结核病临床诊治进展年度报告(2013)
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二、 抗结核药物敏感性试验(DST)

(一) 一线抗结核药物DST
1. 常规方法临床应用情况
尼日利亚Lawson等 [15]对3个结核参比中心新确诊或一线抗结核药物治疗失败的结核病患者进行了横断面调查。每个患者被要求留3份痰标本用来做涂片镜检、L-J培养以及BACTEC MGIT960培养,培养阳性菌株要进一步做SM、INH、RFP、EMB 4种药物敏感性测试。527份培养痰标本中,428份(81%)BACTEC MGIT960培养阳性,59份(11%)为阴性,36份(7%)为污染,4份(1%)为NTM。L-J培养中411例(78%)培养阳性,89例(17%)培养阴性,22例(4%)污染,5例(1%)为NTM。389份标本同时进行了两种方法的药物敏感性检测,结果发现RFP耐药率相似,BACTEC MGIT960检测EMB耐药率高于L-J培养法,但未达到统计学差异。耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)两种方法的检出分别为27例、25例,共检出29例。研究者认为,两种抗结核药物DST检测方法联合应用有助于提高MDR-TB的检出率。钟建平等 [16]利用Mtb阳性的MGIT液体培养管作为原始管,进行一线抗结核药物RFP、INH的DST检测,与传统L-J培养比例法DST检测结果比较。结果发现148份标本固体罗氏培养阳性检出率为41.8%,MGIT液体培养阳性检出率为48.0%,液体培养法阳性检出率比固体培养法高6.2%;45例液体DST与比例法检测的DST结果基本一致,平均检出时间为8.4日。DST结果与传统L-J培养比例法DST检测的28日报告结果比较,差异有统计学意义( P<0.01)。
2. 其他方法 DST
乌干达Boum等 [17]尝试将改良的刃天青试管培养法结合PNB鉴定(RETAP)用于痰标本的结核分枝杆菌培养鉴定而非抗结核药物的DST检测,研究以MGIT法培养18日和改良罗氏培养基培养28日的结果作为参考标准,并与硝酸盐还原法(NRA)以及PNB结合改良NRA法(NRAp)比较。690例疑似肺结核患者痰标本检测结果显示,培养18日时RETAP法的阳性检出率和特异性分别为71.2%、99.3%,而当培养时间延长到28日,其阳性检出率可提高到82.6%。对于涂片阴性的标本培养28日,NRA、NRAp、RETAP 3种方法的阳性检出率分别为64.7%、61.3%、50%。几种显色培养法的培养污染率仅为5.4%~6.7%,远低于污染率在20.4%~22.1%的改良罗氏培养法以及MGIT法。RETAP法缩短了报告时间,可在贫困地区取代罗氏培养法。Satti等 [18]将比色NRA用于米氏7H11琼脂,而非传统改良罗氏培养基来直接检测114份涂片阳性痰标本中INH、RFP的DST,并与比例法罗氏培养法结果相比较。两种方法对RFP的DST结果一致性达100%,而对INH的DST结果为96.4%。平均检测时间为18.6日。Solomon等 [19]在印度南部地区采用MODS法对诊断为结核病的1036份痰标本进行了检测,并与BACTEC TB 460方法进行比较。MODS诊断肺结核的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为89.1%、99.1%、94.2%、95.8%。此外,在耐药结核病的诊断中,MODS法敏感性为84.2%,INH单耐药为87%,RFP单耐药为100%。MODS法可将BACTEC法诊断的中位数时间从21日缩短到9日( P<0.001),且费用只为后者的1/10~1/5。津巴布韦Makamure等 [20]分析了MODS培养和药物敏感性测试结果的准确性,回顾性分析了99名疑似耐药结核患者的138份痰标本检测结果。培养以L-J以及MAGIT结果做参照,DST结果以绝对浓度法结果做参照。MODS法培养的敏感性、特异性分别为85%、93%。MODS法检测该标本耐INH、RFP以及MDR-TB的检出率分别为88%、96%、91%,特异性分别为 89%、89%、90%。MODS法与MAGIT、L-J平均报告时间分别为7日、12日、28日。