pre-B细胞中IL-7R与PI(3)K和Akt激酶偶联,抑制IL-7信号能上调转录因子Foxo1和Pax5,进而活化pre-B细胞基因如Rag1、Rag2和Blnk;Blnk通过Syk进一步促进pre-BCR信号及Ig轻链重排,并拮抗Akt活化而进一步促进Foxo1、Pax5募集。因此,控制IL-7信号将通过这一正反馈通路触发pre-B细胞分化[93]。
转录因子E2A、EBF1和Foxo1对B细胞谱系分化发挥调控作用,将定向pro-B细胞转移至Rag2-/-Il2rg-/-小鼠中并条件性敲除Ebf1基因后,定向pro-B细胞中转录因子Id2和TCF-1表达上调,并分化为发生VDJ基因重排的固有淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)和T细胞。因此EBF1能通过抑制特定谱系分化转录因子的表达,促进及维持B细胞定向分化[94]。此外,转录因子Ikaros能特异性控制B细胞的早期发育。转录因子Ikaros通过作用于相关基因的调控元件,活化pre-BCR信号传导相关基因,而对抑制pre-BCR信号传导的相关基因则起到抑制作用[95,96]。在淋巴系祖细胞中,染色质重塑因子Brg1决定了B细胞的命运[97]。Brg1在定向祖B细胞中,调节Ig轻链基因位点的收缩,控制c-Myc基因表达,增加B细胞谱系转录因子对增强子的可接近性。另外转录抑制子Bach1和Bach2在共同淋巴系祖细胞阶段通过抑制髓系细胞分化进而促进B细胞分化[98]。
进入周围淋巴器官的静息B细胞在抗原诱导下激活,与滤泡样树突状细胞(FDC)及滤泡辅助T细胞(Tfh)组成生发中心。生发中心B细胞经历体细胞高频突变和抗体类别转换,携带BCR与抗原高亲和力结合者被阳性选择而分化成为分泌不同种类Ig的浆细胞,或分化为记忆B细胞,介导体液免疫应答。c-Myc是与细胞代谢和增殖密切相关的转录因子,然而处于快速分裂的生发中心B细胞却不表达c-Myc。c-Myc在一小群生发中心明区B细胞上表达,表达IRF-4,并与FDC及T细胞相互作用,对生发中心的形成和维持发挥关键作用;而高度增殖的暗区B细胞因受Bcl-6抑制不表达c-Myc,此研究为生发中心选择及淋巴瘤发病机制的研究提供了重要线索[99,100]。转录因子Bcl-6通过作用于B细胞及T细胞促进GC生成,并对巨噬细胞发挥调控作用。Bcl-6的BTB结构域突变后,B细胞增殖和存活障碍,GC生成及抗体亲和力成熟过程受阻,然而Tfh分化和功能及其他T辅助细胞功能不受影响,Bcl-6对炎症反应的抑制作用亦不受影响。因此,Bcl-6在不同谱系细胞中依赖不同的机制发挥作用[101]。
B细胞在生发中心经过Ig类别转换形成分泌各种类别抗体的浆细胞和记忆细胞,包括IgM、IgG、IgA、IgE等,对体液免疫中的抗体多样性发挥关键作用。Ig类别转换受Th细胞及多种细胞因子的调控。DNA断裂能诱导活化胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)磷酸化及AID与核酸内切酶APE1的相互作用,而AID磷酸化进一步放大DNA断裂。因此,DNA断裂以正反馈的方式调控抗体类别转换,促进体液免疫应答[102]。IgE在过敏性疾病中发挥重要作用,一般认为IgE+B细胞生成要经历IgG1+中间细胞阶段,而IgE+记忆B细胞也存在于IgG1+记忆B细胞中。而最新报道对这一观点提出了挑战。研究者应用IgE-GFP报告基因小鼠证明,IgE+细胞来源于生发中心IgE+中间阶段,并最终形成IgE+记忆B细胞和浆细胞,这是一种全新的IgE转换及记忆形成的机制[103]。TBK1激酶对IgA类别转换具有负向调控作用,特异性清除B细胞中的TBK1可导致IgA过度增加及肾脏病变。TBK1通过磷酸化并降解NIK(NF-κB-inducing kinase)进而抑制非经典NF-κB信号通路[104]。
近期研究还从细胞骨架结构、自噬以及细胞间相互调控等多个角度深入探索了B细胞活化的调控机制。细胞骨架相关适配蛋白Nck与BCR直接结合,招募BCAP至BCR部位,调控PI(3)K-Akt通路,促进B细胞存活和增殖[105]。自噬相关蛋白Atg5对浆细胞分化及B细胞中Blimp-1表达及抗体分泌发挥关键作用。这提示自噬对浆细胞生成及体液免疫发挥重要的调控作用[106]。出生后粘膜细菌定植诱导中性粒细胞聚集于脾脏边缘带(marginal zone,MZ)外周,诱导MZ B细胞发生Ig类别转换、体细胞高频突变并产生抗体。这一过程依赖细胞因子BAFF、APRIL及IL-21。中性粒细胞缺乏患者MZ B细胞缺乏,且在T细胞非依赖抗原刺激后产生Ig减少,提示中性粒细胞通过与MZ B相互作用,参与抗微生物Ig形成[107]。
虽然B细胞分泌抗体的功能对于机体抗病原体免疫应答至关重要,但B细胞也可以不依赖抗体而发挥抗病毒感染的作用。在保留B细胞而不产生抗体的小鼠中,机体抵抗皮下VSV感染不依赖于抗体产生或细胞适应性免疫应答。相反,B细胞通过表面α1β2作用于巨噬细胞,辅助巨噬细胞产生Ⅰ型IFN,抵抗VSV侵袭[108]。
(三)新型免疫细胞亚群功能与调控机制研究
1.T细胞亚群
T细胞是免疫系统启动特异性免疫应答以抵御外界病原体入侵的核心力量之一,其发挥免疫功能依赖于不同环境下的不同分化与功能状态。自从1986年Mossman和Coffman首次报道了Th1与Th2细胞亚群[109],人们对于T细胞亚群的认识已有了巨大飞跃,近年免疫学界在新型T细胞亚群的发现、分化机制、功能特点及调控机制等方面又有许多令人兴奋的发现。
IL-12及转录因子T-bet诱导Th1型细胞分化,Th1细胞分泌IFN-γ和IL-2,介导抗胞内病原体和病毒免疫应答。高浓度IL-2能抑制Th1细胞的Bcl-6表达;而减弱IL-2刺激则诱导Th1细胞高表达Bcl-6,从而抑制其靶基因Prdm1表达(编码Blimp-1),解除Blimp-1对Cxcr5的抑制,进而诱导Th1向Tfh样细胞分化[110]。因此Th1细胞中Bcl-6/Blimp-1信号通路对其向Tfh样细胞分化发挥调控作用。补体调节蛋白CD46能诱导T细胞表达Notch受体和配体,促进T细胞分泌IFN-γ。CD46缺陷的患者及CD46的配体Jagged1基因突变患者(Alagille syndrome)来源的T细胞表现出Th1型免疫应答受损,表明CD46-Jagged1相互作用可能参与了上述患者体内的反复感染过程[111]。
IL-4和转录因子GATA3能诱导Th2型细胞分化,参与体液免疫及机体抗寄生虫感染。GATA3能与多个Th2型细胞因子基因位点结合,并与Il5启动子结合促进其表达。TGF-β能够抑制Th1、Th2分化,此外,TGF-β还能诱导CD4+T细胞表达转录因子Sox4,Sox4直接结合GATA3以阻碍GATA3与DNA结合,并与Il5启动子结合以阻碍GATA3与其结合,最终抑制Th2分化[112]。肠道线虫感染后,DC和CD4+T细胞可上调趋化因子受体CXCR5的表达,并在CXCL13、B细胞及淋巴毒素的辅助下与Th2细胞产生共定位,提示表达CXCR5的DC及表达淋巴毒素的B细胞对Th2型细胞分化发挥关键作用[113]。此外,哮喘模型小鼠及人呼吸道中可产生大量尿酸(uric acid,UA),参与明矾(alum)及房屋尘螨(house dust mite,HDM)诱导的Th2型细胞免疫应答及过敏反应。UA诱导的Th2型免疫应答不依赖NLRP3炎性复合体,而依赖于经STK(spleen tyrosine kinase)及PI3-K δ途径活化的DC[114]。硅结晶和铝盐也能以NALP3炎性复合体非依赖、PGE2(prostaglandin E2)依赖的途径诱导Th2型免疫应答[115]。
Th17是一类不同于Th1、Th2和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的CD4+T细胞亚群,在自身免疫性疾病中发挥重要作用[116]。Th17细胞一经发现就引起了研究者们的浓厚兴趣,增进了人们对T细胞以及特异性免疫应答的了解。近几年,对Th17的研究进展极其迅速,然而目前还有众多关键性问题尚待解答:Th17细胞同其他Th细胞(包括Treg)之间的关系,它们是来源于共同的前体吗?它们之间是相对稳定的还是可以在一定条件下相互转化?Th17细胞和其他细胞之间表观遗传学的差异是如何形成的以及如何调控?病原体及其产物如何调节Th1、Th17以及Treg的形成?Th17细胞诱导自身免疫性疾病的发病机制关键何在?人们对Th17细胞研究的不断深入和对这些问题的解决,将为感染、自身免疫性疾病及肿瘤的防治等提供有益的帮助。
Th17的分化由TGF-β和IL-6诱导,并由自身分泌的IL-21所加强,此过程依赖于转录因子RORγt的表达[117];另外,STAT3、IRF-4以及RORα也发挥一定的调控作用。Th17形成后上调IL-23R的表达,并且分泌IL-17、IL-17F、IL-21以及IL-22,其存活和增殖依赖于IL-23。细胞因子对于Th17细胞的分化、发育过程有重要的调节作用:IL-1[118]、TNF-α可以促进Th17分化,而IL-4、IFN-γ、IL-27以及IL-25对其有抑制作用。但是,IL-6缺失小鼠中也发现Th17细胞存在,提示体内存在IL-6非依赖的Th17分化途径。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)在IL-23诱导的Th17免疫应答及神经系统炎症中发挥关键作用,IL-23能上调Th17细胞中GM-CSF表达,而GM-CSF在Th17细胞介导的中枢神经系统炎症中发挥关键作用[119~121]。TGF-β1和IL-6诱导的Th17不具有致病性,只有当再加入IL-23信号才能诱导Th17参与自身免疫性疾病的发生;而TGF-β3和IL-6刺激则能诱导高致病性的Th17细胞[122]。
TLR介导的天然免疫信号对Th17分化及活化的调控作用也受到关注。如TLR2信号对于Th17分化、增殖发挥调控作用[123];p38α信号能诱导DC表达IL-6、IL-27及CD86,进而促进Th17分化,参与自身免疫性疾病的发生[124]。浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)经TLR7活化之后可以促进Th17分化及EAE的发病。代谢微环境对Th17的分化、功能也产生重要影响[125,126]。
此外,Th17分化与功能的转录水平的调控机制研究也取得了新的进展。Th1细胞的调控因子T-bet能通过与Runx1(Runt-related transcription factor 1)相互作用进而抑制Rorc转录,最终抑制Th17分化[127]。STAT3和STAT5在调控Th17分化中相互拮抗:STAT3和STAT5共同与Il17a-Il17f基因上多个位点直接结合,IL-2能促进STAT5而限制STAT3的结合,进而抑制Th17分化[128]。另外,转录因子Eomesodermin(Eomes)能抑制Rorc及Il17a表达[129],而TGF-β通过活化JNK进而抑制Eomes活性,在Th17极化条件下,转录因子STAT3和AhR上调Ikaros家族成员Aiolos的表达。Aiolos通过与Il2启动子结合,抑制Il2基因表达,促进Th17分化[130]。
Th17细胞在不同的免疫环境中表现出异质性和可塑性,近期研究深入阐述了Th17分化及发挥功能的特殊机制。Th17细胞根据来源不同分为天然发生 Th17(natural Th17,nTh17)和外周诱导 Th17(inducible Th17,iTh17)[131]。丝/苏氨酸激酶Akt2及其下游mTORC1-ARNT-HIFα信号通路是iTh17发生所必需的,而nTh17细胞发生需要mTORC2信号和Foxo蛋白失活[132]。在派氏淋巴结中,Th17细胞能获得Tfh细胞的表型,从而诱导生发中心B细胞产生IgA,这提示Th17细胞在派氏淋巴结中的可塑性以及其在肠道IgA介导的免疫应答中的重要作用[133]。肠道固有层分布大量Th17细胞,分节丝状菌(segmented filamentous bacteria,SFB)能够调节肠黏膜Th17细胞分化和肠道适应性免疫应答。大多数固有层Th17细胞能识别SFB抗原,而带有SFB抗原特异性TCR的T细胞能够分化为RORγt+Th17细胞[134]。肠道DC通过MHC-Ⅱ依赖的方式将肠道共生菌SFB抗原提呈给肠道固有层T细胞,诱导局部Th17细胞分化[135]。SFB能诱导多种肠道淋巴组织(淋巴滤泡和三级淋巴组织)成熟,进而上调肠道IgA并促进SFB特异性Th17细胞分化[136]。给小鼠小肠植入SFB(segmented filamentous bacterium)可诱导Th17分化,促进小鼠对小肠citrobacter rodentium感染的抵抗及自身免疫性关节炎的发生[137,138]。因此,特定的细菌种类可能能够决定肠道T细胞的分化方向和功能,对认识肠道共生菌诱导自身免疫的机制有重要启示作用。
近年来,对Th17分化及功能的研究较深入,未来的工作需着重揭示更多的调控Th17分化的转录因子、细胞因子及其功能,以及Th17与其他各T细胞亚群间广泛而精细的相互作用,为Th17相关疾病的干预与治疗带来新的思路与视角。
Treg与Th17的分化都依赖于TGF-β,研究发现,抗原激活的初始T细胞向Treg还是向Th17分化取决于TGF-β浓度。低浓度的TGF-β与IL-6协同可促进Th17分化,而高浓度的TGF-β促进Foxp3表达,通过与RORγt的直接结合,抑制Th17形成,且这种抑制作用可以被IL-6、IL-21、IL-23所阻断[139]。目前的研究更正了以往对于T细胞亚群是不可逆的终末状态的观点,特别是发现iTreg(inducible Treg)与Th17的分化方向极具可塑性[140]。维甲酸也可以通过上调Foxp3表达,使分化偏向Treg方向。另外一种配体依赖的转录因子芳香烃受体也调控着Treg和Th17之间的平衡。无论是iTreg还是nTreg(natural Treg),在IL-6、IL-1等细胞因子作用下都可重分化为Th17细胞,此过程中Foxp3的下调依赖于STAT3,而IL-17的表达则依赖于RORγt、RORα和STAT3[141]。缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)在Th17极性条件下被诱导,并通过与RORγt、STAT3及p300相互作用促进Th17分化,同时通过介导Foxp3降解,抑制Treg分化[142,143]。
越来越多的研究证明IL-23/IL-17途径在炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)[144]、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)[145]、过敏性疾病[146],如哮喘,以及病原体感染等的发生发展中发挥重要作用。通过Rag1小鼠的自身免疫性肠炎模型发现,回输RORγt-/-T细胞不能有效诱导肠炎,而回输IL-17A-/-或IL-17F-/-T细胞诱导的肠炎与野生型无异,阻断IL-17A或IL-17F信号后,自身免疫性肠炎明显减轻,说明IL-17A和IL-17F在Th17细胞中的效应是重叠的,可以相互替代[147]。然而,在硫酸葡聚糖钠(dextran sodium sulphate,DSS)诱导的肠炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型中却发现两者的效应不同,其具体原因还有待进一步研究。Th17在GVHD中也有一定功能,在骨髓移植模型中也存在供体来源的Th17细胞,而且IL-17-/-的供体虽对最终存活率没有影响,但能够延迟排斥反应发生的时间。在慢性移植物冠状动脉病模型中,Th1细胞缺陷小鼠中Th17细胞大量增殖,可加速血管病变和移植排斥的发生,表明Th17与免疫相关性疾病的关系尚有很多问题有待深入研究。虽然Th17与许多自身免疫性疾病发病密切相关,但Th17与肿瘤发生的关系知之尚少。有研究报道人类产肠毒素脆弱类杆菌(enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)能够在小鼠肠道内定植,并通过活化Th17促进肠道肿瘤发生,阻断IL-17信号及IL-23R可逆转肿瘤形成,这项发现为研究人类肿瘤防治提供了新的靶点[148]。
