核酸扩增技术具有广阔的应用前景，分子技术能准确地诊断疾病，有助于结核病得到及时控制和准确诊断。对结核分枝杆菌特异性DNA片段的核酸扩增为基础的技术临床应用进一步扩大。最常见的是针对结核分枝杆菌复合群特异性DNA区域，如IS 6110和16S rDNA为目标区域的扩增和检测，其他还有针对 rpoB基因的192bp片段（如Xpert MTB/RIF试验）、 recA基因、 hsp65基因等，详细如下：

Xpert MTB/RIF技术是由美国Cepheid公司研发的一项基于结核分枝杆菌核酸扩增为基础的全自动分子诊断方法。Xpert MTB/RIF技术是集痰标本处理、DNA提取、核酸扩增、结核分枝杆菌特异核酸检测、利福平耐药基因 rpoB突变检测于一体的结核病和耐药结核病快速诊断方法，全过程只需90分钟，即可同时实现结核分枝杆菌和利福平耐药的检测。由于整个过程在封闭的腔室内自动化完成，无须生物安全需求。2010年12月，WHO批准了Xpert MTB/RIF的应用。该技术也被WHO誉为结核病诊断中的革命性突破，是WHO在2011年重点推荐的技术。国内也有一些单位在开展应用。

Xpert MTB/RIF在前期研究中显示可检测到痰标本中131CFU（菌落形成单位）/ml的结核分枝杆菌（95%CI 106～176），灵敏度大幅高于涂片镜检的10 000CFU/ml，类似固体培养基，而低于液体培养基（10～50CFU/ml）。与传统方法相比其最大的优势在于极大地缩短了结核病及耐药结核病的诊断时间，并由此可能挽救了很多生命。诊断结核病的中位数为0天，对比涂片镜检的1天和液体培养的16天以及固体培养的20天；诊断利福平耐药的中位数为1天，对比线性探针的20天和药敏检测的106天。15份使用Xpert MTB/RIF检测诊断肺结核报道荟萃分析示总敏感度为90.4%（95%CI 89.2%～91.4%），总特异度为98.4%（95% CI 98.0%～98.7%）。涂片阴性和涂片阳性患者敏感度分别为75.0%和98.7% ^［1］。Xpert MTB/RIF可在2小时内得到检测结果，灵敏性高，潜力巨大，目前已在结核病患病率较高的67个国家推广实施 ^［2］。Antonenka等 ^［3］将Xpert MTB/RIF与广泛应用的另外两种分子检测方法ProbeTec ET DTB（DTB）（Becton-Dickinso公司）和COBAS TaqMan MTB（CTM-MTB）（罗氏）进行了比较，CTM-MTB方法与Xpert MTB/RIF类似，只是靶标为16S rDNA区，DTB是基于链置换扩增（SDA）技术检测IS6110的靶序列。结果显示，培养阳性的标本Xpert MTB/RIF、CTM-MTB 和 DTB检测的敏感性分别为74.6%、73.8%和79.1%；涂片阴性的标本检测分别为68%、68%和72%；涂片阳性的标本DTB 为100%，Xpert MTB/RIF和CTM-MTB分别为94.1%和93.3%。特异性最好的是CTM-MTB（100%），最低的是Xpert MTB/RIF （96.2%），因2株NTM检测错误。CTM-MTB无效结果最多（4.1%），而Xpert MTB/RIF和DTB为0.8%。作者认为，三种方法整体类似，DTB的灵敏性略好，而CTM-MTB的特异性最佳。也有作者对几种分子检测方法的费用进行了比较：Xpert MTB/RIF的费用为14.93美元/例，MTBDRplus线性探针为23.46美元/例，而传统的自动化液体培养费用为16.88美元/例，认为两种分子生物的方法与传统液体培养检测费用相当，具有可比性 ^［4］。

