以传统表型的方法来检测耐药费时太久，分子生物学方法检测结核分枝杆菌耐药相关基因实现了对耐药结核病的快速诊断，常见有基于线性探针测定、DNA序列或实时PCR等，目前均取得了较好的发展，并已有多个检测方法上市。

Xpert MTB/RIF技术以半巢式实时定量PCR技术为基础，使用5个相互重叠的分子探针扩增 rpoB基因81bp核心区，利福平耐药菌株95%有 rpoB基因变异，所以Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药已有较多报道。Bunsow等 ^［17］对呼吸道标本以及非呼吸道标本中结核分枝杆菌的直接检测能力进行评价，并评价其在非结核病高负担国家中对单耐利福平菌株的检测能力。595例临床标本同时对相关样本进行涂片、培养以及药敏方面的检测，305例（51.3%）为非呼吸道标本，290例（48.7%）为呼吸道取材标本。共检测出81例结核标本，Xpert MTB/RIF技术检测出71例结核标本。Xpert MTB/RIF技术检测呼吸道标本的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为97.1%、98.6%、95.7%和99.1%，非呼吸道标本的相关值分别为33.3%、99.7%、80.0%和97.3%。作者认为，Xpert MTB/RIF技术是一种快速、简易、准确的检测利福平耐药结核分枝杆菌菌株的方法，在痰涂片阳性的标本中尤为突出。

线性探针测定法（molecular line probe assays）诊断MDR-TB已得到了WHO的认可与推荐。

耐药结核分枝杆菌基因分型技术即分子线性探针测定法，包括GenoType ^®MTBDRplus 和GenoType ^®MTBDRsl。GenoType ^®MTBDRplus为检测异烟肼和利福平耐药，而GenoType ^®MTBDRsl快速检测EMB、氟喹诺酮类药物和二线注射类药物耐药性。Maurya等 ^［18］采用GenoType ^® MTBDRplus法对临床标本的检测显示，125株可检测到120株（96%）结核分枝杆菌结果，45株的耐药基因检测结果可读，检测利福平耐药、异烟肼耐药和耐多药的敏感性是95.8%、96.3% 和97.7%。耐多药菌株的 rpoB基因S531L密码子和 katG基因S315T1密码子出现突变。作者认为，GenoType ^® MTBDRplus法具有敏感性高、时间短等优点。

REBA MTB-Rifa ^®线性探针测定法已上市，用于检测利福平耐药的 rpoB基因决定区（RRDR）。Cho等 ^［19］对收集的492株结核分枝杆菌临床分离株以及228份涂片和培养阳性的痰标本采用REBA MTB-Rifa ^®线性探针测定法进行检测，并与传统的表型DST结果进行了比较。表型DST检测显示，492株中215株对利福平耐药，其中92.1% （198/215）为耐多药菌株。REBA MTB-Rifa ^®线性探针测定法检测到 98.1%（211/215）利福平耐药。4株表型利福平耐药株检测为阴性，通过测序显示3株为MDR，且RRDR区域缺少突变。REBA MTB-Rifa ^®线性探针测定法的敏感性和特异性分别为98.1%（211/215）和100%（277/277）。检测涂片阳性痰标本228份，REBA MTB-Rifa ^®探针的敏感性和特异性均为100%（96/96，132/132）。研究结果支持使用该方法检测临床分离株和涂片阳性痰标本对利福平的耐药性。