近期,滤泡型辅助T细胞(T follicular helper cell,Tfh)正在成为一个新的研究热点。Tfh是一群不同于Th1以及Th2的新型T细胞亚群,表达趋化因子受体CXCR5,定位于淋巴组织的B细胞淋巴滤泡区,通过分泌IL-21促进体液免疫应答[149]。IL-21对于Tfh的分化发育具有关键作用[150],共刺激分子ICOS能够在Tfh及Th17发育过程中调节IL-21的表达[151]。转录因子Bcl-6对于Tfh的分化发育是充分而且必需的,过表达Bcl-6可促进Tfh相关基因表达,而Bcl-6缺失的T细胞则表现出减弱的Tfh发育及生发中心反应。相应地,Bcl-6的拮抗剂Blimp-1则可抑制Tfh发育及抗体的产生。Bcl-6一方面能够结合Th1、Th17相关转录因子T-bet、RORγt的启动子以抑制IFN-γ和IL-17的产生,另一方面通过结合多种可抑制Tfh功能的microRNA,如抑制CXCR5表达的miR-17-92,促进Tfh分化[152~154]。此外,转录因子Foxp1能抑制Tfh细胞的分化,该效应通过抑制IL-21及ICOS信号实现[155];TGF-β通过STAT3和STAT4途径促进人类Tfh分化,且人类Tfh细胞共表达转录因子Bcl-6和RORγt,这也提示了在人类自身免疫性疾病中Tfh细胞和Th17细胞共同出现的可能机制[156];E3连接酶Itch通过促进转录因子Foxo1泛素化降解,对Tfh细胞分化和功能至关重要[157];在病毒感染过程中,STAT3能抑制IFN-I信号,进而促进Tfh细胞而抑制Th1细胞分化[158]。此外,TCF-1可直接结合Bcl-6的启动子区域及Prdm1的5'端调节区域,进而促进Bcl-6表达而抑制Blimp1表达,促进Tfh分化[159,160]。
Tfh的分化发育如何受其他免疫细胞亚群的调控,其中有哪些重要的分子发挥作用是Tfh研究领域的另一个热点。以不同方式阻断CD4+T细胞与活化B细胞之间的相互作用均能完全抑制Tfh的分化,然而进一步提供非B细胞来源的抗原提呈信号即可恢复Tfh的分化,这表明B细胞的抗原提呈功能对Tfh分化的调控作用并不依赖于特异的B细胞信号[161]。此外,浆细胞对Tfh分化及功能具有调控作用,抗原特异性浆细胞能加工并向多种Th细胞提呈抗原,然而却不能诱导T细胞表达IL-21或Bcl-6,甚至能抑制已活化Tfh表达IL-21或Bcl-6。这表明浆细胞通过抑制Tfh分化调控B细胞免疫应答[162]。
最近,科学家又发现了定位于淋巴滤泡的另一群具有调节作用的T细胞,滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cell,Tfr)。Treg细胞可通过调控 T-bet、IRF-4及 RORγt信号负向调节 Th1[163]、Th2[164]及Th17[165]型免疫应答,而最近的研究表明Tfr具有调节Tfh介导的免疫应答的效应。表达CXCR5及Bcl-6的Treg能有效抑制Tfh细胞增殖和生发中心反应,来源于Foxp3+前体细胞,并依赖Bcl-6分化成为Tfr。Tfr的发现深入阐明了T细胞与B细胞相互作用的机制,并为B细胞介导的自身免疫性疾病的治疗及免疫耐受的维持提供了可能的靶点[166~168]。
近来对于分泌IL-21的CD4+T细胞的免疫调节功能的研究受到很大关注。HBV、HCV和HIV等病毒感染一直以来困扰着免疫学家,病毒特异性CTL细胞(cytotoxic T lymphocyte)的衰竭被认为是机体不能有效清除病毒的重要机制——即CTL细胞处于一种功能耗竭的状态,不能增殖及分泌细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α等)或杀伤感染细胞,在这个过程中,如果缺失了CD4+T细胞将导致更加严重的CTL细胞衰竭。在慢性病毒感染中,CD4+T细胞分泌的IL-21能够作用于CD8+T细胞,促进其增殖,维持长期有效的抗病毒免疫[169]。该研究以LCMV感染为模型,比较了野生型和IL-21R-/-小鼠在病毒感染过程中CD8+T细胞的动态变化。结果发现在感染的急性期,两者都能激发有效的抗病毒CTL细胞产生,但是在急性期之后,CTL细胞能够在野生型小鼠中持续存在,而在IL-21R-/-小鼠中其数目却不断减少,且伴随着血清和各脏器中病毒滴度的增加。通过构建野生型和IL-21R-/-嵌合体小鼠,该研究进一步证实IL-21R-/-小鼠病毒特异性CD8+T细胞在感染急性期之后迅速减少,而且这种数目的减少是由于CTL细胞不能增殖,而不是由于细胞凋亡增加。PD-1在CTL表面的表达和IL-10的升高可能与CD8+T细胞的衰竭密切相关,但是在IL-21R-/-小鼠并没有观察到PD-1或者IL-10的表达增加,表明IL-21是一种新的能够抑制T细胞衰竭和控制慢性感染的细胞因子。最后,通过细胞因子染色分析发现分泌IL-21的主要是CD4+T细胞,并且其分泌量随着感染的进程不断增加,正好与IL-21主要作用于慢性病毒感染的后期相吻合。该工作揭示了在慢性感染中CD4+T细胞辅助CD8+T细胞,从而有效控制感染的机制,这将为慢性感染和肿瘤等疾病的治疗提供新的思路。然而,这种分泌IL-21的CD4+T细胞与Th17细胞和Tfh细胞之间的关系还有待于进一步研究。
对于Th9细胞亚群的首次报道见于2008年的Nature Immunology杂志[170,171]。在IL-4和TGF-β诱导下,Th2细胞能重新分化为一群分泌IL-9、能够促进炎症反应的效应性CD4+T细胞,并将之定义为Th9。ETS家族转录因子PU.1对于Th9的发育是必需的,T细胞PU.1缺失的小鼠外周T细胞分泌IL-9的功能降低,并且肺部过敏性炎症较轻[172]。此外,在Th2及Th17细胞分化中发挥关键作用的转录因子IRF-4对于Th9的分化及功能同样是必需的,IRF-4能与Th9细胞中的Il9启动子直接结合[173]。IL-4和TGF-β体外诱导的Th9细胞高表达IL-17RB及CD25R mRNA,CD25可促进Th9细胞分泌IL-9,且过表达IL-17RB可促进IL-4非依赖的、IL-25诱导的Th9分化[174]。共刺激受体OX40信号能诱导Th9细胞分化并促进Th9细胞介导的呼吸道炎症。OX40信号活化能抑制Treg和Th17细胞产生,并活化CD4+T细胞TRAF6,激活下游NIK激酶活性及非经典NF-κB信号通路,促进Th9细胞生成[175]。可以看出,作为一个新型T细胞亚群,Th9与其他各细胞亚群之间存在复杂的相互调控,值得深入研究。
近来Th22细胞亚群也成为免疫学家关注的热点。Th22高分泌IL-22,不表达RORγt或T-bet,亦不分泌IL-17或IFN-γ,但表达CCR4、CCR6及CCR10,并参与皮肤免疫应答及组织修复等过程[176,177]。最近发现Th22细胞能够识别朗格汉斯细胞表面CD1a-脂质复合体,代表了一种重要的维持皮肤稳态的朗格汉斯细胞—T细胞相互作用模式[178]。
γδ T细胞是一类主要分布于表皮和黏膜上皮的T细胞,这类细胞不能识别抗原肽-MHC分子复合物,但能对CD1d提呈的抗原产生应答,是机体非特异性免疫防御的重要组成部分。近期的研究发现了一群能结合CD1d及脂类抗原α-GalCer的人类Vδ1+γδ T细胞,并发现生殖系基因编码的CDR1δ环负责调控CD1d限制性,而CDR3γ环则决定了抗原识别的特异性[179]。此外,人类Vγ9Vδ2 T细胞以MHC及CD1非依赖的方式识别磷酸化的异戊烯基代谢物。一种新型蛋白butyrophilin BTN3A1能结合宿主及病原体来源的磷酸化抗原,刺激人类Vγ9Vδ2 TCR,促进Vγ9Vδ2 T细胞活化,此项研究展示了一种全新的γδ T细胞识别抗原而活化的方式[180]。除了Th17细胞,γδ T细胞也能分泌IL-17而参与多种感染性疾病及自身免疫性疾病的发生发展。然而对γδ T17细胞的分化及功能特点的了解尚不深入。一种自发产生Sox13突变的CD45.1+C57BL/6小鼠品系表现出Vγ4+γδT17细胞缺失,且对牛皮癣样皮肤改变具有抵抗作用[181],提示Sox13是γδT17细胞分化的关键性转录因子,而Sox13依赖的γδT17细胞在牛皮癣相关炎症反应中可能发挥潜在作用。
2.B细胞亚群
除了T细胞亚群的研究如火如荼之外,对于具有不同表型特征与功能特点的B细胞亚群的研究也开始受到越来越多的重视。B细胞作为机体免疫系统的重要细胞,可分化为不同亚群参与机体免疫应答的正向和负向调控,一般认为,B细胞在获得性免疫应答中可通过产生抗自身抗体导致自身免疫性疾病的发生。根据表型、解剖学定位和功能特点的不同,B细胞可以分为B1细胞和B2细胞。B2细胞即通常所指的B细胞,主要存在于次级淋巴组织。B1细胞主要存在于胸膜腔、腹膜腔和黏膜组织,腹膜B1细胞表达Mac-1(CD11b),脾脏B1细胞不表达CD11b。根据CD5的表达与否,B1细胞可进一步分为B1a细胞(CD11b+CD5+)和B1b细胞(CD11b+CD5-)。B1a细胞及其分泌的天然抗体为幼儿免受细菌感染提供了天然的保护。B1b细胞具有独特的功能,在感染时它能针对多糖和其他非T细胞依赖性抗原产生长期的抗体应答。B1细胞的起源以及B1a细胞和B1b细胞是否衍生自相同的或者不同的祖细胞目前还不十分清楚。在Trypanosoma cruzi感染后,B细胞能快速产生IL-17,这一过程不依赖于转录因子RORγt和Ahr,而依赖于Btk激酶,此项研究提示IL-17+B细胞可能是机体天然免疫系统抵抗病原体侵袭的重要细胞[182]。
近年来的研究表明,除了这些致病的B细胞以外,机体还存在一类具有免疫调节功能的B细胞亚群,它们可通过分泌IL-10和(或)TGF-β抑制炎症反应。Janeway等首次报道体内存在一类免疫调节性B细胞亚群,可完全治愈小鼠急性实验性脑脊髓膜炎,为调节性B细胞的存在提供了有力的证据;进一步研究表明这类具有调节功能的B细胞主要通过产生IL-10增强对EAE的治疗效果。越来越多的研究表明在许多自身免疫病和炎症动物模型中,B细胞能负向调控免疫应答。因此,近年来该领域一个热点课题是研究新型调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)亚群。但B细胞功能异质性显著,哪种B细胞亚群在自身免疫病中发挥负调节作用,机制如何,尚缺乏明确实验证据。新型的具有免疫负向调节功能的B细胞亚群被发现能有效抑制抗原特异性T细胞介导的接触性超敏反应(CHS)[183]。该研究采用CHS模型,对比较Cd19-/-、hCD19Tg、野生型小鼠中的CHS反应强弱,发现Cd19-/-小鼠CHS炎症强度最高,其次为野生型小鼠,而过表达人CD19分子的hCD19Tg小鼠反应最弱。LPS或BCR信号刺激3种小鼠脾脏B细胞,其IL-10分泌量与CHS反应呈负相关;体内剔除B细胞后,炎症反应均增强。流式分析发现了一群具有独特表型的CD1dhighCD5+B细胞,其在正常小鼠脾脏B细胞中的比例为1%~2%,在hCD19Tg小鼠中升至10%,但不存在于Cd19-/-小鼠中;胞内染色结果证明其为脾脏、引流淋巴结、外周血B细胞中IL-10的主要来源,因此这群高分泌IL-10的B细胞亚群被定义为B10细胞。那么,究竟是不是这群细胞对3种小鼠的CHS反应差异产生了关键性影响呢?研究人员采用体内实验分析其功能,结果发现过继回输野生型小鼠B10细胞后,Cd19-/-小鼠原本增强的CHS反应恢复正常,但回输IL-10-/-B10细胞或回输野生型非CD1dhigh CD5+B细胞均无此效果;此外,剔除全部B细胞的野生型小鼠对CHS的高反应性也在B10细胞回输后降至正常水平;而阻断IL-10的作用亦可增强hCD19小鼠体内的炎症反应。综上所述,CD1dhighCD5+B细胞作为新型的调节性B细胞(B10),通过分泌IL-10负向调控炎症反应,抑制T细胞介导的过敏反应。最近,作者进一步证实B10细胞在体内的发育及功能成熟需要抗原受体的多样性以及TLR配体的活化[184]。该工作展示了B细胞在免疫调控机制中举足轻重的一面,证明了B细胞中的负向调节性亚群能够抑制免疫系统过度活化并促进自身免疫病的恢复,同时也提出了有待进一步研究的问题:第一,B10细胞对CHS反应的调节功能是特例还是普遍特征?第二,B10细胞与活化的边缘区B细胞或B1a细胞是否能够明确区分?第三,在自身免疫病的发生发展过程中,B10细胞主要作用于哪个时相?最后,B10细胞的分化发育途径及关键性转录因子是否可以被证实?近来,研究者新发现了一群分泌IL-35的B细胞能够发挥负向免疫调控作用。当B细胞不能产生IL-35,该小鼠的EAE患病更为严重,而对沙门氏菌感染的抵抗力增强。该小鼠呈现出过度的免疫应答,表现为炎症反应与巨噬细胞及T细胞过度活化,B的抗原提呈功能增强。该研究提示B细胞,特别是其分泌的IL-35是自身免疫性疾病及感染性疾病中的关键性负调因子,为疾病治疗手段的研究提供了重要线索[185]。
目前已发现许多种具有不同表型的调节性B细胞亚型,但这些调节性B细胞的起源及其确切的分化途径还不十分清楚。虽然分泌IL-10是腹膜腔CD5+B1a的特征,但并非所有分泌IL-10的调节性B细胞都由B1细胞分化形成。许多研究表明分泌IL-10的调节性B细胞(CD11b-CD5-IgD+)表型与B2细胞的表型相类似,而与B1a细胞(CD11blowCD5+IgD-)的表型不同。此外,免疫球蛋白分泌谱(调节性B细胞有抗体类型转换,而B1只产生天然的IgM)也提示调节性B细胞可能起源于B2细胞。脾脏中已鉴定出一类B细胞亚群,能分泌IL-10,可通过CD40和CD86通路发挥次级抗原提呈细胞的作用,这类B细胞亚群在体内数量较少,并且具有独特的CD43+CD1dhigh的表型,它们有可能是调节性B细胞的祖细胞。
根据炎症存在的类型,脾脏B细胞分化为调节性B细胞至少有两种可能的途径。在EAE和类风湿关节炎(RA)中,自身抗原引起的BCR交联或(和)CD40-CD40L相互作用使得B细胞分化为调节性B细胞,这类调节性B细胞起源于活化的FOB细胞,被称为“获得型”(抗原特异性IL-10分泌)调节性B细胞。而在另外一些疾病中,如炎症性肠病(IBD),在肠伴随淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue,GALT)中存在的调节型B细胞对肠内细菌产物既产生固有免疫应答又产生获得性免疫应答。这群肠系膜淋巴结中的调节性B细胞和脾脏MZ B细胞的表型和功能非常类似,两者都高表达CD1d,且都对LPS产生应答。由于IBD中调节性B细胞的产生需要多克隆活化,而不需要抗原限制性单克隆抗体的活化,因此肠系膜淋巴结中的调节性B细胞很可能代表了一类“固有型”(多克隆刺激诱导IL-10分泌)调节性B细胞,这类调节性B细胞起源于脾脏MZ B细胞,脾脏MZ B细胞接受TLR通路刺激活化后分化为调节性B细胞。
调节性B细胞发挥负向免疫调节的作用机制尚不完全清楚。最近的研究发现在调节性B细胞、调节性T细胞、CD4+CD8+T细胞和NKT细胞之间存在着联系与相互作用,体内这种细胞间的广泛联系可更有效地调节免疫应答以及阻止自身免疫病的发生。研究发现,调节性B细胞可以调控和(或)诱导调节性T细胞的产生,这种现象最初是在眼前房相关免疫偏离(anterior chamber-associated immune deviation,ACAID)机制研究中被发现的。在这一体系中,调节性T细胞的产生依赖于脾脏B细胞提呈眼前房(anterior chamber,AC)抗原,抗原进入AC后被眼睛内特殊的抗原提呈细胞所处理,移行至胸腺和脾脏,然后将抗原肽转移给B细胞,在B细胞将抗原肽提呈给T细胞后,诱导调节性T细胞的分化。此外,学者们在Gαi2-/-小鼠的结肠炎模型中进一步证实了调节性B细胞可以调控调节性T细胞的产生,发现肠系膜淋巴结B细胞和CD8α+T细胞共同输注,可保护小鼠不发生结肠炎,这种保护作用与肠上皮细胞中调节性的CD4+CD8α+T细胞和肠系膜淋巴结中CD3+NK1.1+T细胞的扩增有关。也有学者发现静止B细胞可以诱导初始T细胞分化为被称为“bTreg”的新型调节性T细胞,这种新型调节性T细胞能抑制免疫应答,如皮肤过敏反应和异位心脏移植排斥反应。“bTreg”的产生依赖于细胞与细胞的接触,而不依赖于IL-10的产生。
调节性B细胞作为一个新兴的研究领域还有许多问题有待解决:①对不同亚型调节性B细胞的分化途径缺乏足够的认识;②目前还没有鉴定出调节性B细胞分化或发育过程中关键的转录因子;③体内调节性B细胞表型与其功能有待进一步研究;④调节性B细胞是一类具有免疫调节功能的终末分化细胞,还是在某些炎症条件下会继续分化为致病的B细胞?尽管有许多悬而未决的问题,调节性B细胞在负向调节自身免疫和炎症反应中的作用越来越受到重视,也将为免疫相关疾病的治疗提供新的思路。
3.NK细胞亚群
NK细胞在机体抵抗肿瘤和感染的天然免疫应答中发挥重要作用,但有关其亚群和在免疫调控、免疫性疾病发生中作用的研究尚不深入。近年来的研究表明,NK细胞并不像以往认为的那样是一个均一的群体,而是可以根据表型和功能方面的差异分为若干亚群。人类的NK细胞根据CD56和CD16表达水平的不同至少可分为两个亚群:①CD56dimCD16+的NK细胞占人外周血NK细胞总数的约90%,这群 NK细胞在识别一定的活化信号后能够有效杀伤靶细胞,但其分泌 IFN-γ的水平较低;②CD56brightCD16-的NK细胞在促炎性细胞因子的作用下能够大量分泌包括IFN-γ、TNF和GM-CSF在内的细胞因子,但仅在长时间持续活化后才能具有杀伤作用。CD56brightCD16-NK细胞表面表达大量识别HLA-E的抑制性受体CD94/NKG2A,但却不表达能识别MHCⅠ类分子的KIR受体,而此类KIR受体表达于CD56dimCD16+NK细胞。此外,仅CD56brightNK细胞表达次级淋巴器官归巢标志物,如CCR7、CD62L和CXCR3等,这使得该群细胞能够分别向次级淋巴器官和炎症部位趋化。小鼠NK细胞与人类NK细胞有许多相似之处,但是小鼠NK细胞不表达CD56的同源分子,所以小鼠NK细胞无法根据该分子的表达分群。近年来,有一些研究试图利用其他表面标志物来对小鼠NK细胞进行分群,包括CD27+CD11bhi和CD27-CD11bhi两群。但与人类NK细胞不同的是,CD27+CD11bhiNK细胞在细胞因子分泌和细胞毒作用两方面均强于CD27-CD11bhiNK细胞;另外,有研究还发现了小鼠NK细胞的胸腺发育途径,这群小鼠NK细胞表达CD127和转录因子GATA-3。此外,小鼠NK细胞还表达不同的Ly49家族受体,可能在不同的感染情况下发挥不同的识别作用,最新的研究表明,在B6小鼠中,表达Ly49H受体的NK细胞在MCMV感染下能够特异性识别感染细胞表面病毒编码蛋白m157,并且在活化和增殖后产生免疫记忆,这提示小鼠NK细胞很有可能像T细胞一样进一步划分为记忆性NK细胞。此外,不同NK细胞亚群的组织分布有所不同,这提示NK细胞的各个亚群可能发挥不同的作用。