Coronel等 [21]探讨了用MODS法对已经接受抗结核药物治疗后的患者痰标本进行INH、RFP的DST检测。研究最终确定在微孔培养板中不加药的培养孔出现培养阳性结果1周后观察即得到可靠的MODS DST结果,与比例法罗氏DST培养结果的一致率提高到97%,灵敏度提高到95.8%。孟加拉国Noor等 [22]比较了玻片药物敏感试验和常规DST试验两种方法在已经治疗过的TB患者的MDR-TB的结果。结果发现前者可在10日检出94例MDR-TB,而后者只检出了82例,且耗时3个月。王东萍等 [23]应用噬菌体生物扩增法(PhaB法)直接检测317份患者中采集的痰样本,分析结核分枝杆菌对利福平的耐药性,同时对痰样本进行罗氏培养,并对培养菌株用绝对浓度法进行DST试验。对PhaB法和绝对浓度法检测的DST结果进行比较。PhaB组患者痰送检至获得DST检测结果的时间为3~5日,绝对浓度法为40~60日。259份PhaB法培养阳性痰样本中结核分枝杆菌对利福平耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别是86.11%(31/36)、93.72%(209/223)、68.89%(31/45)、97.66%(209/214)。PhaB法与绝对浓度法检测耐药性的Kappa值为0.723, P=0.000。土耳其Coban等 [24]评价了孔雀石绿脱色试验(MGDA)方法快速检测MDR-TB。该方法原理是当孔雀石绿暴露于含有作用于靶标在细胞壁生物合成的抗结核药物(如异烟肼、乙硫异烟胺等)固体培养基时,可干扰结核分枝杆菌的恢复,并且可在8~9日内报告检测DST结果。研究共对包括19 例MDR-TB在内的50例临床分离株进行了检测,结果显示该方法对INH以及RFP的灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV),前者分别为92.5%、91.3%、92.5%、91.3%;后者分别为92%、94.7%、100%、100%;与传统方法检测的一致性,前者为96.8%,后者为98%。
3. 部分抗结核药物的 DST方法的探讨
美国Horne等 [25]受WHO委托,系统评价了世界卫生组织认可的抗结核药物敏感试验。报告中系统回顾和荟萃分析了诊断的准确性和一线、二线抗结核药物表型结果的重复性。研究报告肯定了WHO推荐的商品化肉汤为培养基的异烟肼和利福平判定临界浓度。认为乙胺丁醇(EMB)和链霉素药物敏感性判断的临界浓度仍需进一步研究证实,目前吡嗪酰胺(PZA)和二线药物的敏感性判断临界浓度尚无判断依据。印度Lakshmi等 [26]对EMB比例法药物敏感性测定方法进行改良以解决实验室结果与临床解释的不一致性。通过235例结核分枝杆菌临床株的比例法药物敏感性的检测结果优化了药物的标准浓度,最终确定40μg/ml、57μg/ml两个浓度。中国的Huang等 [27]评价了MODS法检测PZA,对132株结核分枝杆菌的临床分离株用MODS和常规韦恩法进行了PZA的DST测定,以比例法改良罗氏培养结果作为判断标准,并将3种方法中任意一种检测到PZA耐药的菌株进行 pncA基因测序,从而确定是否有基因突变。MODS和韦恩法检测的灵敏度和特异性分别为97.8%、96.5%和87.0%、97.7%。在46例PZA耐药菌株中41例检测到 pncA基因突变位点,两种方法检测的中位数时间分别为6日、7日。Cui等 [28]比较了BACTEC MGIT960、吡嗪酰胺酶(PZase)活性测定法、分子DST试验(MDST)、刃天青微量滴定测定法(REMA)和3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-2,5-二苯基溴化(MTT)还原试验5种方法对结核分枝杆菌PZA药物敏感性的检测结果。5种方法敏感性分别为98.8%、88.8%、90.5%、98.8%和98.2%,特异性分别为99.2%、98.9%、90.9%、98.5%和100%。结果证明BACTEC MGIT960、MTT、REMA更适合用于PZA药物敏感性测定。
4. 其他研究