细菌等病原微生物的耐药性问题已日益严重，受到广泛关注。检测细菌的耐药基因可有助于临床医师有针对性地选择和使用抗菌药物，设计新型抗生素对临床正确用药和新药开发具有指导意义。高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting curve analysis，HRM）广泛应用于基因分型、突变扫描和序列比较，其原理是利用荧光染料可以插入DNA双链的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况区分野生型和突变型，是目前突变检测的有力工具，已用于抗结核药物的耐药检测 ^{［20，21］}。洪创跃等 ^［22］选取49株突变型菌株和78株野生型菌株作为研究对象，应用HRM技术检测 pncA基因突变并对吡嗪酰胺的耐药性进行评估。检测结果显示49株突变型菌株中HRM检测出48株突变，1株双突变位点误判为野生型；78株野生型菌株中HRM检测出6株突变型。MGIT 960药敏方法检测127株临床分离株中吡嗪酰胺耐药62株，敏感65株；HRM检测62株耐药株中有53株耐药，65株敏感株中有64株敏感。以MGIT 960为药物敏感性的金标准，其敏感度为85.5%（53/62），特异度为98.5%（64/65）。柳清云等 ^［23］根据结核分枝杆菌一线药物常见耐药突变位点（包括rpoB81bp耐药决定区、inhA启动子、katG315、ahpC启动子以及embB306）设计6条荧光双标记探针和对应引物，通过PCR扩增耐药突变位点所在基因片段，在扩增完成后通过熔解曲线检测分析实现对耐药突变的快速检测。对76株临床耐多药菌株进行检测，各种突变对应ΔTm值范围为1.8～14.4℃。将检测结果和测序结果对比表明该方法检测的敏感度和特异度均为100% （rpoB 80/80；inhA 7/7；katG315 59/59；ahpC 8/8；embB306 27/27）。

Lee等 ^［24］采用HRM技术对92例结核分枝杆菌临床分离株进行 gyrA、 rpsL和 rrs基因突变进行检测，结果以DNA测序作为金标准。同药敏试验相比，HRM的敏感性和特异性分别为74.1%和100%（氟喹诺酮类），87.5%和100%（链霉素）。有5株菌株对氧氟沙星是低浓度耐药，结果未发现 gyrA突变，推测可能是由于外排泵的作用或混合其他感染导致假阴性。6株链霉素耐药菌株用HRM和DNA测序均未发现突变，这可能是由于耐药基因的突变位点不在 rpsL和 rrs基因内，同时也说明还有基因突变参与了链霉素耐药性的形成。Silva等 ^［25］利用定量PCR-HRM分析技术对 rpoB基因的利福平耐药决定区C526T 和C531T突变进行检测。研究者将H37RV标准菌株和携带C526T和C531T突变的 rpoB基因克隆入pGEM-T载体，并将此载体作为54个结核分枝杆菌菌株进行定量PCR-HRM分析时的对照组。实验结果表明直接用H37RV结核分枝杆菌扩增的PCR产物与pGEM野生型得到的熔解曲线是相同的。另外，也很容易将野生型质粒与pGEM-C531T和C526T以及其他突变区分开。质粒pGEM-C531T和C526T与携带C531T和C526T突变的基因组DNA具有相同的熔解曲线。由于DNA双链突变的相似性，导致肉眼很难从熔解曲线中区分C531T和C526T突变，但是如果使用软件就可以精确地区分这些突变。由于特异的突变与表型耐药是相关的，因此检测两个不同突变的熔解曲线间微小差异是十分必要的。

总之，应用HRM技术对临床样品进行基因突变检测，可以节省检测时间，并减少操作过程中给实验人员带来的病原体感染风险。可以在2～3小时完成检测，结果易于判断，且实现闭管操作，避免交叉污染的风险，敏感度高，特异度强，在结核分枝杆菌快速耐药检测方面具有较好的应用价值。虽然分子生物学方法在技术上要求较高，但是由于其检测的快速性，导致其在结核分枝杆菌耐药性检测及结核病防控方面扮演越来越重要的角色。然而，技术上的限制不应该制约其应用，相反应该成为一种持续发展和优化分子生物学技术的动力。

焦磷酸测序技术是一项全新的短片段DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的DNA片段，其检测精确性可以与传统的Sanger双脱氧链终止法相媲美，且操作极为简单，目前已被广泛应用于单核苷酸多态性分析、病原微生物快速鉴定、突变检测、甲基化分析及药物基因组学等 ^［26］。由于结核分枝杆菌各耐药基因具有突变位点集中、形式多样的特点，仅需对突变热点的特定短片段进行测序，即可获得结核分枝杆菌药敏试验结果。与其他分子药敏试验方法比较，焦磷酸测序技术对短片段突变分析具有独特优势，是一种快速、准确和高通量的分子药敏方法，可用于检测多种抗结核药物的耐药性 ^［27］。