NK细胞通过分泌促炎因子和介导细胞杀伤执行着固有免疫细胞的使命,但对其亚群的表型、功能以及与疾病的关联的分析尚不深入。在2008年12月的Immunity上率先报道了一类新型的分泌IL-22的肠道NKp46+细胞,NKp46+细胞在黏膜天然免疫中发挥重要作用[186],紧接着,在2009年1月的Nature Immunology上同期发表了三篇关于此NK细胞亚群的报道[187~189]。这些研究共同提示,人类和小鼠的肠道黏膜固有层存在着一群NKp46+RORγt+NK1.1loCD3-细胞亚群,该群细胞具有不成熟NK细胞的表型特点,但了NK细胞传统的脱颗粒及产生IFN-γ的能力较低,重要的是其表达淋巴组织诱导细胞(LTi cell)的表面标志CD127和c-kit,并受转录因子RORγt的调控。进一步研究证实肠道NKp46+RORγt+NK1.1loCD3-细胞高分泌IL-22,而非IL-17。肠道NKp46+CD3-细胞在肠道微环境的作用下有着独特的表型及功能特点,在淋巴组织生成、肠道免疫及组织修复中可能起着重要作用。该研究使人们对位于皮肤与黏膜的NK细胞亚群有了更深入的认识,为NK细胞表面标志及其功能状态的研究提供了全新的思路[190]。
免疫学家曾于2010年定义了一群滤泡辅助性T细胞(Tfh),Tfh参与抗原特异性B细胞的成熟、增殖及B细胞记忆,对于维持生发中心反应也具有关键作用。自然杀伤T细胞(natural killer T cell,NKT cell)细胞是一类表面同时表达TCR及NK细胞受体的天然免疫细胞,能识别CD1d提呈的脂类抗原,辅助B细胞活化。但是NKT细胞能否辅助识别相同抗原的B细胞,其对B细胞功能活化的影响如何?近来,研究者在生发中心发现了一群CXCR5+PD-1hi滤泡辅助NKT细胞(NKTfh cell),这群细胞依赖IL-21与识别相同抗原的B细胞相互作用,促进早期生发中心形成、B细胞亲和力成熟及诱导高水平IgG的生成。NKTfh与Tfh在表型上相似,都表达CXCR5和PD-1,且分化过程都依赖于转录因子Bcl-6、CD28共刺激信号以及B细胞;然而与Tfh不同,NKTfh对B细胞的辅助不影响B细胞记忆。NKTfh在针对病原体的快速反应及早期抗感染过程中发挥了关键性作用,是一种新的NKT与B细胞的相互调节机制[191-194]。
4.DC及巨噬细胞亚群
APC识别并摄取抗原是免疫启动的第一道环节,进而一方面可通过激活T、B淋巴细胞激活特异性免疫应答,另一方面也可经诱导调节性T细胞或清除相应的T细胞克隆而达到免疫抑制或诱导免疫耐受的作用。关于DC不同亚群的表型及功能特点屡见报道。langerin+CD8α+DC是交叉提呈抗原的关键细胞[195,196],CD8α+DC能够交叉递呈外来的病毒样颗粒抗原(virus-like particle,VLP)[197]。交叉提呈过程中,Rab11a分子招募并储存MHC-Ⅰ类分子在endosomal recycling compartment(ERC)中,而MyD88依赖的TLR信号激活IKK2,进而磷酸化吞噬体相关的SNAP23蛋白,促进ERC与吞噬体的融合,进而促进ERC来源的MHC-Ⅰ类分子分布于吞噬体中,最终增加感染过程中外源性抗原的交叉提呈[198]。
髓系来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)近年来受到广泛关注,根据形态、表型及功能可将MDSC分为MO-MDSC(即单核细胞-MDSC)和PMN-MDSC(即多形核细胞-MDSC),二者具有各自不同的效应分子和信号通路[199]。另外,对于Ⅱ型巨噬细胞(M2)的研究近年来也有较大进展,请参看相关章节,此不赘述。
5.固有淋巴细胞
共同淋巴样祖细胞(common lymphoid progenitor,CLP)分化成为T细胞、B细胞及一类固有淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)。ILC是一类新近定义的细胞家族,所包含的各类细胞在进化上高度保守,而功能及表型上具有异质性。这类细胞包括自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)、淋巴样组织诱导细胞(lymphoid tissue-inducer cell,LTi cell),以及分泌IL-5、IL-13、IL-17以及IL-22的固有免疫细胞。ILC大量存在于黏膜组织中,在机体抗病原体天然免疫应答、淋巴样组织形成、组织重塑以及修复中发挥重要作用。ILC的分化依赖于转录因子Id2(inhibitor of DNA binding 2),不同类型细胞的分化又受不同转录因子及细胞因子环境的影响[200]。ILC1表达转录因子T-bet,在IL-12刺激后分泌IFN-γ,能从RORγt+ILC3细胞受IL-12诱导分化生成。ILC1大量存在于克罗恩氏病(Crohn’s disease,CD)患者的炎性肠道组织中,在肠道黏膜免疫中发挥重要调控作用[201]。
近来,关于ILC不同类型细胞的分化发育、表型及功能的研究取得突破性进展。RORγt+ILC是一类表达RORγt,且分化过程依赖于转录因子RORγt以及IL-7的固有免疫细胞。此类细胞包括LTi细胞、分泌IL-17的固有免疫细胞(IL-17-producing ILC,ILC17)以及分泌IL-22的固有免疫细胞(IL-22-producing innate cell,ILC22)。LTi细胞参与淋巴样组织形成,ILC17及ILC22参与抵抗胞外细菌感染;而ILC17及ILC22功能紊乱与自身免疫性疾病发生密切相关。所有的ILC细胞亚群的分化都依赖于转录因子Id2,然而特异性指导RORγt+ILC分化的环境因素及调控机制并不清楚。胎儿RORγt+ILC在胎肝微环境发育成熟;而成人RORγt+ILC来源于骨髓中共同淋巴样祖细胞(CLP),并在外周依赖于Notch2信号发育成熟。此外,胎儿CLP伴随整合素α4β7和CXCR6的表达,相继失去B细胞及T细胞发育潜能,并最终发育成为RORγt+ILC,提示CXCR6可作为ILC谱系发育的新分子标志[202]。
不同的转录因子调控不同类别的ILC分化。例如,转录因子NFIL3/E4bp4调控NK细胞分化,RORγt调控LTi细胞、ILC22及ILC17的分化,转录因子AHR(aryl hydrocarbon receptor)参与调控Treg及Th17的分化,并调节T细胞分泌IL-22[203]。RORγt+ILC表达AHR,而AHR对肠道RORγt+ILC及ILC22分化发挥关键性调控作用。饮食中的配体可诱导RORγt+ILC中AHR表达,而AHR对肠道RORγt+ILC发育以及肠道淋巴样滤泡形成发挥关键作用[204]。AHR还参与调控ILC22的分化发育以及后天淋巴样组织的形成,进而促进机体对病原体侵袭的抵抗作用[205]。转录因子TCF-1对于ILC发育分化发挥关键作用[206]。高表达TCF-1的早期ILC祖细胞(early ILC progenitor,EILP)不能向T细胞及B细胞分化,而能向NK细胞及所有已知ILC细胞分化,从而可能是目前所知最为早期的ILC定向祖细胞。此外,转录因子TOX对于CLP向ILC分化起关键作用[207]。TOX缺失的细胞中祖细胞增殖存活及ILC早期发育明显受损,且ILC谱系相关基因表达明显下降。这一研究为深入研究ILC生物学特性提供了重要线索。
ILC2(type 2 cytokine-producing innate lymphoid population,分泌2型细胞因子的ILC)指一类在IL-25及IL-33作用下产生Th2型细胞因子IL-13及IL-15的固有淋巴细胞,包括nuocytes和自然辅助细胞(natural helper cell,NH cell),它们表达CD127、IL-17RB以及IL-33受体,参与抗胞外寄生虫感染。流感病毒感染能导致哮喘的特征性气道高敏性,而气道高敏性的产生并不依赖于适应性免疫应答,却依赖于NH细胞产生的IL-13[208~210]。他们的研究揭示了病毒诱导的哮喘的新机制,即固有免疫来源的IL-13的核心作用。多数ILC2的研究基于小鼠模型,对人类ILC2的研究并不深入。一群定植于小鼠及人类肺脏的ILC在表型和功能上符合ILC2的特征,肺脏ILC对流感病毒感染后呼吸道上皮的维持和修复发挥重要作用。这群肺脏ILC2活化后分泌双向调节蛋白(amphiregulin),并通过与其受体EGFR结合促进上皮细胞增殖[211]。一群人类CD127+CRTH2+CD161+ILC在IL-25及IL-33刺激后产生大量IL-13。CRTH2+ILC存在于肺脏及胃部,在慢性鼻窦炎鼻息肉大量富集;通过产生IL-5及IL-13参与过敏性疾病的发生[212,213]。在正常小鼠真皮组织中存在一群大量分布且表型独特的dILC2细胞(Dermal ILC2 cell),这群ILC2依赖于IL-7生存,组成性表达IL-13,并在体内与肥大细胞相互作用。IL-2活化的dILC2能通过IL-5表达及招募嗜酸性粒细胞促进皮肤炎症的发生[214],这群细胞的发现可能对嗜酸性粒细胞参与的皮肤炎症及寄生虫感染等相关疾病的治疗提供新的策略。此外,根据对细胞因子的反应性,ILC2细胞可进一步分为炎性ILC2细胞(inflammatory ILC2 cell)和天然ILC2细胞(natural ILC2 cell)[215]。iILC2亚群对IL-25敏感,而nILC2细胞对IL-33敏感。iILC2细胞能够分化为nILC2样细胞,同时也能分泌IL-17,并介导机体抵抗巴西钩虫及白色念珠菌感染。因而iILC2细胞可能是ILC细胞的一过性的祖细胞,并在炎症刺激下发育为nILC2样细胞以抵抗寄生虫和真菌感染。未来研究将在ILC在不同生理和病理状态下的功能活化特点及与其他免疫细胞分子之间相互调节等方向带来更多突破。
综上可以看出,ILC在抵抗病原体侵袭及组织修复、淋巴细胞形成中发挥重要作用,对各类ILC亚群表型及功能特点、分化发育的调控机制,以及ILC与环境因素及其他免疫细胞、分子之间的相互作用的深入研究将有助于阐明其生理、病理学功能及意义,为寻找维持黏膜稳态、防治疾病发生提供新的策略。
(四)免疫调节的细胞与分子机制研究
在多数情况下,机体能够在精密的免疫控制下,通过适度的免疫应答防止病原微生物的入侵、监视并清除机体内恶变的细胞,以保持内环境的稳定;但是,一旦这样的调控机制出现异常,将会导致免疫病理反应,从而对机体造成伤害,如自身免疫病等。长期以来,对于增强免疫应答效应的免疫调控机制即正向免疫调控机制的研究比较多且较为深入,而对于免疫负向调控的机制则认识不足。因此近年来免疫学领域有关免疫负向调控机制的研究非常热门,其中最大的热点是CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的基础与应用研究。目前对于这群Treg的分化、表型特征、免疫调控功能机制等已经有了比较深入的研究,证明其作为执行免疫抑制功能的重要负向调控细胞在抑制免疫反应过度活化、维持机体免疫稳态中发挥重要作用,同时其数量和功能的改变与自身免疫病和肿瘤等多种重大疾病密切相关[216],然而,因Treg细胞分化的复杂性以及在不同生理和病理条件下发挥作用的多样性,其具体作用机制还有待进一步研究。美国Alexander Rudensky教授发现了Treg细胞表达Foxp3,并且应用Foxp3条件性剔除小鼠证明了Foxp3在Treg形成中起关键性作用[217]。近来,Treg的发现者、日本的Shimon Sakaguchi教授通过构建条件性剔除CTLA-4的Treg,证明了CTLA-4缺失的Treg细胞的免疫抑制功能丧失,有力地证明了CTLA-4在Treg免疫抑制中的重要作用[218]。Sakaguchi教授进一步证明了人Foxp3+Treg具有异质性,即由不同的亚群组成,其中Foxp3highCD45RAlow和Foxp3lowCD45RhighTreg细胞具有免疫抑制性,而Foxp3lowCD45RAlowTreg细胞不具有免疫抑制作用。
Treg根据不同的分化来源或功能特点可分为不同的“亚亚群”,例如Th3、Tr1细胞亚群等。Treg分泌的IL-35与IL-10能诱导人或小鼠T细胞分化成为一种能通过分泌IL-35、而非IL-10或TGF-β发挥免疫抑制功能的新的细胞亚群,并将之命名为iTR35,iTR35在免疫耐受及Treg诱导的肿瘤生长中发挥关键作用[219]。配体活化的转录因子AHR(aryl hydrocarbon receptor)能与c-Maf或其他转录因子协同诱导小鼠及人TR1(type 1 regulatory T cell)细胞分化[220-222]。此外,一群新型具有免疫抑制功能的T细胞,即抗原活化的CD52hiCD4+T细胞,不同于CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,通过分泌可溶性CD52结合抑制性受体Siglec-10,减弱Lck和Zap70磷酸化,进而抑制T细胞活化。CD52hiCD4+T细胞的免疫抑制效应在人类Ⅰ型糖尿病和NOD小鼠中得到证实[223]。此研究对T细胞功能调控提出了新的机制,对自身免疫性疾病发病机制和干预策略研究提供了新的视角。
目前,对于Treg是否可以进一步分为不同特点的亚群以及其作用机制如何,也是一个研究的热点。例如,人们发现在CD4+T细胞向Th1细胞分化的过程中发挥了重要作用的转录因子T-bet,也在Treg的功能发挥中起重要调控作用。T-bet可以抑制IL-4的表达,促进IFN-γ的表达,从而诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞分别向Th1和Tc1细胞分化。Foxp3+Treg细胞在IFN-γ的作用下可以表达转录因子T-bet,而T-bet可以诱导Treg细胞表面CXCR3的表达,从而促进Treg细胞在Th1型免疫反应部位的聚集;同时T-bet的表达可以维持Treg细胞在Th1型免疫反应中的稳态,促进其功能发挥[224]。T-bet+Treg细胞作为Treg细胞一种新的功能亚群,可以更有效地控制Th1型免疫反应。Treg细胞表面表达趋化因子受体CXCR3,与Th1细胞类似,Treg细胞表达CXCR3同样也依赖于转录因子T-bet;这群CXCR3+Treg细胞在脾脏中的比例随年龄的增大而增多,用抗CD40抗体诱导机体产生强的Th1型免疫反应后,T-bet+CXCR3+Treg细胞比例升高,但Treg细胞本身的数量并没有扩增,相反IL-2免疫复合体虽然能够促进Treg细胞的扩增,但并不能增加T-bet+CXCR3+Treg细胞的比例,提示在Th1型免疫反应中Foxp3+T-bet-Treg细胞可以向Foxp3+T-bet+Treg细胞转化;同时Treg细胞的这种转化依赖于IFN-γ受体及其下游分子STAT1,因此,在Th1型免疫反应中大量的IFN-γ可以选择性诱导Treg细胞中T-bet的表达。T-bet+Treg细胞几乎不分泌IFN-γ,对T细胞的增殖有很强的抑制能力,同时高表达GITR、CTLA-4和CD103,低表达CD25,表现出效应或记忆性Treg细胞的特点,并且作为Treg细胞的一种亚群可以在体内长期稳定存在;在结核等慢性Th1型免疫反应中,T-bet+Treg细胞比例增高,T-bet缺陷小鼠体内的Treg细胞在Th1型免疫反应中不能有效地增殖和存活,回输T-bet缺陷的Treg细胞不能减轻Foxp3突变小鼠——scurfy小鼠的临床症状,也就是说,T-bet可以促进Treg细胞在Th1型免疫反应中稳定存活,同时对于其抑制功能的发挥也是至关重要的。此外,SATB1(special AT-rich sequence-binding protein-1)能诱导Treg细胞重新分化为效应T细胞(effector T cell,Teff)[225]。Foxp3通过表观修饰及miRNA的调控作用抑制SATB1活性。解除Foxp3对SATB1的抑制作用可使Treg失去免疫抑制功能,诱导效应T细胞分化及活化。此外,转录因子BACH2抑制效应T细胞分化相关基因,促进Treg生成,从而抑制致死性炎症反应的发生。因此,BACH2是维持CD4+T细胞分化的重要调节蛋白,维持免疫活化及免疫耐受的平衡[226]。
