第二章　结核病病原学

结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB），简称结核杆菌，是家畜、野生动物、禽类及人类结核病的病原菌。结核分枝杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，估计世界人口中1/3的人已经感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200～300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。

结核分枝杆菌细长略弯曲，聚集呈分枝状排列增殖。因其细胞壁含有大量脂质，不易着色，经萋-尼氏抗酸染色呈红色，无菌毛和鞭毛，不形成芽孢（胞），现证明有荚膜。单个，成双，间或成丛排列。在人工培养基上，由于菌型、菌株和环境条件不同，可出现多种形态，如近似球形、棒状或丝状。在电镜下观察本菌具有复杂结构：由微荚膜、细胞外壳的三层结构、胞浆膜、胞浆、间体、核糖体及中间核质构成。

典型的结核分枝杆菌的形态为细长稍弯曲或直的、两端圆钝的杆菌，长1～4μm，宽0.3～0.6μm，单个散在，有时呈X、Y形或条索状。痰标本涂片经过抗酸染色后在1000倍的生物显微镜下可以看到。

结核分枝杆菌在体内外经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，异烟肼影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，均可导致其变为L型，呈颗粒状或丝状。异烟肼影响分枝菌酸的合成，可变为抗酸染色阴性。这种形态多形、染色多变的特征在肺内外结核感染标本中常能见到。临床结核寒型脓肿和痰标本中甚至还可见有非抗酸性革兰阳性颗粒，过去称为Much颗粒。该颗粒在体内或细胞培养中能恢复为抗酸性杆菌，故亦为L型。

结核分枝杆菌为专性需氧菌，营养要求高，生长缓慢，初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏（Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般2～4周可见菌落生长。在固体培养基上呈现灰黄白色，干燥颗粒状，显著隆起，表面粗糙皱缩、菜花状的菌落。在液体培养基内，于液面形成粗纹皱膜，培养基保持透明。若加入吐温80于培养基中，可使结核分枝杆菌呈分散均匀生长。一般1～2周即可生长。临床标本检查液体培养比固体培养的阳性率高数倍。菌体为细长略弯的杆菌，经抗酸染色染成红色。本菌营养要求高，专性需氧，最适pH以6.5～6.8为宜。生长缓慢，在固体培养基经2～4周才出现肉眼可见的菌落。对干燥的抵抗力特别强，对酸碱有较强的抵抗力，易产生耐药性变异及L型细菌。

结核分枝杆菌不发酵糖类，能产生过氧化氢酶。对人致病的结核分枝杆菌现一般认为有人型、牛型、非洲型。人型与牛型菌形态相似，对豚鼠皆有较强致病力，但人型菌对家兔致病力远较牛型菌为弱。人型结核分枝杆菌能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，牛型结核分枝杆菌都不具备上述特性。人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无毒株则中性红阴性且失去索状生长现象。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性；非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。热触酶试验检查方法是将浓的细菌悬液置68℃水浴加温20分钟，然后再加入H ₂O ₂，观察是否产生气泡，有气泡者为阳性。牛型结核分枝杆菌可经饮用未消毒的带菌牛乳引起肠道结核感染。显微镜下均为抗酸杆菌，细长稍弯，有时见人字形、Y形分枝，培养生长经生化试验可以鉴别菌型。

结核分枝杆菌对酸、碱、自然环境和干燥有抵抗力，但对湿热、酒精和紫外线敏感，对抗结核药物易产生耐药性。结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质，故对乙醇敏感，在70%乙醇中2分钟死亡。如75%酒精作用数分钟、液体中加热至62～63℃，15分钟均可导致其死亡。结核分枝杆菌对紫外线敏感。直接日光照射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。结核分枝杆菌在干燥痰内可存活6～8个月。对抗结核药物易产生耐药性。

结核分枝杆菌的抵抗力与环境中有机物的存在有密切关系，如痰液可增强结核分枝杆菌的抵抗力。因大多数消毒剂可使痰中的蛋白质凝固，包在细菌周围，使细菌不易被杀死。5% 苯酚在无痰时30分钟可杀死结核分枝杆菌，有痰时需要24小时；5%煤酚皂溶液（来苏儿）无痰时5分钟杀死结核分枝杆菌，有痰时需要1～2小时。