朱长太等 ^［28］应用焦磷酸测序技术对202株被MGIT 960药敏证实为耐多药结核分枝杆菌临床分离株进行鉴定。以焦磷酸测序同时检测到 rpoB基因及 katG基因突变判读为耐多药结核分枝杆菌，结果显示202株结核分枝杆菌临床分离株中，焦磷酸测序检测到耐多药结核分枝杆菌共计154株；以MGIT 960检测结果为判读标准，则焦磷酸测序法检测耐多药结核分枝杆菌灵敏度为72.8%（95%CI 66.3%～78.4%），特异度为90.0%（95%CI 80.1%～95.1%）。郭琪等 ^［29］采用Meta分析方法综合评价国内外焦磷酸测序技术快速诊断异烟肼耐药的诊断价值，分析检索相关文献114篇，最后纳入9篇。将焦磷酸测序与常规测序相比，其结果一致率为100%。以细菌学药敏为金标准，焦磷酸测序检测 katG基因时标本总数为945份，加权敏感度、特异度及95%可信区间分别是0.77（95%CI 0.73～0.80）、1.00（95%CI 0.99～1.00）；SROC曲线下面积为98.82%。只检测 inhA基因时的加权敏感度为0.19（95%CI 0.15～0.24），特异度为1.00（95%CI 0.98～1.00）。Engstrom等 ^［30］应用焦磷酸测序法对不均一耐药结核分枝杆菌菌群的野生型和突变型混合DNA样本进行检测，如果用肉眼分析热解色谱图，当突变型DNA达到35%时突变信号出现肉眼可见的改变；当突变型DNA含量达到40%时，突变信号的形态变得十分明显。如果应用软件进行分析的话，突变型DNA的含量需要达到70%。这主要是因为50%～60%突变型DNA引起的峰值水平不够，导致突变位点识别困难。有研究报道，应用sanger测序法对 ropB基因突变进行检测，要求野生型DNA背景下的突变型DNA至少要达到50%，而表型耐药检测通常将耐药定义为＞1%的菌株具有耐药性。因此，表型耐药检测和基因检测敏感度的差异可能造成对同一标本药敏结果的不同认定。除了检测已知的耐药基因突变外，焦磷酸测序技术也可以用来检测未知的突变。Rahmo等 ^［31］应用焦磷酸测序技术对56株结核分枝杆菌的DNA的利福平耐药决定区进行测序检测，发现97个修饰后的密码子呈现出35种不同变异；其中31个（31/37：34%）是之前未被报道过的。突变绝大多数发生在531位密码子（37/97：38%）、533位密码子（28/97：29%）和526位密码子（9/97：9%）。另外，有30株（30/97：45%）分离株具有多个密码子改变。

各国学者已尝试利用焦磷酸测序技术选取不同的靶标序列开展分枝杆菌菌种鉴定。通过选取不同的分子靶标，焦磷酸测序技术可以鉴定多种非结核分枝杆菌及结核分枝杆菌复合群的亚群。也有学者尝试利用焦磷酸测序技术进行结核分枝杆菌及结核病患者的基因分型，通过测定不同结核分枝杆菌菌株的特定SNP位点，可以鉴定菌株间的区别，追踪传染源，查证传播途径，检测实验室交叉污染等。目前该技术尚不能进行长序列测定，随着技术水平的进一步提高，焦磷酸测序技术在结核病等疾病诊疗领域的应用将会更加广泛。

随着分子生物学技术和计算机技术的不断发展，病原微生物检测将向着快速、简便和高度自动化的方向发展。近年来飞行时间质谱技术在细菌和真菌等微生物鉴定中的应用受到广泛关注 ^［32-25］。质谱技术主要是利用特定离子源将待测样品转变为运动的离子，这些离子根据质量/电荷比的不同，在电场或磁场作用下得到分离，并用检测器记录各种离子的相对强度，形成质谱图，通过与已知数据库进行匹配，匹配率最高的为未知微生物的鉴定结果。