Treg对维持免疫系统的自身耐受及免疫稳态发挥重要作用。Foxp3(forkhead family transcription factor)表达于Treg中,对Treg的分化及功能产生关键性调控作用。而Treg是否及如何受其他转录因子调控一直是免疫学研究的热点。转录因子Blimp-1(B lymphocyte-induced maturation protein 1)和IRF-4(interferon regulatory factor 4)能够促进Treg获得免疫抑制效应,表达Blimp-1的Treg细胞具有免疫抑制效应并分泌IL-10,而IRF-4对于Blimp-1表达及Treg活性发挥关键作用[227]。此外,Id3(inhibitor of DNA binding 3)对于控制Treg分化也发挥关键作用,Id3可解除GATA-3对Foxp3的抑制作用,进而促进Treg分化;同时,Id3还能抑制Th17分化[228]。Foxp3是控制Treg分化的核心转录因子,对于维持Treg的自我耐受和免疫稳态功能至关重要;然而单独Foxp3并不能决定Treg的分化或活化,多种转录因子相互作用共同决定Treg的命运。在根据CLR(context likelihood of relatedness)算法选取的7个转录因子中,过表达Helios或Xbp1引起不同的Treg特性变化,而过表达Eos、IRF-4、Satb1、Lef1及GATA-1均能与Foxp3协同活化Treg相关转录因子、促进Foxp3结合靶基因。然而,其中任何单一的辅助因子失活后Treg细胞特征都不受影响,表明Treg的表型受由一个高度冗余的基因开关控制[229]。
此外,尚不明确Foxp3通过何种机制结合靶基因进而控制Treg分化。近期Cell杂志同期发表了两篇关于Foxp3转录因子顺式作用元件对于维持Treg细胞稳定性的报道。研究表明Treg细胞的稳定性取决于Foxp3基因上的内含子顺式作用序列CNS2(conserved noncoding sequence 2)。CNS2序列富含CpG,在成熟Treg细胞中被去甲基化,通过感知TCR活化信号或IL-2的下调信号,促进CNS2与Foxp3基因启动子区域的结合,并抵抗炎性细胞因子对Foxp3的抑制作用,维持Foxp3表达及Treg细胞活化,对于抑制炎性免疫应答有重要意义[230,231]。该研究不仅揭示了环境因素调控Treg细胞稳定性的分子机制,也可能揭示了一种已分化细胞遗传稳定性的维持机制。
mTOR(mammalian target of rapamycin)是雷帕霉素在哺乳动物体内作用的蛋白激酶,在调节氨基酸代谢、能量代谢及细胞生存中发挥重要作用。近年来,关于mTOR在T细胞分化及活化中的重要作用被逐步揭示[232]。mTOR能促进效应T细胞分化,而抑制Treg分化。mTOR存在于两种多蛋白复合体中,mTORC1以及mTORC2。mTORC1信号能调节Th1及Th17分化,而mTORC2信号则能调节Th2分化[233]。此外,IL-7诱导的CD8+T细胞稳态增殖(Homeostatic proliferation,HP)依赖于mTOR活性。HP诱导的mTOR促进T-bet及CD122表达,进而在IL-15作用下活化Eomesodermin以拮抗T-bet进而促进CD8+记忆T细胞形成,并介导抗肿瘤效应[234]。其他实验室的研究也证实mTOR对Th1、Treg的分化、功能及代谢具有重要调节作用[235,236]。
免疫应答的启动首先由抗原提呈细胞(APC)捕获抗原,经加工、处理后将抗原信息传递给T、B淋巴细胞,因此,APC是免疫调控的关键细胞,所以围绕着DC和巨噬细胞研究免疫应答负向调控的机制也是一个重要的研究领域。DC作为一种异质性的细胞群体,分布于不同的解剖部位,含有不同的细胞亚群,处于不同的成熟阶段,表达不同的表型和细胞因子,其功能也是多样性的。以往认为DC具有激活免疫的功能,但是,近年来越来越多的实验证明,DC具有负向调节免疫的功能,可通过诱导T细胞失能,使免疫反应偏移,通过促使活化的T细胞凋亡及诱导调节性T细胞形成等方式使机体达到免疫稳定。其中,不同的细胞亚群及不同的成熟状态与DC诱导免疫反应的类型密切相关。广义的调节性DC(regulatory DC)是指那些具有负向免疫调控作用的DC,包括生理状态及病理状态下存在于体内的具有免疫负向调控作用的中枢和外周的DC,以及在体外各种不同条件诱导下从成熟或不成熟DC转变为具有负向调控作用的DC。调节性DC通过诱导调节性T细胞或清除相应的T细胞克隆而达到免疫抑制或诱导免疫耐受的目的。此外,调节性DC能够活化扩增体内已经存在的调节性T细胞,最近的研究提示DC上的共刺激分子CD80和CD86在通过CD28和CTLA-4调节Treg的抑制功能方面有相反的作用,阻断CD86能够有效地增强CD4+CD25+Treg所介导的抑制作用,而CD80的阻断会限制Treg细胞所介导的抑制,从而提示DC可能通过CD80和CD86的表达调节Treg细胞的功能,维持免疫激活和免疫抑制的平衡。另外,对于Ⅱ型巨噬细胞(M2)或者调节性巨噬细胞的研究近年来也有多篇论文报道。
除了经典的抗原提呈功能,MHCⅡ类分子还能够在免疫细胞和非免疫细胞中激发不同的细胞效应,长期以来人们忽略了MHCⅡ类分子的这种非经典的作用以及由此引发的效应。免疫细胞表面MHCⅡ类分子的交联可以转导不同的胞内信号,调控胞核和胞质内的信号转导途径从而介导不同的细胞效应,这些细胞效应包括细胞黏附的调节、抗原丰度的调控、同类细胞的聚集、细胞因子的释放、核转录因子的激活和细胞增殖调控等。尽管如此,细胞效应却因不同的细胞类型或者刺激的不同而不同。MHCⅡ类分子所引起的这种细胞特异性的效应最有力的例证就是,MHCⅡ类分子的抗体和超抗原都可以诱导单核细胞和EBV+B细胞的同型聚集,而对于触发TNF释放方面,两种刺激均可以诱导单核细胞释放TNF,而超抗原对EBV+B细胞不发挥此种作用。引起这些相互矛盾的实验现象的原因是否由于不同刺激诱导的MHCⅡ类分子不同的抗原决定簇的聚集所引起的,还有待于进一步的验证。尽管如此,这些实验现象却支持了一种可能性,即MHCⅡ类分子不同的细胞效应是与含有MHCⅡ类分子的低聚蛋白复合体中特异的分子组分有关的,它们或者是细胞特异性的,或者是细胞系特异性的。MHCⅡ类分子的抗体可以诱导成熟B细胞释放TNF-α,激发抗黏附信号,而MHCⅡ类分子的聚集却提高了前B细胞对BSAP的亲和力。这些结果表明,MHCⅡ类分子聚集所引发的特异性的细胞效应是受发育调控的,并且暗示了可能是与发育相关的细胞膜蛋白相关。与这种假说相一致的实验现象是MHCⅡ类分子的聚集可以诱导脐带血B细胞的增殖,但却诱导脾脏B细胞的凋亡,同是MHCⅡ类分子的聚集在不同的B细胞中却诱导了不同的细胞效应。此外,MHCⅡ类分子在非免疫细胞上的表达通常被认为是一种异常的现象,这种现象经常在一些生理或者病理情况下发生。对于这种MHCⅡ类分子所谓的“异常表达”人们提出了不同的机制,对于这些异常表达的MHCⅡ类分子所发挥的作用人们提出了更多的假设。很多实验数据证明了MHCⅡ类分子参与炎症性疾病和感染性疾病的发病机制,而这种参与作用是不依赖MHCⅡ类分子的抗原提呈功能的。事实上,超抗原或者循环中的MHCⅡ类分子的抗体可以引起聚集在类风湿关节炎患者滑膜液中的单核细胞上MHCⅡ类分子的积聚,从而诱导IL-1β、TNF-α的产生。这些释放的细胞因子可以活化滑膜细胞,使之表达更多的MHCⅡ类分子,这些新表达的MHCⅡ类分子可以经超抗原或者MHCⅡ类分子抗体的作用而聚集,从而释放一系列的细胞因子,如RANTES、MCP-1和IL-8,这些细胞因子可以通过招募白细胞而扩大炎症反应。同样,在牛皮癣患者中,超抗原可以通过结合角化上皮上的MHCⅡ类分子来诱导前炎细胞因子的释放,如TNF-α。EBV+表面MHCⅡ类分子的聚集可以上调TNF-α的释放,这种现象也可能发生在AIDS中。事实上,循环中MHCⅡ类分子抗体与MHCⅡ类分子的结合有利于维持HIV感染患者体内TNF-α的水平,释放的TNF能够作用于HIV感染的T细胞,从而有利于HIV病毒的复制。而且MHCⅡ类分子可能作为幽门螺杆菌的受体,幽门螺杆菌与表达MHCⅡ类分子的胃上皮结合后,可以诱导胃上皮的凋亡。此外,MHCⅡ类分子的聚集还可以通过诱导或者上调共刺激分子的表达来改变不同细胞的表型,从而在炎症过程或者抗原提呈中发挥重要的作用。可见,某些重要免疫分子非传统的生物学功能与意义值得进一步探索。
近年来关于NK细胞免疫调节作用的研究也越来越受到关注。除了具有传统的直接杀伤肿瘤细胞与病毒感染靶细胞的作用以外,NK细胞最近被发现还具有天然免疫调节和辅助获得性免疫的作用,从而将NK细胞的作用扩展到了获得性免疫阶段。①NK细胞可以促进DC成熟:感染早期DC能够活化NK细胞,同时活化的NK细胞还能促进DC成熟;NK细胞能够通过分泌IFN-γ和TNF-α以及通过膜接触依赖的方式促进DC成熟;NK细胞具有识别MHCⅠ类分子表达下调的病毒感染细胞和恶性转化细胞的能力,这使得NK细胞在DC启动的免疫应答中发挥重要的辅助作用。NK细胞能够使DC上调CD86的表达和IL-12的分泌,使DC启动T细胞免疫应答的能力增强;②NK细胞能够调控T细胞免疫应答方向:获得性免疫应答必须根据不同病原体特点作出相应的改变。T细胞免疫应答的方向(Th1型或Th2型)主要是应答初始阶段由DC在次级淋巴器官中决定的。在人类和小鼠的不同模型中均发现免疫应答早期,NK细胞能够趋化到淋巴结并与DC紧密接触,通过分泌大量IFN-γ和促进DC成熟,使T细胞免疫应答向Th1应答方向发展。NK细胞对免疫应答方向的调控在肿瘤和病毒感染过程中的作用尤其重要,因为这些情况下Th1型免疫应答发挥着关键作用。除IFN-γ和TNF-α等细胞因子外,NK细胞的其他效应分子,如穿孔素和颗粒酶等,也在NK细胞的免疫调节中发挥重要作用。例如,在穿孔素缺陷的小鼠中,过继回输的野生型CD8 T细胞不能有效地在热休克蛋白Gp96作用下产生抗肿瘤免疫应答,但同时过继回输野生型NK细胞能够使CD8+T细胞恢复扩增并能有效分化为CTL,清除肿瘤,这充分说明NK细胞表达的穿孔素在CD8+T细胞免疫应答中也起到关键作用。
对于免疫细胞表达的免疫抑制性分子包括PD-L1等参与负向免疫调控过程及其相应作用机制,国内已经有很多介绍,此不赘述。近年来新兴起的一个研究热点是寻找APC为主的免疫细胞中TLR、NLR和RLH信号通路的负向调控分子,研究其在免疫与炎症触发过程中的作用及其与感染等病理过程中的意义[237]。TLR作为免疫系统识别病原微生物的重要受体家族,以其在免疫应答尤其是天然免疫中发挥的重要作用受到免疫学界的广泛关注。已有的研究表明,TLR信号途径受到许多蛋白分子的精确调控,以保证其下游引发的基因表达直至免疫应答全过程的适时、适度。目前发现了很多TLR负向调控分子,包括胞膜分子ST2、SIGIRR、RP105、PECAM-1,胞内分子SARM、beta-arrestin、IRAKM、TOLLIP、SOCS1、FLN29、SHP2、Pin1、Tank等[238]。近年来也发现了许多能够负向调控RIG-I通路以及抑制RIG-I触发Ⅰ型IFN产生的分子,例如LGP2、A20、Pin1、SIKE、Atg5-Atg12、RNF125、DURA、NLRX1、ISG15、DAK、CYLD等[239]。TLR信号的过度活化被证明与许多自身免疫病,如RA、IBD、SLE等发生密切相关,而以往对TLR途径的负向调控分子如IRAK-M、SOCS-1、SIGIRR、ST2、CYLD、A20的鉴定及功能研究均表明TLR途径的负向调控对于机体产生协调、有利的免疫应答具有重要作用。泛素化连接酶TRAF3作用于TLR通路中MyD88及TRIF,最近,Tseng等深入阐明了其中的分子机制。他们发现,活化MyD88途径可促进TRAF3泛素化降解,并活化下游MAPK分子,促进炎性细胞因子产生;而活化TRIF途径则触发TARF3分子的非经典自身泛素化,进而促进IFN产生[240]。这些研究为通过靶向性修饰TLR信号通路以控制过度的免疫应答的治疗方法提供了新的视角。
Ⅰ型IFN具有抗病毒感染和诱发免疫病理损伤的双重功能,研究其产生的调节机制具有重要意义。ZAPS[PARP(poly(ADP-ribose)polymerases)-13 shorter isoform]受5'-3pRNA诱导产生,激活RIG-I的寡聚化及ATPase活性,并促进IRF-3和NF-κB活化。抑制ZAPS可降低IFN-α、IFN-β及其他细胞因子的产生,表明ZAPS可有效促进RIG-I介导的抗病毒免疫应答[241]。此外,转录因子MafB可阻断IRF-3与Ifnb1启动子结合,抑制IFN的产生和抗病毒反应[242]。关于调控IFN产生的新型蛋白还有很多报道,例如泛素连接酶TRIM56与STING相互作用,调节dsDNA诱导的IFN-β产生[243];NOD样蛋白家族成员NLRC5能与IKKα及IKKβ相互作用,负向调控NF-κB活化及Ⅰ型IFN的产生[244]。
Ⅰ型IFN通过活化IFN诱导基因(interferon-stimulated gene,ISG),编码多种具有抗病毒效应的蛋白,启动抗病毒免疫应答。有意思的是,ISG同样能被IFN非依赖途径活化。近期的研究对IFN非依赖的ISG活化途径提出了机制解释。胞内核酸外切酶Trex1通过调控STNIG、TBK1激酶以及IRF-3、IRF-7通路调节IFN非依赖的ISG活化[245]。Trex1的这一功能可能与其控制溶酶体形成有关。此外,IFN-β选择性结合IFNAR1,而并不结合IFNAR2,并揭示了IFN-β-IFNAR1相互作用的结构基础[246]。这对于选择性活化或干扰IFN途径、避免IFN临床应用中的副作用提供了重要的线索。
补体及细胞因子广泛参与免疫应答和调控,具有抗微生物感染、维持内环境稳定、免疫调节等功能。最近,关于补体和细胞因子参与免疫调控的研究有了新进展。如补体调节蛋白CD46作用于CD4+T细胞及γδT细胞,通过与IL-2或TCR信号协同,抑制T细胞分泌IFN-γ,而促进IL-10的分泌。此研究揭示了补体系统参与免疫调节的新机制[247]。IL-37能抑制巨噬细胞或上皮细胞分泌炎性细胞因子,IL-37转基因小鼠对LPS诱导的内毒素休克抵抗。深入研究发现IL-37能与Smad3相互作用,介导上述对天然免疫的抑制作用[248]。
(五)免疫记忆
免疫记忆(immunological memory)是获得性免疫的一大特征,是疫苗研究的理论基础。关于免疫记忆形成的机制研究一直是免疫学研究的一大热点。
免疫记忆主要由记忆性B细胞与记忆性T细胞介导,近两年来,对经典的免疫记忆细胞——记忆性T、B细胞的调控机制和功能特点的研究有新的进展。IL-12能增强并维持抗原及B7.1诱导的CD8+T细胞的mTOR活性,阻断mTOR活性能逆转IL-12诱导的CD8+T细胞功能,促进免疫记忆,提示mTOR是一个调节CD8+T细胞发挥免疫效应或记忆功能的枢纽蛋白[249]。此外,TCF-1对记忆性CD8+T细胞分化及存活发挥关键性作用[250,251]。Mcl-1对生发中心形成及B细胞记忆发挥关键性作用[252]。这些对免疫记忆形成发挥关键作用的蛋白及通路的发现将对疫苗的设计和开发产生巨大的推动作用。关于记忆性T细胞的分化模式一直存有争议,最近的研究进一步证明记忆性CD4 T细胞同记忆性CD8+T细胞相似,也是由效应T细胞分化而来[253];另外,有体外研究表明,高度活化的效应CD4+T细胞可在体外短时间静息后转变成具有记忆性T细胞特征的细胞。各种细胞亚群对记忆性T细胞产生与功能的调控被广泛研究与报道,包括各种DC亚群、NK细胞以及CD4+T细胞,基质微环境及调节性DC可能也在记忆性T细胞的产生中发挥各自的作用;另外,CD4+T细胞调控记忆性CD8+T细胞产生的机制有CD27信号、T-bet下调、染色质重塑、TLR3配体作用等[254]。抗原刺激强弱、TCR信号强度以及初始T细胞数量也是影响记忆性T细胞产生及其性质的关键因素。近来的研究表明,转录因子FOXO3a在人中枢型记忆性CD4+T细胞的存活中发挥了重要作用,这就提示各种关键转录因子可能在记忆性T细胞的产生与维持中占有重要地位[255]。细胞因子、共刺激分子一直是调控记忆性T细胞产生与维持的重要因素[256]。近来研究发现IL-15不仅是记忆性CD8+T细胞的重要的维持因子,也是维持记忆性CD4+T细胞的重要因子;另外,共刺激信号OX40、趋化因子MCP-1、黏附分子ICAM-1依赖的成熟DC与T细胞的长时间相互作用也是调控记忆性T细胞产生的重要因素[257,258]。总之,有关免疫记忆的细胞与分子机制尚有待于更加深入的研究,如何在病原体感染、肿瘤、移植及自身免疫性疾病等病理条件下正确地调控记忆性T细胞的产生具有重要的意义,对疫苗的研究更具有重要的指导意义。有意思的是,记忆性T细胞能够控制吞噬细胞、DC、NK细胞、NKT细胞的动员及分化,诱导IFN-γ的产生及对病原微生物的天然免疫应答[259]。组织定居 CD8+T细胞(tissue resident memory CD8 T cells,CD8+TRM细胞)在再次接受抗原刺激后,活化局部的体液免疫应答,激活局部DC成熟和NK细胞,诱导抗细菌及抗病毒因子表达,从而诱导局部抗病毒免疫应答[260,261]。