Xpert MTB/RIF方法检测结核病已在很多国家推出，但是仍不适合在实验室以外环境中开展。非洲的一项多中心随机对照试验结果显示，758例涂片镜检（182例培养阳性）与744 例Xpert MTB/RIF（185例培养阳性）比较，结果显示与涂片镜检法相比，更多MTB/RIF法患者可以当日诊断［178（24%）vs 744，99（13%）vs 758， P＜0.0001］及可以当日开始治疗［168（23%）vs 744，115（15%）vs 758， P=0.0002］。作者认为，Xpert MTB/RIF可在初级诊所由护士操作，可使更多的结核病患者在当天即开始治疗，提前培养阳性患者的治疗时间。但是由此获益并没有引起结核病发病率降低，部分原因是因为大量的涂阴患者的经验性治疗 ^［5］。

Xpert MTB/RIF方法在儿童结核病的诊断也显示了优越性。Nhu等 ^［6］对73例可疑结核病儿童的标本同时进行涂片、显微镜直视下直接观察（MODS）及Xpert MTB/RIF方法比较，其敏感性分别为37.9%、51.7%及50.0%；Xpert MTB/RIF方法的敏感性明显高于涂片（ P=0.046）；Xpert MTB/RIF方法的阳性预计值为100%、阴性预计值为34.1%，而MODS分别为96.8%和33.3%。提示MODS培养和Xpert MTB/RIF方法对发现儿童结核病有类似的敏感性，MODS培养可以进行耐药检测，需要标本处理，结果需要1周多的时间；而Xpert仅需2小时，但是后者所需费用问题也应考虑。Sekadde等 ^［7］采用Xpert MTB/RIF检测了250例年龄在2个月至12岁的儿童肺结核患者；15例排除结核（13例培养污染、2例Xpert不确定），235例Xpert MTB/RIF敏感性为79.4%、特异性为96.5%；14 例为涂片及培养均（+）者中13例Xpert MTB/RIF（+），其阳性率为92.9%；14/20涂阴培阳者Xpert MTB/RIF（+），其阳性率为70%；Xpert MTB/RIF阳性率是常规镜检的2倍（79.4% vs 41.2%）。XpertMTB/RIF阳性率与年龄5岁以上、有结核接触史、TST（+）有相关性。Bates等 ^［8］采用Xpert MTB/RIF方法检测儿童结核病患者的胃液。结果显示，930例儿童，788例无痰者中142例获取痰液和胃液，930例中58例（6.2%）培养（+）（10例有痰和48例无痰的胃液）。Xpert MTB/RIF敏感性为胃液68.8%（95%CI 53.6%～80.9%）、痰90.0%（95%CI 54.1%～99.5%； P=0.1649），特异性为胃液99.3%（95%CI 98.3%～99.8%）、痰98.5%（95%CI 94.1%～99.7%； P=0.2871）。与痰涂片比较，Xpert MTB/RIF方法额外发现28例结核病患者，敏感性更高。

环介导等温扩增法（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是WHO在2013年重点推荐的一种商业化的用于扩增结核分枝杆菌DNA的结核病诊断新方法 ^［9］。TB-LAMP是由日本开发的基于新的环介导等温扩增（LAMP）平台的检测方法，具有快速（40分钟内）、等温检测、对反应条件要求不高、可用肉眼检测结果等优点。敏感性在菌阳标本为97%～98.2%，涂阴培养阳性标本为53%～62%，特异性为93.9%～96.3%。WHO专家组认为，LAMP技术有潜力成为结核病快速诊断工具，但目前还不能取代痰涂片镜检，还需在不同地区结合HIV状态等对比，还需要更多的评估 ^［9］。