质谱技术具有高灵敏度、高通量和快速的特点，但这种技术早期研究使用细胞壁表面蛋白进行细菌鉴定，其对培养基、培养条件等环境因素要求高，不适于临床微生物实验室使用。直到2004年质谱技术所用基质液的改进使测试菌的核糖体蛋白解离出来，从而使质谱技术真正投入临床应用。Panda等 ^［36］采用MALDI-TOF质谱对42株临床结核分枝杆菌分离株进行检测，有97.61%同金标准在属的水平上是一致的，有85.36%在种的水平上是一致的。有1株检测结果同传统的金标准不一致，结果是质谱分析认定为结核分枝杆菌（log＞2.0），而传统方法认定为非结核分枝杆菌。周昭彦等 ^［37］采用MALDI-TOF质谱技术鉴定非结核分枝杆菌，评估其快速鉴定临床和环境分离非结核分枝杆菌的可行性、准确性和重复性。对生长于米氏7H10琼脂平板的83株10个种的非结核分枝杆菌进行MALDI-TOF质谱鉴定。同16S rRNA测序结果比较，所有菌株均能鉴定到属，67株鉴定到种，6株鉴定到复合群水平，即88.0%测试菌株可准确鉴定至菌种或复合群水平。81.9%非结核分枝杆菌的MALDI-TOF 质谱鉴定值＞1.700，如仅统计鉴定值＞1.700的非结核分枝杆菌，MALDI-TOF 质谱方法鉴定非结核分枝杆菌至复合群水平的准确率可达97.1%；鉴定到种的准确率达92.8%。

目前质谱技术的另一个应用领域是疾病相关易感基因的筛查。张俊仙等 ^［38］应用MALDI-TOF质谱技术分析1032例结核病患者和1008例非结核病患者的IL-1A和IL-1B基因多态性，并分析其与活动性结核病之间的关系。在筛选出的5个IL-1A 和IL-1B标签SNP位点中，rs2853550和rs3783526的等位基因频率在结核组和对照组间存在分布差异（ P＜0.05）。IL-1B的rs2853550也具有显著的结核风险，而其他两个IL-1B位点及IL-1A的2个SNP位点则与结核发病无显著关联。张国良等 ^［39］应用MassARRAY飞行质谱技术检测495例结核患者和358例健康志愿者的IL-6基因6个SNP位点（rs13306436、rs2069824、rs1800795、rs36215814、rs1800797、rs1800796）基因型，用X ²检验比较两组人群SNP位点等位基因频率差异，并计算其发生结核的风险性。rs1800796位点3种基因型CC、CG和GG在结核组和对照组的频率分别为64.5%、30.7%、4.8%和56.4%、34.9%、8.7%，结核组G等位基因频率（21.3%）显著低于对照组（26.1%），差异有统计学意义（ P＜0.05），携带C等位基因的人群患结核风险明显升高。文玉欣等 ^［40］采用MassARRAY飞行质谱技术检测479例肺结核患者和358名体检患者白细胞介素-22基因启动子区单倍体型与肺结核易感性的关系。结果显示rs2227472、rs2227473、rs2227478、rs2227483、rs2227485与结核易感性相关（OR值分别为0.796、0.653、0.769、0.762、0.816，X ²值分别为4.594、6.921、5.256、5.089、3.827， P＜0.05）。IL-22基因单倍体型CTTAA（病例组频率0.004，健康对照组0.032）、TATGG（病例组频率0.522，对照组0.460）在两组人群中的频率差异有统计学意义。