Folkvardsen等 [29]用RFP耐药株和敏感株混合模拟患者标本中的异质性耐药菌株,用细菌表型的药物敏感测试、探针杂交和测序3种方法进行DST检测。结果发现细菌表型的DST敏感性最高,而后两种方法可能会造成1%耐药菌株的漏诊。美国Kalokhe等 [30]认为,MDR-TB患者的确诊既不能单独依靠细菌学表型DST检测结果,也不能依赖快速分子DST检测结果分子学诊断结果,而必须结合每个患者的临床症状进行判别。
(二) 二线抗结核药物DST
王伟丽等 [31]对141例复治肺结核患者DST结果进行分析,发现结核分枝杆菌耐药率为95.74%,其中MDR-TB为42.56%,XDR-TB为12.77%;60例MDR-TB患者治疗有效率为80.00%。复治肺结核患者中MDR-TB较高,依据药物敏感试验结果制订个体化治疗方案可达到良好治疗效果。赵冰等 [32]从全国2007~2008年耐药基线调查收集的菌株中选取2008年4~7月期间耐药基线调查点收集的126株MDR菌株,对7种二线抗结核药物(氧氟沙星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、环丝氨酸和对氨基水杨酸)的敏感性进行检测,分析对不同药物耐药率以及交叉耐药的情况。对于二线药物,氧氟沙星和乙硫异烟胺耐药率最高,分别为25.4%(32/126)和23.0%(29/126);其次为卡那霉素和环丝氨酸,其耐药率分别为17.5%(22/126)和13.5%(17/126);最后为卷曲霉素、丙硫异烟胺和对氨基水杨酸,其耐药率均为3.2%(4/126)。初治患者对卡那霉素( P<0.01)和环丝氨酸( P=0.017)的耐药率(卡那霉素:20/60,33.3%;环丝氨酸:13/60,21.7%)显著高于复治患者(卡那霉素:2/66,3.0%;环丝氨酸:4/66,6.1%)。此外,卡那霉素和卷曲霉素,乙硫异烟胺和丙硫异烟胺间均存在单向交叉耐药,在对卷曲霉素耐药的4株中,有3株同时对卡那霉素耐药;4株对丙硫异烟胺耐药菌株均同时对乙硫异烟胺耐药。研究表明,我国耐多药结核分枝杆菌菌株对二线抗结核药物具有较高的耐药率,特别是氧氟沙星和乙硫异烟胺,给我国耐多药结核病控制工作的实施带来严峻的挑战。刘一典等 [33]共收集采用BACTEC MGIT960检测的耐多药结核分枝杆菌临床分离株30株,检测其对氟喹诺酮类及二线注射类抗结核药的DST结果并进行分析。结果发现30株耐多药结核分枝杆菌菌株对氟喹诺酮类和二线注射类抗结核药物耐药共21株(70%)。单药耐药依次为:氧氟沙星耐药19株(63.33%),莫西沙星耐药13株(耐药率43.33%),左氧氟沙星耐药10株(耐药率33.33%),阿米卡星耐药9株(耐药率30%),卷曲霉素最少(26.67%)。氧氟沙星耐药率高于左氧氟沙星耐药和3种氟喹诺酮类药物同时耐药,差异有统计学意义( P=0.038)。广泛耐药共8株。氟喹诺酮类任意耐药及两种注射类药物敏感为11株,氟喹诺酮类均敏感及两种注射类药物任意耐药为2株,相比差异有统计学意义( P=0.001)。研究认为,氧氟沙星不建议作为MDR-TB的治疗用药。MDR-TB临床分离株对阿米卡星和卷曲霉素敏感性较好,推荐可作为MDR-TB的首选药物。王平等 [34]选取了临床分离的敏感及耐药结核分枝杆菌各36株,分别在含有特定浓度的利奈唑胺等药物培养基内培育,采用BD培养基比例法测定各菌株在体外试验的最低抑菌浓度(MIC)。结果发现,利奈唑胺对敏感及耐药结核分枝杆菌的MIC均在0.25~0.50μg/ml,其中0.125μg/ml浓度敏感株占63.89%,耐药株全部存活;在0.25μg/ml浓度下敏感株占33.33%、耐药株占36.11%,在0.5μg/ml浓度下敏感株占2.77%,耐药株占63.88%;>1μg/ml全部无细菌生长。结果表明,常规剂量的利奈唑胺在体外有较好的抗Mtb活性。虽然异烟肼、利福平对耐药结核分枝杆菌仍有较好的抗菌活性,但是需要增加剂量。

(毕爱笑 尹洪云 胡忠义)

参考文献
1. Uddin M K,Chowdhury M R,Ahmed S,et al. Comparison of direct versus concentrated smear microscopy in detection of pulmonary tuberculosis. BMC Res Notes,2013,6:291.