传统观点认为只有T细胞和B细胞能够产生抗原特异性免疫记忆,他们表达的RAG(recombinationactivating gene)通过参与VDJ基因重排产生巨大的抗原受体库。然而,NK细胞同样表现出抗原特异性免疫记忆功能[262],过继回输病毒致敏的肝脏NK细胞可延长小鼠在接受再次注射致死剂量病毒后的存活时间,对流感病毒、VSV或HIV-1感染均能产生特异性记忆。NK细胞的这种记忆功能依赖于表面趋化因子受体CXCR6[263]。MCMV感染后,小鼠肝脏Ly49H+NK细胞经历增殖期、收缩期后能够保持自我更新并存活达数月之久,并能在再次病毒感染后迅速产生强烈的二次应答[264]。这些报道都提示,NK细胞具有某些特异性免疫细胞的特性,可能为抗病毒治疗、疫苗研制等提供新的思路。
(六)表观遗传学与免疫细胞分化发育及免疫应答调控
1.组蛋白修饰
表观遗传修饰是指不改变基因组DNA序列而改变基因表达的转录水平上的可遗传修饰,包括DNA甲基化、RNA干扰和组蛋白修饰,在生命活动中起着重要作用[265,266]。
组蛋白修饰是表观遗传修饰中具有高度多样性和可塑性的一类,因为组蛋白H1、H2、H3、H4均可被修饰,且其上多个氨基酸位点具有多种修饰形式,包括(去)乙酰化、(去)甲基化、(去)磷酸化、(去)泛素化以及(去)ADP-核糖基化等[267]。组蛋白修饰不断被发现参与多种生理病理过程,如生物钟调控、代谢和多种人类疾病的发生发展[268]。从组蛋白修饰的视角探讨免疫应答和调控机制,探索免疫相关疾病发病原理和防控手段已逐渐成为免疫学研究热点之一。组蛋白修饰可以通过参与调控多种免疫相关基因的表达,影响免疫系统中免疫细胞分化发育、细胞因子分泌表达,以及免疫应答相关分子活化等,进而参与免疫系统的应答和耐受。异常的组蛋白修饰不断被发现可作为潜在的免疫性疾病的诊断标识和干预靶点[269]。由乙酰化转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)介导的组蛋白乙酰化修饰主要发生于组蛋白H3的9、14、18和23位赖氨酸位点以及组蛋白H4的5、8、12和16位赖氨酸位点。由HAT介导的乙酰化一般参与目的基因的转录活化,而与之相对应的,由HDAC介导的去乙酰化则一般沉默基因的表达。
目前的研究发现,组蛋白修饰可以通过调控天然免疫系统中一系列基因的转录表达,从而影响天然免疫系统中细胞的分化活化、细胞因子的产生等,参与炎症反应的启动、持续或终止。近期,多个研究小组发现(去)乙酰化修饰参与了不同种类抗原提呈细胞(antigen presentation cell,APC)如单核/巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)及其亚群的分化发育和功能活化,进而在不同类型的炎症反应过程中起到一定的调控作用。已报道HDAC抑制剂MS-275能有效抑制去乙酰化修饰,导致DC表面分子CD1a及其他共刺激分子和黏附分子的表达降低,且这种功能下调可能是由NF-κB、IRF-3和IRF8信号通路的改变引起的[270]。而利用另一种HDAC抑制剂TSA则发现去乙酰化修饰可能是通过抑制IRF2、IRF-4和RelB的表达参与调控DC的分化。单核/巨噬细胞通过模式识别受体识别不同的微生物,对细菌、病毒、真菌等的识别导致其向M1型分化,M1型巨噬细胞主要介导机体的抗感染和炎症反应;而对寄生虫的识别将使之向M2型分化,M2型巨噬细胞主要促进伤口愈合而抑制炎症[271]。组蛋白的去乙酰化修饰通过影响巨噬细胞M1和M2不同类型间的分化,参与炎症的调控。研究发现TSA可以影响单核/巨噬细胞的分化,具体为TSA通过干扰c-Myc和cyclin D1的表达抑制了GM-CSF及JAK2-STAT5通路依赖的M1型巨噬细胞的增殖,从而抑制了M1型巨噬细胞所介导的炎症反应,而对M-CSF及ERK1/2依赖的M2型巨噬细胞的增殖并无影响[272]。而在巨噬细胞基因组中,HDAC3参与众多IL-4调控基因的去乙酰化沉默。当HDAC3缺失时,单核/巨噬细胞的表型更倾向于IL-4和IL-13等Th2型细胞因子诱导极化的M2型。曼氏血吸虫虫卵感染,是一类由Th2型细胞因子介导的炎症反应,当感染时,单核/巨噬细胞条件性敲除HDAC3的小鼠表现出较轻的肺部炎症,进一步表明HDAC3介导的去乙酰化修饰参与单核/巨噬细胞向M2型分化,因此HDAC3具有作为Th2介导的炎性疾病干预靶点的可能性[273]。抑制组蛋白的去乙酰化修饰不仅可以影响细胞分化,还能影响DC和巨噬细胞中TLR4依赖的活化及功能[274]。在给予巨噬细胞和DC以不同TLR配体刺激及HADC抑制剂处理后,进行全基因组微阵列分析,发现HDAC抑制剂可以下调包括模式识别受体、激酶、转录因子、细胞因子、趋化因子、生长因子以及共刺激分子等一系列宿主防御相关基因的表达[275],提示HADC在TLR触发的炎症反应中起到广泛的调控作用。有研究发现,HDAC11参与APC活化T细胞的过程,过表达HDAC11会抑制IL-10的表达并诱导可以激活初始T细胞的炎性APC,即HDAC11可以通过负向调控APC中IL-10基因的表达来解除免疫耐受,使APC活化,倾向于触发炎症反应。提示HDAC11可以作为一种平衡免疫活化和耐受的靶分子,为自身免疫性疾病、移植和肿瘤的治疗提供新的视角[276]。与组蛋白(去)乙酰化修饰一样,(去)甲基化修饰酶分子也参与调控天然免疫细胞的分化和功能活化,在天然免疫炎性反应调控中的作用也逐渐受到关注。如Jmjd3,一种组蛋白H3K27去甲基化酶,通过Jmjd3-IRF-4轴参与调控M2型巨噬细胞的极化以及宿主对抗寄生虫感染的炎症反应,表现为Jmjd3缺陷小鼠中M2型巨噬细胞的数量和比例明显下降,在体外应对几丁质和体内抗寄生虫的炎症反应中都明显弱于野生型小鼠[277]。Mll1,一种组蛋白H3K4甲基化转移酶,与NF-κB分子之间存在相互作用,TNF或LPS刺激后,NF-κB分子被激活从胞浆入核,与之相互作用的Mll1蛋白也因此被带到了NF-κB信号通路下游相关靶基因上。Mll1通过影响靶基因启动子上的H3K4甲基化水平,选择性调控NF-κB下游基因如IL-6等炎性细胞因子的转录活化,从而调控天然炎症反应[278]。而Mll4,Mll1同家族的另外一种H3K4甲基化转移酶,在巨噬细胞功能维持和抗微生物感染的炎症反应中具有重要作用,当巨噬细胞缺失Mll4时,巨噬细胞上LPS或其他细菌的共识别受体-糖基磷脂酰肌醇锚定的CD14丢失,从而使得LPS触发的胞内信号受损,基因表达发生改变,细菌感染触发的天然炎症反应也相应减弱[279]。此外,甲基化转移酶Setdb2被报道介导了机体对于继发于病毒感染的细菌感染的过度应答[280]。流感病毒感染后,Setdb2是唯一上调的蛋白质赖氨酸甲基化转移酶。Setdb2受到Ⅰ型干扰素诱导后,募集在Cxcl1基因启动子区域抑制其H3K9三甲基化水平,从而下调CXCL1(及其他一些NF-κB靶基因)表达,并抑制细菌刺激后中性粒细胞向肺部的趋化,导致机体对于继发于病毒感染的二次细菌感染更为敏感,炎症更为严重。该研究提示了表观酶Setdb2在机体抗病毒及抗细菌免疫应答交叉调控中的作用。
关于组蛋白修饰在适应性免疫炎症应答的作用基本是围绕组蛋白修饰如何调控各亚群Th细胞活化分化而开展的。组蛋白乙酰化修饰通过影响Th1/Th2/Th17细胞分化,参与调控炎症反应的类型。研究发现Ifng和Il4基因位点组蛋白乙酰化的改变参与了Th1和Th2型细胞间的极化[281]。更进一步的研究发现在Th0细胞中,组蛋白去乙酰化酶-Sin3A复合物招募于Ifng位点并阻止H4乙酰化修饰的聚集,而当此复合物以T-bet依赖的机制被移除后,H4乙酰化在Ifng位点聚集并可诱导Th1细胞的分化[282]。而HDAC1缺陷T细胞中Th2型细胞因子分泌增加,且在过敏气道炎症反应模型中该缺陷小鼠表现出更明显的炎症反应,即条件性的敲除T细胞中的HDAC1将会增加Th2型细胞因子的分泌和气道炎症反应[283]。另外,研究发现,使用HDAC抑制剂曲古柳菌素A等可以阻断Th17极化细胞因子IL-23等的分泌[284]。同样,组蛋白的甲基化修饰也参与了Th1/Th2/Th17细胞的分化过程。通过绘制初始T细胞、Th1、Th2、Th17、诱导型Treg和天然Treg细胞的全基因组H3K4和H3K27三甲基化修饰图谱,可部分解释效应T细胞与调节性T细胞间的不同[285]。而对初始T细胞、Th1细胞、Th17细胞、TGF-β刺激维持其表型的Th17前体细胞,以及IL-12刺激具有类Th1表型的Th17细胞这5种T细胞亚群,具体分析它们Il17a-Il17f和Ifng基因位点的H3K4和H3K27三甲基化修饰水平,发现Th1和Th17细胞的Ifng基因位点都具有高表达的H3K4三甲基化修饰水平,而与Th17细胞相比,Th1细胞Il17a和Il17f基因位点上表现较低水平的H3K27三甲基化修饰。而当IL-12刺激时,Th17细胞开始具有Th1细胞表型,而Il17a-Il17f和Ifng基因位点的H3K4和H3K27三甲基化修饰水平也渐趋向于与Th1细胞相一致。该研究证实不同基因位点上H3K4和H3K27甲基化修饰间的转换,参与了Th1和Th17细胞的分化[286,287]。另外特异性抑制PU.1位点的抑制性甲基化修饰时,将会使T细胞往Th9方向极化,参与呼吸道炎症的发生[288]。此外,甲基化转移酶在T细胞分化中的种类及其作用也渐渐被发现。H3K4甲基化转移酶Mll1与c-Myc、GATA3相互结合,被招募至Il13的基因位点,增强该位点的H3K4甲基化水平,而降低H3K9乙酰化水平,从而参与IL-13的转录活化,最终影响Th2型记忆细胞的分化发育[289]。Mll1还参与调控Th2型细胞因子如IL-4的表达[290]。甲基化转移酶Ezh2则在维持Treg细胞活化及分化中发挥关键作用[291]。CD28刺激诱导Ezh2上调,Treg细胞特异性敲除Ezh2导致Foxp3+Treg细胞明显降低,并伴随严重的自身免疫性疾病。进一步研究表明,Ezh2缺失后,Treg细胞中谱系基因呈现出与Foxp3缺陷Treg细胞相似的变化。
在自身免疫性疾病的发病机制研究中,环境因素与遗传因素共同影响了自身免疫性疾病的易感性和疾病进展。而组蛋白修饰,作为表观遗传修饰的一种,既具有可遗传性,又受环境因素的影响,从此为出发点,有望更深入和全面的解释自身免疫性疾病的发病机制。虽然目前组蛋白修饰在自身免疫性疾病中的作用仍知之甚少,但为数不多的研究显示组蛋白修饰机制的异常与自身免疫性疾病的发病机制密切相关。在SLE病人的T细胞中,使用HDAC抑制剂TSA可以挽救异常的CD154、IL-10和IFN-γ的表达,从而表明TSA可以通过影响T细胞亚群分化和功能活化,参与调控SLE病情的发生发展,也提示HDAC抑制剂可能被应用于临床自身免疫性疾病的干预中[292]。近期有研究发现,RA病人的外周血单核细胞(PBMC)中HDAC的酶活性明显升高[293],在RA中降低HDAC的活性,可以通过调控多种NF-κB相关基因缓解病情[294,295],并且RA的病理进程还伴随着甲基化-CpG-结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2)介导的异常组蛋白甲基化修饰[296]。在早期MS的病变过程中,少突胶质细胞上组蛋白H3去乙酰化修饰是其潜在标识之一[297]。在DSS诱导的模拟人IBD的结肠炎模型中,伴随着炎症的发生,结肠内皮细胞的多基因位点发生异常的H3K27甲基化修饰[298],并且在黏膜炎症部位存在异常升高的组蛋白H4K8和K12位乙酰化[299]。Ⅰ型糖尿病病人的淋巴细胞而非单核细胞中与自身免疫和炎症相关的多个基因位点如IL-6、CLTA4呈现更多的H3K9二甲基化修饰,提示该种组蛋白修饰的异常可能作为Ⅰ型糖尿病的一种潜在诊断标识[300,301]。由此可以看出,自身免疫性疾病的发病过程中伴随着组蛋白的异常修饰,而组蛋白修饰的异常也可能导致自身免疫性疾病的发生发展,深入研究二者之间的关联将为自身免疫性疾病的临床诊断治疗提供更多的潜在标识和靶点。
2.DNA甲基化
单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞是单核/吞噬细胞系统中最具代表性的细胞。单核细胞和巨噬细胞分别存在于血液和组织中,是炎症反应中关键的效应细胞和调节因子。白细胞介素-1β(IL-1β)是表达于单核细胞的促炎症细胞因子,并可通过DNA甲基化进行调控。在巨噬细胞中,表观遗传学机制是调控其表型和功能的关键因素。虽然DNA甲基化在巨噬细胞中还没有研究报道,但组蛋白修饰在促炎细胞因子的表达以及巨噬细胞极化为M1和M2亚型中发挥重要作用。最近的一项研究对母胎界面的单核细胞和巨噬细胞进行了DNA甲基化谱分析[302],发现相对于母体细胞,在胎儿细胞中M1型巨噬细胞的特征基因呈高甲基化状态,而编码M2型巨噬细胞的基因甲基化程度较低。这些结果表明,DNA甲基化状态与母胎界面的抗炎症反应有关。适当的刺激可促进单核细胞向DC分化,继而激活初始T细胞参与免疫反应。在单核细胞向DC的分化过程中,DC-SIGN、CD209的表达与DNA甲基化水平减低有关,而这些分子对于DC分化和DC-T细胞相互作用是必需的。用5azaC处理人单核细胞来源的DC可增加共刺激分子CD40和CD86的水平,并通过活化T细胞诱导IFN-γ和IL-17A细胞因子的表达,促进Th17细胞分化[303]。因为DC的主要功能是激活初始T细胞和诱导初次免疫应答,其功能的调节可能在控制不适度的特异性免疫应答中发挥重要作用。对这些表观遗传机制更深层次的了解有助于对DC特异性表达的基因及其功能进行调控,为新的免疫治疗策略提供理论基础。
造血系统DNA甲基化模式的改变影响着免疫细胞成熟、分化和功能调控中关键基因的特异性转录。然而在不同外界刺激信号(细胞因子、病毒感染、激素和化学试剂)作用下,免疫细胞也可以改变其基因表达以适应新的环境。初始CD4+T细胞分化成效应T辅助(Th)亚群(Th1、Th2和Th17)或诱导性调节T细胞(iTreg)依赖于两个层面的表观调控:T细胞亚群的分化及不同亚群细胞对外界环境的适应。以Th细胞分化为例,DNA甲基化对初始T细胞分化为Th1或Th2亚群至关重要。Th1细胞是由转录因子T-bet(又称为TBX21)调控的介导细胞免疫反应和IFN-γ产生的重要免疫细胞。Th2细胞则由转录因子GATA结合蛋白3(GATA-3)调控,主要分泌IL-4、IL-5和IL-13,促进体液免疫应答。初始T细胞分化为成熟的Th1或Th2亚群需要IFNG、IL-4和IL-13基因的染色质重塑[304]。在初始T细胞和Th1细胞中IFNG启动子区的低甲基化,有利于该基因在T细胞受体(TCR)激活时快速表达。但是,人初始CD4+T细胞中IFNG基因启动子区处于高甲基化状态,而仅在其向Th1细胞分化过程中处于低甲基化状态[305]。相比之下,IL-4启动子区在初始CD4+T细胞和Th1细胞中均处于高甲基化状态。在Th2细胞中,IL-13启动子区和IL-4启动子区的第2个内含子区域处于去甲基化状态[306]。因此,关键基因的差异甲基化模式决定了T细胞分化为不同细胞亚群。DNA甲基化对于Th17和iTreg的分化也发挥重要调控作用。Th17细胞主要由转录因子RORγt(又称RORC)调控,高分泌IL-17。IL-17a基因启动子区在初始CD4+T细胞中呈高甲基化,而在分泌IL-17A的效应细胞中处于去甲基化状态。越来越多的报道证实,Th17细胞中IL-17a、IL-17f、IFNG和RORγt位点的染色质结构可以对细胞外因素发生快速改变,这是造成Th17细胞可塑性极高的原因[307]。Th17细胞能够分泌IFN-γ和IL-17(体内Th1/17细胞),这与其IFNG、IL-17A和RORC2启动子区的低甲基化程度相一致。此外,在体外TCR活化信号刺激下,来源于肿瘤浸润淋巴细胞的Th17细胞克隆可分化为FoxP3+细胞[308]。Th17细胞向Treg细胞的分化与FoxP3的去甲基化和抑制功能的获得相关。令人们感兴趣的是,Th17细胞衍生的调节性T细胞(Treg)不能够反向再向Th17转换,这可能对免疫治疗具有重要的临床意义。CD8+T细胞是细胞毒性T细胞,在抗病原体和肿瘤的细胞免疫反应中发挥作用。在抗原刺激下,一些转录因子(如T-bet)和细胞因子基因(如IFNG和IL-2)的DNA去甲基化和组蛋白修饰是促进CD8+T细胞活化所必需。这也说明记忆性T细胞保留了一些效应T细胞的表观遗传学特征,从而在再次感染中能够发挥更加迅速和强烈的免疫反应[309]。然而,慢性感染可使CD8+T细胞向记忆型T细胞分化的关键基因去甲基化,并且这与CD8+T细胞的失能相关。在慢性病毒感染和免疫系统衰老的状态下,反复的抗原刺激能够损害抗原特异性T细胞的功能,这些细胞可以失去其功能(失能细胞)或复制能力(衰老细胞),损害免疫力[310]。
3.非编码RNA