另外可以运用该技术对正常与病理情况下蛋白质的差异表达进行检测，获得相应的疾病标志物。黄业伦等 ^［41］应用SELDI-TOF质谱技术比较分析菌阳肺结核与菌阴肺结核、肺结核与肺外结核患者的血清蛋白质谱，其结果显示在3类结核病患者群血清中均捕获到102种血清蛋白质，其相对分子质量在1011.41～9435.07之间。菌阳肺结核、菌阴肺结核和肺外结核患者群中各血清蛋白质的平均丰度分别在1.62～1632.56、3.15～1583.08和1.95～1568.02之间。经AnderSon-darling检验，在菌阳肺结核、菌阴肺结核、肺外结核患者群中分别有 31种、23种和29种血清蛋白质呈正态分布，其中119种血清蛋白质在菌阳肺结核与菌阴肺结核患者群中均呈正态分布，14种血清蛋白质在肺结核与肺外结核患者群中均呈正态分布。所有捕获到的血清蛋白质的平均丰度在两组患者群间其水平未见显著差异。肺结核与肺外结核患者群各血清蛋白质的平均丰度比较，对捕获到的正态分布血清蛋白质，其平均丰度在两组患者群间未见显著差异；对捕获到的非正态分布血清蛋白质中发现1个差异血清蛋白质（ P=0.025），其相对分子质量为5753.76，在肺结核与肺外结核患者群血清中的平均丰度分别为15.42±4.86 和28.29±14.08。Liu等 ^［42］应用SELDI-TOF质谱技术对391份血清样本（180份来自活动性肺结核；211份来自对照组患者，其中91份来自健康志愿者，40份来自肺癌患者，40份来自肺炎患者，40份来自慢性阻塞性肺疾病患者）进行检测，发现有35个与结核病相关的差异表达蛋白质。有4种生物标志物（2554.6Da、4824.4Da、5325.7Da和8606.8Da）可以将结核病与对照组区分开，其敏感性为83.8%，特异性为84.2%。2554.6Da的生物标志物在肺结核患者中表达上调，经鉴定为纤维蛋白原的一个片段。对22名结核病患者进行分析，发现纤维蛋白原降解产物增加，在142名患者中血浆纤维蛋白原水平增高。

Varma-Basil等 ^［43］介绍了一种新型的 hsp65基因的PCR扩增限制性酶切分析（PRA），并开发用于临床分离株鉴别结核分枝杆菌的快速筛查。使用限制性酶NruI和BamHI来获得一定数量的限制性带型，从而区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。经对310份临床标本和24株参考株进行测试，结果显示295株为结核分枝杆菌而15株为非结核分枝杆菌，并经过随机选择结核分枝杆菌38株和所有15NTM通过测序进一步证实。说明该方法简单，不需要复杂的分析，符合成本效益、快速、灵敏度高，甚至不需要专业技术人员。可在最小投入下检测区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

寡核苷酸微矩阵法是能快速检测对二线抗结核治疗药物耐药的分子学方法。可检测出氟喹诺酮的耐药突变基因 gyrA 和 gyrB，以及与阿米卡星和卷曲霉素耐药相关的 rrs基因和启动子的 eis基因。Zimenkov等 ^［44］对来源于痰或者支气管灌洗液临床标本的65株菌株（对氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、卡那霉素和卷曲霉素不同耐药程度的结核分枝杆菌株）采用寡核苷酸微矩阵法进行了检测，该方法检测出了其中的61株。该方法检测氟喹诺酮耐药的敏感度和特异度为98%和100%，卡那霉素为97%和94%，卷曲霉素为100%和94%。该方法的敏感度接近300基因拷贝。其检测的敏感度从67%到100%不等，取决于相关标本涂片阳性的等级，该方法在痰涂片阳性的标本中应用最佳。该方法同之前检测异烟肼和利福平耐药方法的联合应用可以同时检测出MDR和XDR的耐药菌株，并且确定该菌株的耐药程度。