结核分枝杆菌对酸（3% HCl或6% H ₂SO ₄）或碱（4% NaOH）有抵抗力，酸、碱作用15分钟结核分枝杆菌不受其影响。可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的黏稠物质。结核分枝杆菌对1∶13 000孔雀绿有抵抗力，加在培养基中可抑制杂菌生长。结核分枝杆菌对链霉素、异烟肼、利福平、环丝氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、对氨基水杨酸等敏感，但长期用药容易出现耐药性，而吡嗪酰胺的耐药性<5%。

结核分枝杆菌的形态、菌落、毒力及耐药性等均可发生变异。

结核分枝杆菌对抗结核药物较易产生耐药性，造成耐药菌株增多，给治疗造成困难。

将有毒的牛分枝杆菌培养于含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中，经230次移种传代，历时13年而获得了减毒活菌株，即卡介苗，目前广泛用于人类结核病的预防。

因结核分枝杆菌体内含有大量类脂质，占菌体干重的40%，在细胞壁内含量最多，因其富脂外壁的疏水性，一般的消毒剂难以渗入，对外界条件有异常强的抵抗力，使通常的灭菌方法易失败，15%硫酸或15%氢氧化钠溶液处理30分钟，可杀死一般的病原菌，但不能杀死结核分枝杆菌。在阴暗潮湿的地方可生存数月，在阳光暴晒下能生存数小时，在-7℃以下可生存4～5年。但在沸水中（100℃）数分钟可死亡，因此，煮沸消毒是最有效、最经济的方法。醇脂性溶剂-酒精能渗入其脂层而发挥奇效，用75%酒精2分钟便可将它杀死。

结核分枝杆菌在含氧40%～50%、含CO ₂5%～10%、温度为36℃±5℃和pH值为6.8～7.2的条件下生长旺盛，并且在一般的培养基上结核分枝杆菌是不生长的，它必须在含有血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。所以结核分枝杆菌最易侵犯氧气、血流、营养充足丰富的肺脏以及骨骼的两端。结核分枝杆菌无论在什么环境中的存在，都已显示出，它是细菌家族中最优秀的菌种之一。

结核分枝杆菌生长缓慢，无运动能力，性情懒惰，其最快分裂增殖速度为18小时一代，而大多数细菌都是几分钟或几十分钟便繁殖一代，如大肠杆菌约需20分钟便可繁殖一代，10小时后，一个大肠杆菌繁殖10亿个以上，可是一个结核分枝杆菌18个小时才繁殖2个。可别小看或轻视结核分枝杆菌带有这种欺骗性形似疲惫的懒惰行为，科学家们在实验室及广大医务人员在临床治疗中与它进行长期斗争的实践一再证明，我们与它斗争的手段还没有提高到一个较高的水平上来。

结核分枝杆菌不产生内、外毒素，其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。致病物质与荚膜、脂质和蛋白质有关。

荚膜的主要成分为多糖、部分脂质和蛋白质。其对结核分枝杆菌的作用有：①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3（CR3）结合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上的黏附与入侵；②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养；③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易进入。故结核标本用4% NaOH消化时，一般细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还可抑制吞噬体与溶酶体的融合。

据实验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质成分有关，特别是糖脂更为重要。①索状因子：是分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂，能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关。它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌中剔除，则细菌丧失毒力；②磷脂：能促使单核细胞增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节；③硫酸脑苷脂（sulfatide）：可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活；④蜡质D：是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟发型超敏反应。

有抗原性，和蜡质D结合后能使机体发生超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症状，并在形成结核结节中发挥一定作用。

结核分枝杆菌是胞内寄生菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与感染细胞反应，导致细胞崩溃，释放出结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌接触起辅助作用。

一直以来认为在天然免疫中巨噬细胞是结核感染的主要的靶细胞，也是机体抗结核感染的最早起作用和最具有代表性的细胞群。但随着研究的深入，发现在结核感染的发展中有重要作用的其他细胞群，如中性粒细胞，是最早被征集到炎症部位，通过氧依赖的杀菌物质和胞外捕获机制来杀病原微生物。而且有研究者在感染实验动物前，将中性粒细胞去除，结果分枝杆菌生长增加；反之，实验前用刺激中性粒细胞增殖的试剂，则分枝杆菌生长率降低。以及后来在中性粒细胞中发现了防御素——机体天然抗结核反应机制的重要组分。然而，中性粒细胞不只是有这种对机体的保护作用，还有些报道显示由于不同宿主对结核分枝杆菌的敏感性的不同，中性粒细胞的病理损伤作用会超过其保护作用。