2. Vignesh R,Swathirajan C R,Solomon S,et al. Could concentrating single sputum improve the performance of smear microscopy in detecting TB among HIV patients? J Infect,2013,66(4):388-390.
3. Dinic L,Idigbe O E,Meloni S,et al. Sputum smear concentration may misidentify acid-fast bacilli as Mycobacterium tuberculosis in HIV-infected patients. J Acquir Immune Defic Syndr,2013,63(2):168-177.
4. Nayak P,Kumar A M,Claassens M,et al. Comparing same day sputum microscopy with conventional sputum microscopy for the diagnosis of tuberculosis--Chhattisgarh,India. PLoS One,2013,8(9):e74964.
5. Tapley A,Switz N,Reber C,et al. Mobile digital fluorescence microscopy for diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol,2013,51(6):1774-1778.
6. Marzouk M,Ferjani A,Dhaou M,et al. Comparison of LED and conventional fluorescence microscopy for detection of acid-fast bacilli in an area with high tuberculosis incidence. Diagn Microbiol Infect Dis,2013,76(3):306-308.
7. Chaidir L,Parwati I,Annisa J,et al. Implementation of LED fluorescence microscopy for diagnosis of pulmonary and HIV-associated tuberculosis in a hospital setting in Indonesia. PLoS One,2013,8(4):e61727
8. Xia H,Song Y Y,Zhao B,et al. Multicentre evaluation of Ziehl-Neelsen and light-emitting diode fluorescence microscopy in China. Int J Tuberc Lung Dis,2013,17(1):107-112.
9. Gammo M,Lamaric W,Hadida M,et al. Front-loaded smear microscopy for the diagnosis of pulmonary TB in Tripoli,Libya. Trans R Soc Trop Med Hyg,2013,107(2):137-139.
10. 赵立平,朱玛,姜广路,等. 不同痰标本处理方法对结核分枝杆菌罗氏培养检测结果的影响. 中国防痨杂志,2013,35(2):93-96.
11. Ghodbane R,Drancourt M. Magnetic bead protocol for culturing Mycobacterium tuberculosis from sputum specimens. J Clin Microbiol,2013,51(5):1578-1579.
12. Ruiz Jiménez M,Guillén Martín S,Prieto Tato LM,et al. Induced sputum versus gastric lavage for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children. BMC Infect Dis,2013,13(1):222.
13. Parashar D,Kabra SK,Lodha R,et al. Does neutralization of gastric aspirates from children with suspected intrathoracic tuberculosis affect mycobacterial yields on MGIT culture?J Clin Microbiol,2013,51(6):1753-1756.
14. Grewal R,Abayomi EA. Bone marrow morphological features and diagnostic value in paediatric disseminated tuberculosis in the setting of increased HIV prevalence. S Afr Med J,2013,103(5):326-329.
15. Lawson L,Emenyonu N,Abdurrahman S T,et al. Comparison of Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility using solid and liquid culture in Nigeria. BMC Res Notes,2013,6:215.