microRNA(miRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)属于两种重要的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)类型,具有广泛而重要的生物学功能。近期研究证实miRNA和lncRNA在免疫系统发育和功能的各个环节发挥关键而多样的调控作用。
miRNA是细胞内长度为18~25个碱基的寡聚核苷酸,其在进化过程中高度保守并具有广泛的生物学功能。miRNA通常能够作用于mRNA的3'非翻译区,进而在转录后水平上调控基因的表达。目前在哺乳动物中发现miRNA的数目已超过800个,其中绝大部分功能未知,是目前众多科学工作者追逐的热点。已有研究表明,miR-17-92簇、miR-150、miR-155、miR-181以及miR-223等在髓系及淋巴细胞成熟、增殖、分化过程中起重要作用[311]。miRNA参与免疫应答调控近期也成为研究的热点,如miR-9、miR-15a、miR-16、miR-21、miR-146a以及miR-155等被证明能够负向调节天然免疫应答。miR-223、miR-15a及miR-16可通过调节巨噬细胞分化过程中IKKα的表达,调控非经典NF-κB信号通路活化[312];miR-21通过调节PDCD4表达,负向调控TLR4通路[313]。单核细胞和中性粒细胞经LPS活化后能够诱导miR-9的表达,而miR-9又能通过抑制NF-κB转录转而负向调控该炎症效应[314]。在活化的人类单核细胞来源的DC中,miR-155能直接作用于TLR/IL-1通路中的TAB2蛋白,进而负向调控促炎细胞因子产生[315]。
同样,科学家也关注着miRNA在适应性免疫应答中的作用,已有报道显示了miR-155及miR-181a对于T细胞免疫应答的重要作用。T细胞活化中IL-2诱导的miR-182靶向Foxo1并促进T细胞克隆扩增[316];miR-155参与调节Th17分化并促进自身免疫性疾病的发生[317]。胸腺发育过程中的Foxp3的表达伴随着miR-155的表达升高,继而通过抑制SCOS-1维持了Treg的竞争活力及由IL-2-STAT5途径介导的增殖活性,而并不影响Treg的免疫抑制功能[318,319]。此外,miR-125b特征性表达于初始CD4+T细胞中,调节多个T细胞分化相关分子的表达,如IFNG、IL2RB、IL10RA及PRDM1[320]。miR-155通过调节Th17/Th1分化参与机体抗幽门螺杆菌感染免疫[321],并参与自身免疫性关节炎的发生[322]。miR-155在效应性CD8+T细胞及效应记忆性CD8+T细胞中高表达,而在初始CD8+T细胞及中央记忆性CD8+T细胞中低表达。miR-155缺失能增强CD8+T细胞中Ⅰ型IFN/STAT1/IRF-7信号,进而抑制CD8+T细胞活化及记忆T细胞应答,削弱抗病毒效应;而miR-155过表达能够促进CD8+T细胞的抗病毒免疫应答。此研究揭示了miR-155对IFN及病原体诱导的CD8+T细胞免疫应答的调控作用[323]。自然发生Treg细胞高表达miR-10a,而维甲酸和TGF-β能诱导Treg表达miR-10a。miR-10a能同时靶向Bcl-6和Ncor2,减弱Treg向Tfh分化,同时miR-10a还能抑制Th17细胞分化,因而在T细胞亚群分化过程中发挥重要作用[324]。miR-181a下调与年老相关,并参与调控TCR信号。他们发现TCR介导的ERK磷酸化水平随着年老而减弱,而miR-181a下调介导的DUSP6(dual specific phosphatase 6)表达上升导致了这一过程。过表达miR-181a能降低CD4+T细胞中DUSP6,从而促进T细胞活化、增殖及Th1型免疫应答。因而DUSP6可能成为提高老年人T细胞功能以增强疫苗效力的潜在干预靶标[325]。microRNA簇miR-17~92对Tfh细胞分化及功能发挥关键性调控作用[326,327]。miR-17~92一方面能控制Rora等不利于Tfh分化的基因的表达,另一方面促进ICOS及PI(3)K信号介导的T细胞向B细胞淋巴滤泡迁移,进而促进Tfh分化及T细胞依赖的抗体生成,促进机体抗病毒感染免疫应答。
可见miRNA在免疫系统中所发挥的作用十分广泛,目前仍存在大量空白领域有待研究,如探求在免疫系统中发挥作用的新miRNA,参与免疫应答调控的miRNA的自身调控机制以及免疫应答中miRNA表达谱的系统研究等,miRNA在免疫系统中所发挥的作用应该也会受到更为广泛的关注和得到更为深入的研究。
除miRNA外,哺乳动物基因组能够转录产生大量的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA),其生物学功能特别是在免疫应答中的功能成为目前研究的热点。研究表明lncRNA通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用对基因表达、mRNA稳定及信号转导产生广泛的调控作用,在干细胞分化、肿瘤转移、特别免疫细胞分化及功能中发挥重要作用。利用第二代RNA测序技术为基础的RNA测序及de novo转录组构建技术,研究者在13个T细胞和B细胞亚群中鉴定了超过500个未知LncRNA[328]。其中,Lnc-MAF-4特异性表达于Th1细胞亚群,功能上能够通过染色质修饰子负向调控Th2亚群转录因子MAF-4转录,进而抑制Th2细胞分化。该研究深入揭开了人类淋巴细胞中LncRNA表达特点和Lnc-MAF-4在Th细胞分化中的功能。此外,研究者鉴定了人骨髓及胸腺中包括造血干细胞、共同淋巴祖细胞等在内的9个淋巴细胞发育早期的细胞亚群的LncRNA表达谱,深入研究了LncRNA在T、B细胞早期发育中的调节机制[329]。最新研究证实,lincRNA-EPS是一个抑制炎症性基因的重要lncRNA。lincRNA-EPS定位于免疫应答基因(immune response gene,IRG)的调节性区域,通过其3’端的CANACA结构域与hnRNPL蛋白相互作用,控制核小体重塑并抑制IRG在基础水平及TLR4刺激后的表达。与此相一致的是,lincRNA-EPS基因缺陷小鼠与野生型相比在内毒素刺激后表现出过度的炎症反应,死亡率增加。然而lincRNA-EPS为何能调控如此多的IRG,如何定位到特殊的基因位点,其与DNA、RNA、蛋白之间如何发生复杂的相互作用尚有待进一步研究[330]。
虽然越来越多的研究找到了在免疫系统发生及免疫应答过程中发挥作用的LncRNA,然而尚缺乏有效研究手段来系统寻找LncRNA在体内的直接结合蛋白。针对这一问题,研究者利用RNA反义纯化(RNA antisense purification,RAP)技术得到LncRNA复合物,进而用定量质谱(mass spectrometry,MS)的方法鉴定出直接结合蛋白(合称为RAP-MS)[331]。利用RAP-MS技术,已鉴定得到与Xist(一个与X染色体转录沉默密切相关的LncRNA)直接结合的10个蛋白质,并发现其中SHARP、SAF-A和LBR三个蛋白对Xist发挥转录沉默功能是必需的。Xist通过与SHARP直接相互作用,招募SMRT以活化HDAC3,并介导组蛋白去乙酰化,屏蔽PolII在Xist附着区域的募集。该研究提供了一种LncRNA机制研究的技术方法。未来研究将进一步解释表观遗传学各类修饰方式在免疫细胞活化过程中的交叉调控机制,及如何实现对免疫关键分子的基因水平及蛋白水平的准确调控。
(七)炎性复合体与炎症和天然免疫调控的研究
炎性复合体(inflammasome)是由NLR(NOD-like receptor)、炎性caspase以及接头蛋白组成的分子复合物[332]。例如,在外来刺激的作用下,细胞内NALP3、caspase-1、Cardina 1以及ASC可以相互作用形成复合物,最终导致caspase-1的活化,继而可以剪接、活化 pro-IL-1β和 pro-IL-18[333]。近年来陆续发现多种PAMP、DAMP(danger-associated molecular pattern)、细菌毒素、病毒可以活化炎性复合体,促进IL-1β的剪接、成熟。例如,LPS、细菌RNA、Poly I:C、Peptidoglycan等PAMP可以活化NALP3炎性复合体,Nigericin、Listeriolysin O以及α-Toxin等细菌毒素可能激活NALP3炎性复合体。另外,近来特别受关注的DAMP(ATP、MSU、ROS)以及一些病毒也可以活化NALP3炎性复合体[334]。尽管多种因素均可以导致炎性复合体活化,但是目前仍不清楚导致其活化的最直接因素。二氧化硅、铝盐以及β淀粉样蛋白也可以活化NALP3炎性复合体,但它们可能是通过诱导溶酶体通透性改变,导致Cathepsin B释放而诱导NALP3炎性复合体活化,但是Cathepsin B如何活化NALP3仍不清楚[335]。另外,ATP结合P2X7受体后,成孔蛋白pannexin-1能够将胞外 NALP3刺激转运到细胞内。那么 ATP诱导的 K+外流很可能是通过相同的pannexin孔隙,诱发溶酶体通透性的改变,从而导致Cathepsin B的释放。另外一个关键问题是需要在体内研究所有的NLAP3活化剂诱导炎症并参加病理性疾病的过程,以及干预NALP3炎性复合体是否有治疗效应。关于其他的炎性复合体如NALP1、NALP2、NALP4-14以及IPAF等目前仍知之甚少。可见,自从炎性复合体概念提出以来,使得人们对胞内模式识别受体(NLR)、炎性相关的caspases(caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-11、caspase-12)、DAMP、炎性细胞因子(IL-1β)之间的关联,以及它们和固有免疫之间的关系有了更深的了解,也认识到了它们的重要性[336]。可以预见对炎性复合体的活化、调控机制的研究将是有关炎症、固有免疫领域研究的新生长点和突破点。
炎性复合体可被多个NLR成员触发(NALP3炎性复合体、NALP1炎性复合体、NLRC4炎性复合体),通过caspase-1促进pro-IL-1β剪切,生成成熟IL-1β。最新研究报道了一种新型炎性复合体活化方式,即胞外Dectin-1触发的非经典caspase-8炎性复合体。Dectin-1是一种胞外CLR,识别β-Glucan,通过ITAM基序招募Syk,促进CARD9-Bcl-10-MALT1复合体活化而激活NF-κB活化,介导抗真菌免疫应答。真菌和分枝杆菌感染过程中,胞外Dectin-1招募MALT1-caspase-8和ASC加入CARD9-Bcl-10-MALT1复合体,活化非经典caspase-8炎性复合体,促进pro-IL-1β剪切成熟[337]。
ASC是炎性复合体的关键成分,Cell杂志同期报道在炎性复合体活化过程中,信号分子ASC蛋白依赖CARD、PYD结构域的朊病毒样的纤维聚合过程形成蛋白纤维,激活下游信号和炎性细胞因子的生成[338,339]。而Nature Immunology杂志同期报道,炎性复合体活化过程中,ASC蛋白颗粒被释放到胞外,在胞外继续活化caspase-1和IL-1β,或被邻近细胞内吞而活化下游信号,不断放大炎性反应[340,341]。这对于以往研究中关于炎性复合体胞内活化激活炎症反应的认识进行了重要补充,但是,对于ASC分泌胞外继续放大炎症效应的工作,尚有待于进一步验证。
1.NALP3炎性复合体
MDP、R837、R848、细菌RNA、DNA病毒、胞内菌等多种胞内刺激,ATP、微生物毒素、尿酸结晶、CPPD、UV-B照射、明矾、二氧化硅、石棉、淀粉样蛋白-B等多种胞外刺激均能活化NALP3炎性复合体,结合ASC和CARDINAL,活化caspase-1,介导炎性反应。最新的研究对NALP3炎性复合体的活化机制有了新的补充。革兰阴性菌感染后能活化TRIF,进而通过Ⅰ型IFN信号通路活化caspase-11,从而活化并与NALP3炎性复合体协同促进caspase-1活化[342]。齿周病原菌齿垢密螺旋体表面蛋白Td92刺激的巨噬细胞中,膜受体整合素α5β1与Td92直接作用,介导NLRP3炎性复合体激活及下游caspase-1活化及IL-1β分泌[343]。此外,在细胞凋亡过程中释放的氧化线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)能结合并活化NALP3炎性复合体,缺失mtDNA的巨噬细胞分泌IL-1β被明显抑制。这一研究提示了细胞凋亡与炎性复合体活化之间的关联机制[344]。当胞外渗透压降低时,细胞肿胀,进而介导K+依赖的NALP3炎性复合体构象改变而活化NALP3炎性复合体和caspase-1,而调节性体积减少(regulatory volume decrease,RVD)则能控制该过程[345]。因此,细胞体积改变这一基本的病理生理过程能调节NALP3炎性复合体活化。DNA经AIM2识别后能激活炎性复合体,促进caspase-1依赖的IL-1β成熟。胞内RNA能被RNA解旋酶DHX33识别,从而活化NLRP3炎性复合体[346]。
对于炎性复合体的胞内定位、组装的调控机制目前尚缺乏认识。受NLPR3炎性复合体刺激物诱导产生的乙酰化α-微管蛋白能够介导线粒体运输,继而促进线粒体上的ASC定位到内质网上的NLPR3,形成功能活化的NALP3[347]。此外线粒体适配蛋白MAVS能促进胞浆中游离的非活化NLRP3定位至线粒体,促进NLRP3介导的IL-1β产生。而NLRP3能以其N端结构域调节MAVS在线粒体上的定位。这一研究对NLRP3在特定亚细胞器上的定位和激活机制进行了完善[348]。
关于代谢相关产物在NLPR3激活中的作用和机制受到广泛关注。模式识别受体CD36能够促进胞内可溶性配体氧化低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、β-淀粉样蛋白和胰淀素肽形成胆固醇晶体或淀粉样纤维,从而活化NALP3炎性复合体,促进IL-1β成熟。胆固醇结晶可通过激活炎性复合体促进IL-1β产生,从而触发动脉粥样硬化过程中的无菌性炎症的进展[349]。而脂肪酸能通过炎性复合体非依赖的方式刺激IL-1α的产生,从而促进血管炎症的发生,揭示了IL-1α在心血管疾病中全新的功能[350]。
过度的炎性复合体活化及IL-1β过量分泌将引发组织损伤,甚至诱导慢性炎症性疾病的发生。因此,炎性复合体活化必须受到严格调控,以避免免疫损伤的发生。结核杆菌慢性感染过程中,淋巴细胞分泌的IFN-γ能通过NO抑制NLRP3依赖的IL-1β产生,进而避免免疫病理损伤[351]。这一研究揭示了机体在启动免疫应答清除病原体感染之后的负反馈调控机制,有助于寻找慢性炎症性疾病及自身免疫性疾病的干预手段。NOD2-RIPK2-NF-κB/MAPK是机体抵抗细菌感染的重要通路,而NOD2-RIPK2信号也能负向调节NLPR3炎性复合体活化及IL-18分泌,从而抑制病毒感染导致的免疫病理发生[352]。这也显示机体抗细菌、病毒等病原体侵袭过程中PRR下游信号之间存在广泛而紧密的交叉调控,共同协调天然免疫应答的最终效应。
炎性复合体的功能失调与许多人类疾病的发生、发展密切相关。从年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)患者眼睛中提取的玻璃膜疣及玻璃膜疣成分C1Q能活化NALP3复合体及IL-1β和IL-18产生。Nlrp3-/-小鼠中激光诱导脉络膜新生血管(AMD小鼠模型)明显增强,提示NALP3在AMD发病中的保护作用[353,354]。这为AMD的诊断和治疗研究提供了新的思路。此外,两种常见的化疗药物Gem和5-FU诱导组织蛋白酶B(cathepsin B)释放,进而活化MDSC中的NLRP3炎性复合体及下游caspase-1和IL-1β;MDSC来源的IL-1β进而促进CD4+T细胞释放IL-17,从而限制化疗药物的抗肿瘤效应。Nlrp3-/-小鼠、Casp1-/-小鼠及接受IL-1R阻断剂的小鼠均对以上化疗药物介导的抗肿瘤效应更为敏感[355]。这些研究为年老、肿瘤这些重大健康问题的干预手段的研究提供了新的思路。
2.NLRC4炎性复合体
NAIP能识别细菌鞭毛及Ⅲ型分泌系统,通过NLRC4促进炎性复合体,招募ASC及caspase-1。然而对NLRC4在炎性复合体活化中的具体作用机制尚不了解。PKCδ介导的NLRC4的Ser533位点磷酸化对NLRC4炎性复合体形成具有关键作用,此研究揭示了炎性复合体形成的一个关键环节[356]。此外,肠道单核吞噬细胞(intestinal mononuclear phagocyte,iMP)在共生菌和病原菌感染后不分泌TNF或IL-6,以介导肠道对共生菌的免疫耐受,而iMP固有高表达pro-IL-1β,且只在致病性沙门氏杆菌或假单胞菌感染后激活NLRC4炎性复合体,并促进caspase-1活化及成熟IL-1β产生。NLRC4缺陷小鼠对沙门菌感染高度敏感,提示NLRC4依赖的IL-1β产生对于机体维持对肠道病原菌的免疫应答及对共生菌的免疫耐受发挥重要作用[357,358]。
3.NALP7、NALP12炎性复合体