细胞免疫反应针对结核分枝杆菌，如同其他胞内感染菌一样，细胞介导的免疫反应比抗体介导的免疫反应更重要。于是通常会认为结核分枝杆菌存在胞内不能与抗体结合，因此体液免疫反应对结核感染的机体没有保护作用。但是事实并非如此，抗体对于胞内菌感染的作用越来越得到研究者们的关注，以期得到有关结核免疫机制的更深入理解。

在抗结核的细胞免疫反应中，主要参与的细胞是CD4 ⁺和CD8 ⁺T细胞。巨噬细胞中结核分枝杆菌通过MHCⅡ类分子的抗原提呈给CD4 ⁺T细胞，被早期细胞因子如IL-12、IL-18等诱导向Th1 型细胞分化。这种CD4 ⁺T细胞能够产生大量的IFN-γ等细胞因子，激活巨噬细胞，加速吞噬和杀灭结核分枝杆菌。另外有研究说明CD4 ⁺T细胞还参与被感染细胞的凋亡。抗原特异的溶细胞性CD4 ⁺T细胞杀灭吞噬了结核分枝杆菌的巨噬细胞，其中对细胞的溶解会导致细菌的扩散，但是释放出的细菌又会被机体中的其他巨噬细胞吞噬，这样形成的一个恶性循环；只有调节巨噬细胞和溶细胞性T细胞活化之间平衡才能利于感染的控制。总的来说，CD4 ⁺T细胞在机体抗结核感染起着重要作用，当例如HIV 感染的患者缺乏CD4 ⁺ T细胞时，结核感染便不能控制。对于CD8 ⁺T细胞对结核感染的控制作用主要是产生颗粒溶素（granulysin）和穿孔素来直接杀灭结核分枝杆菌；还有r/δ T 细胞，在天然免疫和适应性免疫中起连接作用，其作用不仅仅是产生细胞因子和细胞毒性作用，还可以维持宿主细胞的完整性和内环境的稳态。另外还有些调节性T 细胞和单核细胞都能产生免疫抑制性的细胞因子TGF-β，可以被manLAM 刺激分泌增加，下调炎症反应，利于结核分枝杆菌的生存。

结核分枝杆菌所致免疫应答的特点，是机体对结核分枝杆菌产生特异性免疫的同时，也产生了迟发型超敏反应。随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用的同时，也可以看到有迟发型超敏反应的产生，二者均为T细胞介导的结果。从郭霍现象（Koch phenomenon）可以看到，将结核分枝杆菌初次注入健康豚鼠皮下，10～14天后局部溃烂不愈，附近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，表现为原发感染的特点。若以结核分枝杆菌对以前曾感染过结核的豚鼠进行再感染，则于1～2天内局部迅速产生溃烂，易愈合，附近淋巴结不肿大，细菌亦很少扩散，表现为继发感染的特点。可见再感染时溃疡浅、易愈合、不扩散，表明机体已有一定免疫力。但再感染时溃疡发生快，说明在产生免疫的同时有超敏反应的参与。近年来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生免疫和超敏反应的物质不同。

1976年Bassau等首次用结核分枝杆菌培养滤液，即PPD（结核菌素纯蛋白衍生物）作抗原，以ELISA法检测89例肺结核患者及48正常人血清中的结核抗体，敏感性为57%，特异性为98%。由于ELISA法简便易行，快速且无需精密仪器，在结核病血清学诊断方面应用最多最广。据报告ELISA法检测结核抗体的敏感性为62.0%～94.7%，但结核分枝杆菌L型感染者OT或PPD实验常呈阴性。目前可以采用免疫荧光法和胶乳凝集试验检验，两者在抗体稀释度很高时，仍呈阳性反应，这与非结核分枝杆菌L型或其他细菌L型的表现明显不同。

总之，对结核分枝杆菌的生物学特性的研究，最终是为结核病的防治提供理论基础。研制新型的抗结核疫苗，从而有效地控制结核病对人类的威胁日益受到重视，不可避免地带动了对结核分枝杆菌的分子生物学和免疫致病机制的深入研究，而且对于结核病这种感染性疾病的致病机制的研究要求广泛了解许多专业领域，还需要加强临床医生和科研人员的合作。