Zakham等 ^［45］通过对利福平耐药基因 rpoB和异烟肼耐药基因 KatG和 inhA检测，以期发现一种快速诊断MDR-TB的方法。收集133例对正规抗结核治疗无效的结核病患者的痰标本，其中100例为新发病例，33例为再次抗结核治疗的患者。所有痰标本中结核分枝杆菌 rpoB、 KatG和 inhA基因突变情况都经过PCR和DNA测序检测。结果显示，单异烟肼耐药7例，单利福平耐药17例，MDR-TB 9例（6.8%）。耐药结核病患者中，有8例为高危病例，其中4例为慢性病例，4例为治疗后复发病例。 rpoB基因中常见的突变为531基因位点的TCG取代TTG，占46.15%。 KatG基因的突变发生在315基因位点，ACC取代AGC。唯一发生 inhA基因突变的标本，其突变的位点为-15p区。作者认为，PCR测序法能快速对临床标本作出准确的耐药性状况检测，为高危结核病患者的管理提供依据，及时调整该类患者的抗结核治疗方案，减少MDR和XDR结核分枝杆菌菌株的产生。

速度-寡结核分枝杆菌直接测定法（speed-oligo direct mycobacterium tuberculosis assay，SO-DMT）是一种新的分子检测技术，可以用于直接检测样本中的结核分枝杆菌复合群（MTBC），并能鉴别MTBC和非结核分枝杆菌（NTM）。Lara-Oya等 ^［46］采用SO-DMT技术对两个结核实验室获得的566个新鲜呼吸道标本（4.9%抗酸菌涂片阳性，7.6%MTBC阳性，1.8%NTM阳性）进行检测。SO-DMT技术的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是76%［涂阳标本为93%（MTBC为100%，NTM 为50%），涂阴标本为56%（MTBC为68%，NTM为16%）］、99%、85%（涂阳标本为100%，涂阴标本为68%）和97%。作者认为，对于涂阳患者，SO-DMT技术可以作为鉴别MTBC和NTM的一种快速准确的方法。

Chen等 ^［47］将多重聚合酶链反应和变性高效液相色谱分析组合用于同时检测分枝杆菌属和鉴定结核分枝杆菌复合群。设计靶标为分枝杆菌属特异性16S rRNA基因序列，并插入IS6110和IS1081特定片段，对83株涵盖23种分枝杆菌和30株非分枝杆菌菌种进行验证，均无交叉反应。对198例临床标本的多重聚合酶链反应检测出其中培养阳性36例以及培养阴性样本中的35.2%（57/162例），并且可在1小时内对纯化的DNA完成检测，显示该方法是检测结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌的有力工具。

近年来纳米技术带来了分子诊断的巨大进步，纳米金颗粒普遍替代荧光、放射性核素信号，基于金纳米粒子（AuNPs）功能化巯基修饰的DNA（金-纳米探针）技术稳定性好、杂交效率高，而且不需要复杂的设备，30分钟即可获得结果，目前已被广泛地用于病原体的核酸检测和区分，包括结核分枝杆菌。Pedrosa等 ^［48］使用多重PCR扩增结核分枝杆菌 rpoB531和 inhA基因，使用单个金-纳米探针队列来检测与MDR-TB相关联的基因突变。扩增目标基因随后与金-纳米探针进行杂交。结果显示对10例利福平耐药和15例利福平敏感标本的检测完全一致，对有14例异烟肼耐药标本检测准确率为84%，其余4例突变位置并不在inhA C 15T。说明金-纳米探针能快速敏感地检测结核分枝杆菌 inhA和 rpoB基因突变情况，有较大的应用价值。Hussain等 ^［49］发展了一种为了特异性检测结核分枝杆菌复合群的快速纳米金检测原型。使用球形金纳米粒子（AuNPs，14nm）对结核分枝杆菌的16S rDNA的区域通过PCR扩增，以及对未扩增的DNA基因使用纳米金检测，结果显示检测的45例DNA基因阳性样本与自动化液体培养系统（BACTEC ^TMMGIT ^TM）结果符合，与半巢式PCR（100%一致性）符合，检测用时1小时。作者认为，纳米金检测原型检测结核分枝杆菌直接而且费用低廉，所开发的原型简单、灵敏、快速，可以替代基于PCR的检测，显示了广泛的应用前景，特别是在发展中国家。

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