LAMP的方法操作简单、快速、低成本而且结果易读，无须昂贵或复杂的仪器，仅需一块铝块散热，并可通过电池供电，是很有前途的用于结核分枝杆菌快速检测和菌型鉴定的方法，值得在资源有限的环境中推广。日本的Phetsuksiri等 ^［10］检测了针对16S核糖体RNA的TB-LAMP（in-house LAMP）方法，通过检测80份培养阳性的临床标本，准确检测出了其中的60份结核分枝杆菌。Aryan等 ^［11］将IS6110-LAMP与Amplicor MTB测试、in-house IS6110-PCR和巢式PCR检测进行了对比，其敏感性分别为 89.6%、76.6%、79.2%和59.7%；特异性和阳性预测值均为100%。阴性预测值分别为75%、57.1%、60%和43.6%。作者认为IS6110-LAMP诊断性能较其余3种方法更好，而且快速、简单、成本效益好，特别是在资源有限的环境下。

COBAS TaqMan MTB探针是一种临床标本快速检测结核分枝杆菌的实时聚合酶链反应（qPCR）试剂盒。Lee等 ^［12］对586例临床呼吸道标本的检测敏感性和特异性为82.7%和96.5%。涂片阴性但检测阳性的5例后经临床证实为肺结核，涂片阴性的敏感性由此提升至83.1%。近来TaqMan MTB探针实时PCR取代了 Amplicor MTB检测，是最先商用的基于核酸扩增检测结核分枝杆菌复合体的方法之一。133例临床标本的检测，TaqMan MTB显示了较Amplicor MTB显著减少的PCR抑制。在对1143例临床标本检测的前瞻性研究中，与培养作为金标准相比，TaqMan MTB检测呼吸道标本的敏感性为88.4%，特异性为98.8%，非呼吸道标本的检测敏感性为63.6%，特异性为94.6%。显示COBAS TaqMan探针是一种可直接检测临床标本结核分枝杆菌的好工具 ^［13］。Yoshida等 ^［14］对LAMP方法（loopamp MTBC检测试剂盒）与TaqMan方法进行了比较：TaqMan方法使用离心后100μl上清液，而LAMP方法使用60μl同样样品离心后的沉淀物。对于涂片阳性的样本，TaqMan探针和TB-LAMP检测同时100%呈阳性反应；25例涂片阴性样本中，TaqMan方法检测阳性为16例（64%），而LAMP方法检测阳性为20例（80%），说明LAMP检测在涂片阴性的标本中阳性率较TaqMan检测高，灵敏度与培养相似。

超支化滚环扩增方法（HRCA）能很好地检测出临床痰标本中的结核分枝杆菌。Liu等 ^［15］研究发现，HRCA检测纯化H37Rv菌株DNA以及结核分枝杆菌培养液的最低浓度值分别为740mmol/L和200CFU/ml。其对3株结核分枝杆菌复合群的检测均为阳性，对NTM的检测结果为阴性。其在检测136例肺结核患者痰标本的敏感性为77.2%（105/136），略低于实时定量PCR（79.4%，108/136）和痰培养（80.9%，110/136）。上述3种检测方法的敏感度均优于痰涂片检测法（44.9%，61/136）。HRCA的特异度为98.6%（71/72），与PCR方法和痰培养方法（100%，72/72）相近。作者认为，HRCA方法对临床痰标本中结核分枝杆菌的检测有较高的灵敏度和特异度。HRCA较PCR方法简易、经济，较痰培养方法省时。HRCA方法在医疗资源贫乏的国家有着广阔的应用前景。

分子信标技术属于最近发展起来的新基因探针技术，特点是背景信号低、灵敏度高、特异性强、操作简单、无须检测无反应的部分。Yu等 ^［16］设计了靶标为 IS 6110基因（114bp）和 rpoB基因片段（215bp）的双分子信标对临床标本进行结核分枝杆菌快速检测。方法为将两个片段插入到PMD-19T载体纯化后，通过PCR和测序构建质粒。结果显示双分子信标稳定性好（变异系数为1.91%～2.68%），扩增效率高（95.6%）。并对结核分枝杆菌特异性高，非结核分枝杆菌不产生荧光信号，可在10 ³～10 ¹¹拷贝/ml的范围内检测并可检测细菌数。双分子信标可减少假阴性，提高敏感性，并减少了反应时间和成本。