16. 钟建平,金法祥,王华钧,等. 结核分枝杆菌荧光判读药敏试验的方法.中华医院感染学杂志,2013,23(8):1991-1992.
17. Boum Y N,Orikiriza P,Rojas-Ponce G,et al. Use of colorimetric culture methods for detection of Mycobacterium tuberculosis complex isolates from sputum samples in resource-limited settings. J Clin Microbiol,2013,51(7):2273-2279.
18. Satti L,Ikram A,Palomino J C,et al. Field evaluation of the direct detection of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis by nitrate reductase assay on 7H11 agar. Tuberculosis(Edinb),2013,93(3):308-311.
19. Solomon S,Balakrishnan P,Vignesh R,et al. A rapid and low-cost microscopic observation drug susceptibility assay for detecting TB and MDR-TB among individuals infected by HIV in South India. Indian J Med Microbiol,2013,31(2):130-137.
20. Makamure B,Mhaka J,Makumbirofa S,et al. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in Harare,Zimbabwe. PLoS One,2013,8(2):e55872.
21. Coronel J,Roper M H,Herrera C,et al. Validation of MODS for rapid,direct rifampicin and isoniazid drug susceptibility testing in patients receiving TB treatment. Clin Microbiol Infect,2013. Sep 21. [Epub ahead of print]
22. Noor R,Hossain A,Munshi S K,et al. Slide drug susceptibility test for the detection of multidrug-resistant tuberculosis in Bangladesh. J Infect Chemother,2013,19(5):818-824.
23. 王东萍,程红燕,丁运生,等. 痰噬菌体生物扩增法检测结核病初治患者中结核分枝杆菌对利福平的耐药性分析. 中华临床感染病杂志,2013,6(2):114-116.
24. Coban A Y,Uzun M. Rapid detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis using the malachite green decolourisation assay. Mem Inst Oswaldo Cruz,2013,108(8):1021-1023.
25. Horne D J,Pinto L M,Arentz M,et al. Diagnostic accuracy and reproducibility of WHO-endorsed phenotypic drug susceptibility testing methods for firstline and second-line antituberculosis drugs. J Clin Microbiol,2013,51(2):393-401.
26. Lakshmi R,Ramachandran R,Devika K,et al. Modification of proportion sensitivity testing method for ethionamide. World J Microbiol Biotechnol,2013,29(6):1117-1119.
27. Huang Z K,Luo Q,Jiang B X,et al. Performance of the microscopic observation drug susceptibility assay in pyrazinamide susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis. Chin Med J(Engl),2013,126(22):4334-4339.
28. Cui Z,Wang J,Lu J,et al. Evaluation of methods for testing the susceptibility of clinical Mycobacterium tuberculosis isolates to pyrazinamide. J Clin Microbiol,2013,51(5):1374-1380.
29. Folkvardsen D B,Thomsen V O,Rigouts L,et al. Rifampin heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis cultures as detected by phenotypic and genotypic drug susceptibility test methods. J Clin Microbiol,2013,51(12):4220-4222.
30. Kalokhe A S,Shafiq M,Lee J C,et al. Multidrug-resistant tuberculosis drug susceptibility and molecular diagnostic testing. Am J Med Sci,2013,345(2):143-148.
31. 王伟丽,陈鲁琦. 141例复治肺结核耐药情况分析. 中华实用诊断与治疗杂志,2013,27(9):916-917.
32. 赵冰,宋媛媛,逄宇,等. 中国耐多药结核分枝杆菌二线抗结核药物敏感性分析. 中国防痨杂志,2013,35(10):831-834.
33. 刘一典,桂徐蔚,景玲杰,等. 耐多药结核分枝杆菌临床分离株30株对氟喹诺酮类及二线注射类抗结核药敏感性的分析. 中华临床医师杂志(电子版),2013(4):1565-1568.
34. 王平,王晓燕,刘国辉,等. 利奈唑胺对结核分枝杆菌体外抗菌活性的研究. 中华医院感染学杂志,2013,23(17):4260-4261.