除了已报道的NALP1、NALP3及NLRC4炎性复合体,对其他NLR家族成员在炎性复合体活化过程中的作用知之甚少。微生物来源的酰化脂肽刺激能诱导人巨噬细胞NLRP7介导的ASC依赖的caspase-1活化,以及IL-1β和IL-18成熟,进而抑制胞内细菌复制,而并不诱导炎性细胞因子IL-6和TNF-α产生[359]。该研究补充了人们对NLR活化、炎性复合体组装及IL-1β活化的机制的认识。NALP12是在生化检测中第一个被发现的具有结合ASC活性并形成功能炎性复合体的NLR成员,然而对NALP12在天然免疫应答、特别是机体抵抗微生物感染中的作用并不了解。NLRP12缺陷小鼠对鼠疫杆菌感染更为敏感,因而削弱NLRP12炎性复合体活化可能是高毒力鼠疫杆菌进化的关键环节[360]。
(八)免疫细胞的代谢与功能
免疫系统代谢(immunometabolism)领域的研究主要包括两个方面:一方面侧重于免疫细胞对参与机体全身代谢调控的器官功能(如脂肪组织和肝脏)的效应研究;而另一方面则侧重于探索免疫细胞自身代谢特点及其代谢途径对其免疫应答功能的影响及调控。这里将主要讨论代谢途径的选择如何影响几类重要的免疫细胞的功能和命运。细胞的代谢途径彼此间存在着多个水平的交汇和分离,从而形成复杂的网络,因此细胞为了达到它们的代谢需求必须面临选择。全面了解免疫细胞如何以及为什么选择特定的代谢方式和阐明细胞通过某一代谢途径到达某一代谢终点会产生怎样的免疫后果是该领域的主要研究目的。代谢途径的选择不仅受底物供给的影响,也受代谢产物启动的信号途径的调控。因此不同的代谢模式将会直接影响细胞的功能和命运。
较普遍的观点认为糖酵解是髓系细胞获取ATP的主要代谢途径[361]。以中性粒细胞为例,早期的研究已显示中性粒细胞高度依赖葡萄糖经由无氧糖酵解分解生成ATP;与此相符的是,中性粒细胞仅存在少量线粒体并仅消耗少量氧。当TLR激动剂活化或抗体包被颗粒介导吞噬后,中性粒细胞的葡萄糖和氧消耗随之增加,但这并不是由于葡萄糖在线粒体中的氧化增强,而是由于Warburg效应和磷酸戊糖途径活性增强,后者可生成NADPH,进而辅助NADPH氧化酶耗氧生成重要的中性粒细胞抗微生物产物H2O2[362]。
存在无功能线粒体对细胞来说是很危险的,因为线粒体膜电位的丧失可导致细胞色素C释放至胞浆而触发凋亡[363]。然而,尽管中性粒细胞线粒体不能生成ATP,但它们可通过甘油-3-磷酸穿梭途径维持膜电位,该途径允许电子传递链复合体Ⅲ接受来自糖酵解途径的电子[364]。因此,通过该方式线粒体既可维持氧化还原平衡,亦可同时促进糖酵解途径而避免触发凋亡过程。中性粒细胞活化后可释放由DNA和组蛋白等构成的网状结构来捕获并杀灭病原微生物,这一杀菌方式被称之为中性粒细胞胞外网状陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)。这种防御模式不同于坏死和凋亡,它在诱捕并杀灭病原微生物的同时伴随自身的死亡,即NETosis[365]。中性粒细胞选择Warburg代谢的优势可能在于NETosis过程中可赋予中性粒细胞暂时保持活力的能力。有研究显示NETosis是NADPH氧化酶依赖的过程,这一发现亦强调了糖酵解途径在中性粒细胞发挥抗感染中的重要性[366]。
关于DC生物功能的研究大多使用骨髓细胞来源、经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子体外培养诱导分化后的细胞作为单核细胞来源,以及产生TNF-α和诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)DC的模型。静息状态下,这些细胞在线粒体中通过OXPHOS氧化分解葡萄糖,最终只产生相对少量的乳酸;而TLR激动剂活化后的DC则会发生显著的代谢转变,主要依赖Warburg代谢维持存活[367]。有研究发现糖酵解代谢的调控主要由PI3K和Akt信号介导[368],与此吻合的是,活化DC中PI3K和Akt信号对其糖酵解代谢的维持是必不可少的。在活化超过12h的DC中,尽管其葡萄糖消耗增加,但葡萄糖碳不再进入TCA循环,线粒体中氧耗亦停止;细胞生成乳酸增加,仅靠无氧糖酵解维持其存活。线粒体呼吸瓦解的原因是活化可导致iNOS的表达,后者高效分解精氨酸生成毒性气体NO[369]。NO可通过亚硝基化修饰铁硫包含蛋白如复合体Ⅰ(NADH-泛醌还原酶)、复合体Ⅱ(琥珀酸-泛醌还原酶)和复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶)抑制线粒体电子转移,从而阻断氧耗和与之偶联的ATP生成[370]。减弱的呼吸效率和炎症的关系被认识已久,细胞如单核细胞来源DC或巨噬细胞产生高水平的NO是其中的原因,因为NO快速扩散可影响炎症组织中的周边细胞[371]。另有研究发现,脑、肝脏、肾脏和肌肉细胞中低剂量的NO可刺激线粒体的生成,最终导致线粒体ATP输出的增加,而低剂量的NO在DC中是否有类似效应还不清楚。最新研究显示,TLR激动剂处理后数分钟内,DC中糖酵解流量迅速增加,这一过程对于促进脂肪生成及内质网、高尔基体的合成至关重要。而TLR介导的糖酵解流量增加依赖于TBK1、IKKε及Akt激酶活化及糖酵解酶HK-Ⅱ。这一研究揭示了TLR信号活化过程中糖酵解流量增加对于DC活化的关键作用[372]。
DC对免疫耐受的维持亦发挥重要作用。例如在肠道,对微生物菌丛反应性调控一定程度上是由肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue,GALT)中CD103+DC产生的视黄酸(retinoic acid,RA)控制的。RA是一种小的维生素A脂质代谢产物,同时是核受体RA受体(RAR)和视黄醇X受体(retinoid X receptor,RXR)的配体[373]。稳定状态下,RA可显著促进TGF-β依赖的诱导型调节性T细胞的发育以及B细胞IgA的产生,帮助维持肠道屏障的完整性,从而在肠道免疫稳态中发挥重要作用。
巨噬细胞在免疫系统中是一类重要的细胞类型。它们定居于全身绝大多数组织中。胚胎来源的巨噬细胞种植于子宫内组织并保持着原位增殖;炎症发生时,造血系统来源的巨噬细胞则由骨髓来源的单核细胞发育而来,并被招募到炎症部位[374]。针对不同的局部免疫信号和(或)病原体来源的信号,巨噬细胞可反应成不同的活化状态:干扰素-γ(IFN-γ)结合TLR激动剂可促进巨噬细胞M1型活化;而细胞因子IL-4和IL-13可促进巨噬细胞M2型活化。促炎性的M1巨噬细胞分泌炎症介质,如可促进NK和T细胞产生IFN-γ的IL-12、可活化其他免疫细胞的TNF-α,以及有直接细胞毒性的NO,在大多数微生物的感染清除中发挥重要功能。与之相反,M2巨噬细胞的功能则表现在调控炎症因子的产生、组织修复的促进和获得性免疫的调控等方面。M2型活化巨噬细胞可抵御寄生虫等后生生物的感染。更有意思的是,M2巨噬细胞亦被发现在脂肪和肝脏代谢稳态维持中发挥重要功能[375,376]。消瘦动物组织中定居的巨噬细胞表达M2活化相关基因,这类M2样细胞可通过抑制M1活化及其相关炎症促进胰岛素的敏感性;而在胰岛素抵抗的肥胖小鼠中,肝脏和脂肪中巨噬细胞呈M1样特点,其产物如TNF-α是导致胰岛素抵抗的物质基础。
M1型活化和M2型活化巨噬细胞其代谢状态各不相同。例如,M1巨噬细胞使用精氨酸作为iNOS(M1巨噬细胞中表达,M2巨噬细胞中不表达)的底物,而M2巨噬细胞使用精氨酸作为精氨酸酶1(M2巨噬细胞中表达,M1巨噬细胞中不表达)的底物[377]。M1巨噬细胞以糖酵解代谢为主,因此和活化的骨髓来源DC相似。更重要的是,线粒体呼吸减弱在活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)的产生中有重要意义。最新研究显示在TLR活化的巨噬细胞中,线粒体以依赖TNF受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)的方式被招募到吞噬溶酶体,产生杀伤被吞噬细菌的重要物质ROS[378]。活化M1巨噬细胞中PPP代谢亦发挥着重要作用。研究发现可抑制PPP途径的糖激酶样蛋白(carbohydrate kinase-like protein,CARKL)的表达可被TLR激动剂活化信号所抑制[379]。此外,低氧诱导因子1(Hypoxia inducible factor 1,HIF-1)在糖酵解而来的丙酮酸的去向选择中(转化为乙酰CoA还是乳酸)发挥着重要作用[380]。TLR信号亦可引起巨噬细胞脂质代谢的改变。举例来讲,M1巨噬细胞活化可导致花生四烯酸的代谢增强和类花生酸如白三烯和前列腺素等的产生[381]。TLR激动剂也可导致二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的代谢增加,伴随非经典烯酸如具抗炎特性的脂氧素等的合成[382]。
如果M1巨噬细胞是阳,M2巨噬细胞就是阴。M2巨噬细胞比静息巨噬细胞或M1巨噬细胞有着更高水平的线粒体基础氧耗,这反映在PGC-1β的表达水平上,PGC-1β是有氧代谢基因关键的转录调控因子。抑制线粒体OXPHOS或者抑制脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)可显著阻止M2巨噬细胞的分化。因此,M2巨噬细胞分化需要依赖FAO和线粒体呼吸[383]。M2巨噬细胞和M1巨噬细胞的不同之处还在于M2巨噬细胞在特定条件下能够增殖。增殖的M2巨噬细胞必须面临产生子细胞的代谢要求,这方面的研究还有待进一步深入。过氧化物酶体增殖子活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)在M2巨噬细胞中的作用亦引起了一定的关注。PPAR是一类配体为脂肪酸的核受体家族,它们和RXR形成异二聚体并和转录共刺激分子相互作用,共同控制脂肪酸代谢相关基因的表达。其中,对底物氧化和氧化磷酸化相关基因表达起促进作用的PPARδ已被发现为M2巨噬细胞分化所必需[384]。寄生虫感染小鼠来源的M2巨噬细胞中PPAR的表达上升,且这些细胞中同时发现存在高水平的PGI2(PPARδ的一种类花生酸配体)。更重要的是,PPAR反应元件广泛存在于M2诱导基因的启动子区,这提示PPAR是触发M2巨噬细胞活化的重要转录因子[385]。
T细胞在很多方面和天然免疫细胞不用,但它们活化后能够快速增殖是区别于其他免疫细胞的最大特点。与肿瘤细胞类似,T细胞增殖时主要采用Warburg代谢[386];另一个区别于获得性免疫系统其他细胞的特点是它们能生成长期存活的抗原特异性的记忆性T细胞。记忆性T细胞和活化的效应T细胞代谢方式非常不同,它们的发育和存活依赖线粒体FAO而不是无氧酵解[387]。当初始T细胞在适当的共刺激信号下识别抗原后,它将经历快速生长、增殖并获得特异性效应功能的发育过程,而这个需要能量的过程需要代谢方式的重新调整。对于生长和增殖状态下的细胞来讲,它们必须从分解代谢转变为合成代谢,因为不像静息细胞,营养物质不再仅仅用于维持存活和稳态,而是要为子代细胞进行物质准备。同理,静息、长寿以及终末分化的特点使记忆性T细胞倾向采取分解代谢。免疫细胞中代谢重新调整的重要性逐渐被认识。更重要的是,代谢途径能影响不同辅助性T细胞亚群的分化。举例来讲,调节性T细胞主要利用OXPHOS和线粒体FAO来维持发育和存活[388],而Th17细胞的生成则依赖糖酵解[389]。
线粒体和胞浆中的代谢途径在T细胞的活化、存活、增殖以及效应功能中发挥着重要的作用。例如,有研究已证实线粒体ROS在T细胞活化中的重要作用[390]。线粒体电子传递链复合体Ⅲ亚基的表达降低可导致该复合体来源的ROS产生减少,Sena等以该亚基T细胞特异性低表达小鼠来源的T细胞为研究对象,发现该亚基对NF-AT的活化以及后续的IL-2产生是必需的。更重要的是,尽管这些小鼠来源的T细胞在淋巴细胞减少的环境中能够增殖,但它们失去了针对感染进行抗原特异性扩增的能力。因而得出结论:线粒体ROS减弱的T细胞并不缺乏生物能量,因为它们能够进行稳态增殖;但缺乏ROS依赖的信号机制则使它们无法经历抗原特异性T细胞活化及后续的克隆扩增。这些结果提示代谢途径可作为信号机制控制细胞过程而不只是能量产生或者生物合成。另有研究显示无氧酵解的诱导对T细胞的活化过程并不是必需的,实际上这个过程需要线粒体OXPHOS。增殖细胞如肿瘤细胞和活化T细胞采用无氧酵解会让人认为无氧酵解是细胞增殖的先决条件,然而事实是天然免疫系统中大多数细胞活化采用Warburg代谢但并不增殖。
研究发现B细胞活化后其葡萄糖的摄取增加及主要依赖糖酵解代谢的特点和T细胞是类似的[391],但代谢如何决定正常B细胞的命运目前了解尚少。寿命较短的浆细胞和记忆性B细胞是否分别与效应T细胞和记忆性T细胞有着类似的代谢特征?根据它们的功能特点和寿命的相似性来看,确实存在这种可能。然而,免疫应答过程中B细胞也能分化成为长寿的浆细胞,后者可在骨髓中存活数年之久,并能持续合成大量抗体维持其血浆中的生理浓度。这类结合长寿和高效生物合成特点的细胞有着怎样的代谢模式是未来研究重要的关注点。
尽管过去的10年关于免疫细胞代谢和功能的研究取得了相当大的进展,但实际上免疫系统中大多数细胞类型的代谢模式尚属未知。代谢领域的研究对于非代谢专业的研究者来说仍存在一些难度,部分原因是其中多数实验需要特殊专业的仪器以及方法手段。更重要的是,用于鉴定“所有代谢产物”相对量的代谢组学技术上仍存在局限而无法得到广泛应用。与基因芯片或者RNA测序等技术得到的基因表达谱数据的可靠性相比,目前的代谢组学技术仍很难得到可比拟的、无偏差的、完整的代谢产物数据。不过,这样的境况正在慢慢改变,所以我们对免疫系统代谢的理解在不远的将来有望向前迈进一大步。
另外,令人兴奋的是针对代谢产物如何启动信号途径去诱导细胞功能改变的理解正在加深。举例来说,过去被归类为孤儿受体的一类受体家族GPCR被发现实际上是代谢中间产物和能量物质的受体[392]。已有越来越多的证据表明这类受体在免疫细胞中发挥着重要的功能。比如,琥珀酸通过作用于琥珀酸受体GPR91可直接促进TLR激动剂诱导的DC趋化和活化[393]。腺苷可通过A2A和A2B腺苷受体促进IL-4诱导的M2巨噬细胞活化[394]。然而,病原体或者肿瘤细胞是否也可通过产生其特有的代谢产物来影响免疫细胞的功能呢?有趣的是,γδT细胞表达的Vγ9和Vδ2受体可以特异性识别微生物代谢产物(E)-4羟基-3-甲基-2-烯基焦磷酸((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate)[395]。我们对于这种类型相互作用的认识只是冰山一角,因此很期待未来这个领域的进展。
(九)免疫分子的翻译后修饰与免疫功能调控
蛋白的翻译后修饰(post-translational modification,PTM)是胞内调控信号转导的关键性机制。除了由蛋白激酶、蛋白磷酸酶、泛素结合蛋白、E3泛素连接酶等介导的磷酸化、泛素化等经典的蛋白修饰方式,一些新的PTM修饰,诸如甲基化转移酶和乙酰化转移酶介导的针对蛋白(特别是非组蛋白)的甲基化、乙酰化修饰也对免疫相关受体或信号分子发挥重要的转录后水平的调节作用[396]。
例如,NF-κB亚基RelA/p65的赖氨酸的甲基化修饰被证明能调控TLR和TNF介导的天然免疫信号。蛋白质赖氨酸甲基化转移酶(protein lysine methyltransferases,PKMT)SETD6能介导p65的Ly310位点的单甲基化,而抑制p65诱导的炎症反应和细胞增殖[397]。SET9介导的p65的Lys37位点的单甲基化能促进p65的DNA结合活性,促进NF-κB的转录活化[398]。由于胞内存在甲基化与去甲基化双向可逆的过程,它们在天然免疫信号转导中的调控作用也存在着双向可逆性。赖氨酸甲基化酶NSD1(nuclear receptorbinding SET domain-containing protein 1)和赖氨酸去甲基化酶FBXL11(F-box and leucine-rich repeat protein 11)分别介导p65的赖氨酸甲基化和去甲基化,而相应促进和抑制NF-κB活化[399]。组蛋白甲基化转移酶Ezh2通过直接甲基化Talin,破坏Talin与F-actin的结合,促进黏附结构形成,进而促进中性粒细胞及树突状细胞的迁移[400]。蛋白去乙酰化酶Sirt1特异性高表达于mTEC细胞中,调控Aire依赖的TRA编码基因的表达,对维持自身免疫耐受发挥重要作用。Sirt1能与Aire相互作用,且诱导其去乙酰化,与CBP/P300等发挥反向的作用[401]。
此外,甲基化修饰对T细胞及B细胞介导的适应性免疫应答也发挥重要的调控作用。例如,PRMT1介导的NIP45的精氨酸甲基化能够促进NIP45与NF-AT的相互作用,激活T细胞分化相关细胞因子转录活化。另一方面,TCR信号能促进PRMT1介导的Vav1精氨酸残基甲基化而促进T细胞活化,而PRMT1介导的BCR的Igα链的甲基化能够抑制BCR下游信号分子活化。相似地,乙酰化修饰在免疫应答也发挥重要的调控作用,TLR信号能介导MKP-1的乙酰化,促进MKP-1与P38的相互作用,介导P38的去磷酸化,抑制TLR信号活化[402]。
