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一、理化特性与分子结构
(一)理化特性 碳酸酐酶同工酶的分布及生理功能特性如下:
(1)细胞质碳酸酐酶CAI,CAII,CAIII:CAI在人红细胞中含量相当丰富,为CAII的5~6倍,但是活性仅仅为CAII的15%。它主要在大肠、角膜、晶状体三者的上皮以及汗腺、脂肪组织、肌上皮细胞中表达。怀孕40周后,胎儿CAI开始表达,出生后一年内,其表达逐渐增加。CAI对卤素盐的抑制作用的敏感性比CAII高,但是对磺胺类抑制剂的敏感性较差。尽管CAI在红细胞内含量仅次于血红蛋白,但是缺乏CAI并不导致血液疾病,可能是因为其他碳酸酐酶或其他作用机制补偿了因CAI缺乏引起的改变。
CAII是碳酸酐酶同工酶中反应活性很高的一类酶,其周转率高达1×10 6s -1,而且它的分布也最广泛,几乎在所有的组织和器官中表达。CAII在各组织器官细胞中的作用各不相同。它最主要的作用是调节酸碱平衡,此外,它还参与脂肪酸和氨基酸的合成。
CAIII是反应活性很低的一种碳酸酐酶同工酶,它对CO 2水合反应作用的强度仅为CAII 的1%。CAIII主要在骨骼肌中表达。相对于其他同工酶,CAIII在其他组织中的表达很少。
(2)膜连接的碳酸酐酶CAIV,CAXIV,CAIX,CAXII:CAIV首先从牛肺中纯化得到。与CAII相似,它的反应活性高,对卤素离子抗性强,但是对磺胺类化合物抗性相对较弱。人体中CAIV与上述CAIV很相似,但是分子量较小。CAIV通过糖化的磷脂酰肌醇与膜锚合在一起,经磷脂酰肌醇专一性磷脂酶C作用后释放出来。它在肾某些部位的上皮细胞、毛细血管的内皮细胞、胃肠壁等部位表达量最为丰富。CAIV的主要生理功能是重吸收CO 2水合作用形成的 (肾)、通过CO 2水合作用形成重碳酸盐促进CO 2外流以及加速组织中微管系统中CO 2的转移产生CO 2(脑、骨骼肌、心肌)、通过重碳酸盐去水化成CO 2,后者通过肺泡壁外流加速CO 2在血液和肺泡之间的交换(肺)。
近年的研究发现,在人的正常肠和结肠瘤中有发现两种新的与膜相连的碳酸酐酶同工酶CAIX及CAXII。在人的输精管上皮细胞以及附睾中能检测到CAXII,在输精管中也能检测到含量明显小于CAXII的CAIX,但是在附睾中则几乎没有发现CAIX的存在。在患有结肠瘤的患者中,发现CAI和CAII的表达量处于正常水平,而CAIX和CAXII的表达量则上升,提示这两种同工酶可能参与了结肠瘤的癌变过程。
(3)唾液中的分泌型碳酸酐酶CAVI:人体CAVI是从人唾液中分离纯化得到的糖蛋白。人中的CAVI的活性相对较低,只有CAII活性的2%~3%。与CAII相比,对某些抑制剂的反应性相似,而对卤素化合物、乙酰唑胺及甲酰唑胺的敏感性不同。CAVI仅仅在唾液腺中表达,而且主要是在颌下腺和腮腺的腺泡细胞中表达。在颌下腺和腮腺中,CAII可能促使了 分泌到唾液中,而CAVI则可能起到了调节pH的作用,随后保护了胃和食道。
(4)线粒体碳酸酐酶CAV:成熟的CAV片段首先在成年人肝细胞线粒体中分离得到,它的活性仅为CAII的0.06%,是一种低活性的碳酸酐酶同工酶。CAV的水解作用与CAI相似,然而它对抑制剂的敏感性又与CAII相似。CAV在组织中的分布至今还不很清楚。CAV的主要生理作用体现在两条途径:一是为线粒体中丙酮酸羧化酶提供了 ;另一条途径是尿素生成反应,CAV为线粒体中氨甲酰磷酸合成提供了 。
(二)碳酸酐酶的分子结构
在CA活性中心存在一个Zn原子,对于CA的催化活性来说是必需的。在CAⅠ和CAⅡ中Zn原子以单体形式存在,在CAⅢ中以二硫键相连的二聚体形式存在。人类CAⅠ和CAⅡ的三维结构用X线晶体衍射图测试几乎相同二者氨基酸序列约有60%同源。CAⅣ有260个氨基酸,通过磷酯酰肌醇甘油键锚于质膜;与胞浆内CA有30%-36%同源性。
碳酸酐酶活性中心结构晶体结构研究显示人碳酸酐酶Ⅱ的活性中心由三个组氨酸残基(His-94,His-96和His-119)和一个水分子与一个锌原子配位所形成的一个畸变四面体结构所组成,附近有一个由Val-143、Val-121、Trp-209和Leu-198所构成的疏水口袋和由Thr-199 和His-64所组成的一个质子转移通道,如图3-8-1所示。
图3-8-1 碳酸酐酶活性中心结构
研究表明与Zn(Ⅱ)离子配位的OH -作为亲核试剂进攻键合的底物分子,即结合的水分子被锌离子活化,在催化二氧化碳的水合过程中酶的His 3ZnOH形式是活性物质,而在催化碳酸氢根的脱水过程中His 3ZnOH 2是活性物质。His-64通过氢键作用有利于His 3ZnOH的形成,同时也可降低His 3ZnOH 2被H 2O取代时的反应能。Thr-199不仅与Glu-106组成一个氢键网络稳定His 3ZnOH结构,还被认为在His 3ZnOCO 2H中间体形成后的质子转移过程中直接影响HCO 3
-单齿和双齿配位的转变。由Val-143、Val-121、Trp-209和Leu-198所构成的疏水口袋的功能被认为是将CO 2固定在本疏水空腔内,以便His 3ZnOH对CO 2直接进行亲核进攻。