此外,PTM修饰与免疫相关疾病的关联正受到越来越多的关注,例如PKMT和PRMT家族被证明与肿瘤发生密切相关。而目前,随着高通量蛋白质组学和生物信息学的飞速发展,对蛋白质的甲基化、乙酰化等非经典翻译后修饰方式的鉴定和功能研究已经成为免疫分子功能调控领域的重要突破口,并为免疫学在相关疾病发病机制和治疗手段研究中的转化应用提供了新的方向。
(十)临床免疫与转化医学研究
医学的基础理论研究的最终目标是能够服务于临床疾病防治及人类健康,免疫学家不遗余力地希望通过多种免疫学的手段,如抗体、重组细胞因子、疫苗、微生物制剂等治疗困扰人类的重大疾病,如恶性肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、移植排斥等。目前治疗性疫苗的研制工作在慢性乙型肝炎、类风湿性关节炎等多个领域广泛开展,基因疫苗也积极开展在抗感染、抗肿瘤方向的研究,新型疫苗佐剂的研发大大提高了疫苗接种的效率。新一代高效抗体药物不断涌现,在器官移植、白血病、自身免疫病等多种疾病中疗效显著。2009年,美国FDA新批准上市的抗TNF-α单克隆抗体Golimumab[403],已被用于临床治疗风湿性关节炎、强直性脊柱炎及银屑性关节炎。值得一提的是,2009年甲型H1N1流感疫苗的上市和使用为有效控制全球范围内的甲流蔓延发挥了关键作用。
肿瘤免疫学是研究免疫效应、功能与肿瘤发生、发展的相互关系的学科。近年来,免疫学的发展为肿瘤机制探索、诊断治疗策略的革新带来许多新的突破。肿瘤疫苗是目前肿瘤生物治疗的研究热点之一,包括肿瘤细胞疫苗、分子瘤苗、以DC为基础的疫苗以及核酸疫苗等。以2006年6月8日美国FDA正式批准美国默克公司(Merck)生产的HPV疫苗作为宫颈癌疫苗(Gardasil)上市为标志,意味着宫颈癌有可能成为人类通过多种方法包括疫苗接种来全面预防和根除的第一个恶性肿瘤。2010年4月29日,由美国Dendreon公司生产的Provenge成为首个被美国FDA批准正式上市的治疗性肿瘤疫苗,用于晚期尤其是对激素疗法失效的前列腺癌治疗[404]。Provenge是一种提呈的肿瘤抗原多肽的自身DC疫苗,临床试验表明该疫苗治疗组总体生存期比对照组延长4.1个月。Provenge的上市是肿瘤疫苗研究历史上的重大事件,不仅鼓舞了肿瘤疫苗的研发人员,更增强了人们对于攻克肿瘤的信心。另外,值得关注的是免疫治疗的多种方案的联合应用,例如,CTLA-4抗体阻断联合瘤苗、干扰素联合化疗治疗肿瘤,除去抑制性免疫细胞(如清除体内Treg)有利于激活抗肿瘤免疫应答反应。2002年12月Science提出2013年关注的六大科学领域,其中之一是肿瘤免疫治疗,2013年12月20日的Science在总结国际十大科技进展时,将肿瘤免疫治疗置于首位,使得全球科学家对于免疫学前沿进展与临床应用给予极大关注。从2002年开始,笔者实验室历时12年完成了自体DC瘤苗与化疗序贯性联合应用方案治疗晚期转移性结肠癌患者的Ⅱ期临床试验,取得了令人兴奋的临床结果。可以预见,随着多种免疫治疗技术(如新型免疫基因治疗技术)的提高与改良,免疫治疗将在疾病治疗中发挥越来越大的作用。
在机体的抗肿瘤免疫应答机制方面,C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CLR)Dectin-1介导的天然免疫识别在NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答中的作用。DC表面表达的Dectin-1通过对肿瘤表面表达N-glycan抗原的模式识别,活化IRF5,Dectin-1-IRF5通路活化的下游分子,促进NK细胞介导抗肿瘤杀伤效应[405]。该研究提示N-glycan可能是一种新型的肿瘤相关模式分子(tumor-associated molecular pattern),也揭示了天然免疫信号对于机体抗肿瘤免疫应答的调节机制,为未来利用天然免疫信号辅助激活抗肿瘤免疫应答以提高肿瘤治疗效果提供了理论依据。
此外,近期的研究对新型的抗肿瘤免疫学治疗手段进行了探索。复发性急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种非常顽固的恶性肿瘤,治疗非常困难。靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞可有效治疗白血病。30名复发或难治型ALL患者回输自体CD19-CAR-T细胞(CTL019)后,27名患者达到完全缓解。该研究提供了一种新型的针对复发性ALL的免疫治疗方案[406]。之后科学家研究了不同回输手段对CAR-T细胞治疗实体瘤效果的影响。在一种胸膜恶性肿瘤模型中,相对于静脉注射,胸膜内局部注射靶向间皮素的CAR-T细胞可以激发更强的T细胞增殖、活化及维持,达到更好的抗肿瘤效果[407]。此研究提示局部注射可使CAR-T细胞免疫治疗在某些实体肿瘤中达到更好效果。然而,CAR-T疗法中T细胞过度活化可能导致严重的机体损伤,一种仅在相应药物作用下才会活化的新型“On-Switch”CAR-T细胞可以较精确控制CAR-T细胞活化的时间、部位和剂量,有效减轻治疗的副作用[408]。该研究开创性地提出了利用化学药物提高CAR-T细胞免疫疗法安全性的方法。
效应性T细胞在肿瘤局部的浸润能够直接促进机体抗肿瘤免疫应答,越来越多的研究从不同的角度揭示了这一过程的调控机制。在趋化因子对T细胞的趋化活性方面,二肽基肽酶(dipeptidylpeptidase 4,DPP4,又称CD26)能够通过对趋化因子的翻译后剪切抑制淋巴细胞向炎症及肿瘤部位迁移[409]。抑制DPP4酶活性能够上调CXCL10的水平,促进CXCR3+T细胞向肿瘤的浸润,抑制肿瘤生长。该研究提示,DPP4抑制剂可能成为一个全新的维持趋化因子活性的肿瘤治疗药物。在肿瘤局部T细胞的代谢方面,Cell杂志上同期的两篇论文报道肿瘤局部的葡萄糖代谢异常限制了T细胞的葡萄糖利用率,最终促进了肿瘤的发生发展[410,411]。此外,不可忽视的是其他免疫细胞在肿瘤的T细胞浸润过程中的作用,活化的嗜酸性粒细胞通过增强肿瘤特异性CD8+T细胞的浸润,帮助机体抵抗肿瘤,提示嗜酸性粒细胞可能成为新型的肿瘤治疗策略[412]。
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引发的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)严重威胁人类健康。HIV通过损伤CD4+T细胞及表达CD4的单核/巨噬细胞、树突状细胞和神经胶质细胞,导致免疫功能缺陷,引发严重的机会感染、恶性肿瘤及神经系统疾病。免疫学家不遗余力从免疫应答和调节各个角度和层面研究HIV感染导致AIDS的发病机制,以寻求预防、治疗HIV的可靠手段。艾滋病患者体内Tfh细胞功能缺陷,生发中心B细胞PD-L1表达升高,Tfh细胞对B细胞功能的支持作用受损。体外实验表明PD-1可抑制Tfh细胞增殖和活化,降低ICOS和IL-21表达;而阻断PD-1信号可增强HIV特异性的抗体生成。该研究表明HIV感染导致Tfh功能受损,削弱了其对B细胞活化的辅助作用,这一现象可能与PD-1/PD-L1信号通路活化相关[413]。这不仅从Tfh细胞的角度对HIV发病机制提出了新的解释,更对HIV感染的控制及疫苗研制提供了潜在的靶点。2013年8月8日,美国食品和药品监督管理局(food and drug administration,FDA)批准第一个HIV快速测试方法Alere Determine HIV-1/2 Ag/Ab Combo test,可以同时检测人血清、血浆、静脉或指尖全血标本中的HIV-1 p24抗原以及HIV-1和HIV-2抗体。这种测试手段将有助于HIV感染的早期诊断,对于HIV早期干预及控制其传播具有重大意义。
自身免疫性疾病是指机体对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态,一般由自身免疫性T或B淋巴细胞及自身抗体对自身细胞或组织进行免疫攻击所导致。免疫调控机制与自身免疫性疾病发生发展之间的关系近年来得到了广泛关注。许多免疫细胞参与Ⅰ型糖尿病的发生,包括单核细胞、T细胞等。NKp46缺陷小鼠表现出低剂量 streptozotocin诱导的Ⅰ型糖尿病发病减弱。NK细胞表面活化性受体NKp46识别小鼠及人类胰岛β细胞表面相应配体,引起NK细胞脱颗粒。这项研究证明NKp46对Ⅰ型糖尿病发展发挥关键作用,可能成为潜在的治疗靶点[414]。对Th17分化的调控机制的研究也可为自身免疫性疾病的治疗带来可能的靶点。一种RORα和RORγt的高亲和力配体,SR1001能有效抑制Th17的分化和功能,以及自身免疫性疾病的进展,在临床治疗中具有潜在价值[415,416]。
高通量GWAS分析发现了众多免疫相关分子的基因变异与多种人类疾病如哮喘、类风湿性关节炎以及肠道疾病等的密切关联。特别是,IBD病人中发现了数个TLR成员基因存在多态性,而NOD2基因多态性与克罗恩氏病易感性密切相关[417,418]。事实上,肠道的免疫稳态的维持依赖于肠道上皮、机体免疫系统及肠道微生物三者之间精细而严密的相互作用,任何一个环节的紊乱都可能引起肠道稳态破坏甚至疾病发生[419]。体内研究表明,MDP介导的NOD2活化能够抑制TLR信号而减轻实验性肠炎的发生,而NOD2基因变异的克罗恩氏病患者中发现NOD2信号与TLR信号相互作用的缺失[420]。这表明不同受体介导的免疫信号之间的相互调控对于调节肠道免疫微环境稳态非常重要。靶向性干预TLR信号也能够对IBD发生发展起一定的治疗作用。TLR2信号配体PCSK可通过抑制肠道通透性而抑制DSS诱导的急性肠炎,这为肠道损伤和炎症的临床治疗提供了新的思路[421]。此外,新一代测序技术和生物信息学的发展极大地促进了我们对肠道微生物组学的认识。人类肠道元基因组计划(MetaHIT)针对人类肠道的所有微生物群落进行研究,为肠道微生物与肠道炎症、代谢性疾病和肿瘤等疾病的关联提供理论依据,为疾病诊断与治疗提供可靠线索[422]。
此外,越来越多的研究显示了干细胞用于治疗免疫相关疾病的可观前景。已报道,如Erg基因可以保持造血干细胞的适当数量,而此基因部分变异与人类白血病密切相关[423]。E4bp4基因则被发现是促使造血干细胞转变为自然杀伤细胞的关键基因,提示可以通过药物诱导E4bp4基因表达,增加患者血液干细胞分化成NK的数量,抑制癌症的发生发展[424]。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是骨髓中除造血干细胞以外的另一种成体干细胞,在炎性细胞因子刺激后呈现出免疫抑制作用,在减少免疫排斥,延长移植物存活和自身免疫疾病治疗等方面具有一定的临床应用前景。MSC具有强大的自我更新和多向分化潜能,有研究报道kartogenin小分子可以使MSC呈现成软骨细胞的特征,使用其对类风湿软骨损伤的小鼠进行治疗可改善小鼠关节活动能力[425]。MSC作为移植领域应用前景广阔的再生来源细胞,将为众多疾病,如心脏病、成骨不全症和脊髓损伤等的治疗带来曙光[426,427]。
(十一)系统生物学与免疫学研究的拓展和深入
近代生物学研究主要是以分子生物学和细胞生物学研究为主,其研究方法采用典型的还原论方法。虽然在细胞甚至在分子层次对生物体有了很具体的认识,但对生物体整体的行为却很难给出系统、圆满的解释。1990年启动的人类基因组计划是生命科学史上第一个大科学工程,开始了对生物全面、系统地研究与探索。人类基因组计划的基本完成,标志着生命科学研究进入了“后基因组”时代;以基因组学为代表的各种组学研究的开展,生命科学新的大科学运作方式的出现以及工程学科的渗透、交叉,把生物学(包括免疫学)带入了系统科学的时代。系统生物学(systems biology)是在细胞、组织、器官和生物体整体水平研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用,并通过计算生物学来定量描述和预测生物功能、表型和行为。系统生物学不同于以往的实验生物学——仅关心个别的基因和蛋白质,它研究所有的基因、所有的蛋白质及其组分间所有的相互关系。显然,系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学,其最大的特点就是整合,系统生物学主要研究实体系统(如生物个体、器官、组织和细胞)的建模与仿真、其生化代谢途径的动态分析、各种信号转导途径的相互作用、基因调控网络以及疾病机制等。系统生物学的技术平台主要为各种组学研究,包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学、表型组学和计算生物学等。这些高通量的组学技术构成了系统生物学的技术平台,提供建立模型所需的数据,并辨识出系统的结构,通过建模和理论探索,可以为生物系统的阐明和定量预测提供强有力的支持。
系统生物学使生命科学由描述式的科学转变为定量描述和预测的科学,已在基础医学、预防医学和临床医学中得到应用。在免疫学研究方面,系统生物学技术的应用已受到了越来越多的重视,目前主要集中于如下几方面:免疫细胞活化和功能发挥的信号网络[428]、病原体感染时免疫系统的变化[429]、自身免疫性疾病中免疫相关基因的变化网络[430]等。同时,系统生物学也为新型药物、疫苗的开发提供了更为广阔的空间且缩短了研究周期,如对特定免疫相关疾病的病理组织转录组和蛋白质组的研究在展示疾病发生过程的同时,发现疾病相关生物标记物分子,在此基础上应用实验生物学的手段加以验证,最终明确可用于疾病不同阶段诊断、判断预后、指导药物开发和疗效分析的生物标记物。利用转录组学、蛋白组学等通量技术,结合系统生物学的计算模型,近来科学家分析了一种经典且非常有效的病毒疫苗——黄热病毒疫苗YF-17D免疫机体后的先天免疫、CD8+T细胞、B细胞反应等的特征性基因变化谱,为其他病毒疫苗的免疫效力的预测、评价及开发提供了新的有效的方法和思路[431]。可以预见,系统生物学的研究理念和方法将加速和拓展免疫学的研究,使我们更深入认清复杂的免疫学结构与功能的本质。
(十二)单细胞水平技术在免疫学研究中的应用
近年来免疫学飞速发展,在基础理论和临床应用方面均取得了突破性的进展,而随着新型技术的不断涌现以及与其他学科的交叉融合,免疫学的研究触角更为广泛而深入,涉及的前沿热点也更加丰富,免疫学家不断研究探讨关于免疫系统乃至生命意义上的关键问题,并力图攻克自身免疫病等重大疾病。目前,一个新兴的研究热点是单细胞水平技术在免疫学研究中的应用。
与系统生物学相比较,单细胞水平的研究可以更精确的解析单个细胞间细微的差异,加深对细胞之间异质性的认识。在免疫学研究中,单细胞分离、单细胞测序等相关技术开始被涉及应用,其跨越了普通流式、定量PCR等技术对于体内比例少却极其重要细胞,如抗原特异性的抗体分泌细胞(antigen-specific antibody-secreting cell,ASs),其特殊表型和基因检测的局限性[432]。如利用以单一细胞为基础的微孔微阵列芯片可以检测人外周血淋巴细胞中对于乙型肝炎病毒和流感病毒特异性的ASC,并可于一周内生成人抗病毒抗体,为合成抗体进行个体化治疗开辟了新的视角[433]。单细胞测序技术在2012年被Science预测将成为来年首位的生物类科研热点[434],如利用此技术对机体应对微生物感染时单一CD8+T淋巴细胞进行转录水平的示踪,为免疫应答中细胞命运的分水岭研究提供了极好的启示[435]。近期Nature Immunology的两篇文章利用单细胞技术揭示了mTEC细胞中TRA表达调控机制。单细胞水平RNA测序技术证实TRA编码基因呈现数种共表达形式,每种形式仅存在于一种mTEC细胞亚群,而这些共表达的TRA基因在基因组上成簇且染色质可接近性明显增强[436]。在Aire高表达与Aire不表达的mTEC中进行单细胞RNA测序和DNA甲基化分析也为解释Aire在mTEC细胞中对靶基因的有序随机调控提供了线索[437]。单细胞研究相关技术的成熟将完善单一免疫细胞的解析,而足够多的不同单一免疫细胞基因、转录和表型等水平的研究可以重建出整个免疫系统,并在重建的过程中为免疫细胞分化、免疫应答调控和相关免疫疾病预防治疗等带来更多的信息。
(十三)免疫系统与免疫应答过程的可视化研究
近年来实时动态成像技术(MRI、PET、激光共聚焦显微镜技术、活细胞动态观察工作站等)在免疫学研究中应用越来越广泛,也为免疫学家进一步深入认识免疫系统和免疫应答过程中参与的细胞与分子提供了新的手段。一方面由于多种可控性高亮度新型荧光分子的问世,另一方面是双光子成像技术的应用,可以在体实时动态地观察免疫器官内(如200~300μm厚度淋巴结)的免疫细胞或者免疫分子的四维信息,也可以将免疫器官或者组织游离体外进行活体动态成像,该技术大大促进了人们确切地认识免疫细胞在淋巴器官中的迁移与不同细胞间的相互作用和定位,可以利用基因缺失小鼠进一步分析某些免疫分子在免疫细胞迁移与相互接触、结合中的作用[438],从而使免疫学家更贴切地了解免疫微环境中免疫应答的细胞与分子机制。结合共聚焦显微镜及活体双光子显微镜技术,研究者得以深入研究抗病毒免疫中DC与CD4+T细胞及CD8+T细胞之间复杂的相互作用模式与机制[439]。此外,以黑色素瘤为研究模型,结合活体成像技术,研究者发现黑色素瘤相关的成纤维细胞能触发对BRAF抑制剂PLX4720的耐药性[440]。