随着科技的发展，用于蛋白质组学研究的方法和技术日新月异。但是，其中最主要也是最成熟的方法技术仍然以双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）和质谱为主。在蛋白质组学研究中常常涉及的相关技术包括样品的处理技术、双向电泳分离技术、蛋白质分析技术如质谱技术以及数据库检索分析等。下面对这些技术进行简要介绍。

样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则:①尽可能地提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质损失；②减少蛋白质的人为修饰；③破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

最普遍的离液剂是脲，其主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质的肽链伸展开来，充分暴露亲水中心，降低接近疏水残基的能量域，但是通常当脲和表面活性剂CHAPS联合使用时，会使某些蛋白质吸附在固相pH梯度凝胶中而丢失。因此，近年常将一种新的离液剂硫脲和脲联合使用，以增加蛋白质在IPG（i固相pH梯度，mmobilized pH gradient）胶条内的溶解性。硫脲的使用大大改善了蛋白质的溶解性能，特别是改善膜蛋白的提取。但硫脲在水中溶解性差，需用高浓度的脲助溶，因此，在实际应用中常用2mol/L硫脲与5～7mol/L脲联合使用，以利于膜蛋白的提取。

蛋白质在去折叠后，会暴露出大量疏水性残基，因此常需使用表面活性剂破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用。常使用的表面活性剂有阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），非离子去污剂Triton X-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS等。离子型去污剂如SDS，不利于稳定等电聚焦中蛋白质的等电点，因此，一般不宜在等电聚焦样品溶解液中使用。但是SDS能有力地溶解膜蛋白，故可用于样品处理的初始阶段。目前最常用于等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis，IEF）的表面活性剂主要为CHAPS等非离子或两性离子表面活性剂。

在蛋白质制备中常需要断裂蛋白质分子中的二硫键，以利于肽链的分离，因此，样品还原的好坏也会影响到蛋白质的分离效果。一般使用β-巯基乙醇和二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）作还原剂，但DTT本身带有电荷，在等电聚焦时常常会迁移到pH范围以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使蛋白溶解度降低而重新沉淀下来。目前较多采用非离子型还原剂如三丁基膦（tributyl-phosphine，TBP）增加蛋白质的溶解性，帮助蛋白质从第一向转移到第二向。

此外，利用载体两性电解质与核酸形成复合物，再利用超速离心的办法可除去核酸；在加样前可加入核酸内切酶降解核酸，同时加入蛋白酶酶抑制剂如苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）等抑制某些蛋白酶的活性。

细胞破碎主要采用机械和化学方法进行。由于在细胞破碎时会释放出蛋白酶，所以应加蛋白酶抑制剂。为了使蛋白酶及其他引起蛋白质修饰的酶迅速失活，一般尽量将样品直接加入酶的变性裂解液中，并在低温及使用预先冷冻的溶液下进行操作。常用的细胞破碎方法分为以下两种:

这是一种非常温和的裂解细胞的方法，可用于进一步进行细胞分级为亚细胞组分，如血细胞及组织培养细胞悬浮于渗透溶胞溶液中，细胞溶涨而释放出细胞内容物。

可将细菌细胞及组织培养细胞放在液氮中冻结后，迅速融解，再冻结，再融解，如此循环多次。

通过含去污剂的裂解液处理组织、细胞以裂解细胞膜，使细胞内含物释放出来。一般常将细胞直接置裂解液或样品液中进行悬浮处理。

当破碎不容易破碎的细胞或固体组织中的细胞时，因有坚韧细胞膜，需要采用激烈的方法进行细胞破碎。这些方法可以使细胞完全破碎裂解，在操作过程中应避免产热及产生泡沫，以免引起蛋白质变性。主要的方法有超声波处理、压力杯法、研磨法以及机械匀浆法等。

各种不同组织细胞的蛋白质存在于细胞的各种不同结构中，如细胞质、细胞膜、细胞核、核质及各种细胞器中。因此，要获得细胞的总蛋白质，必须将细胞破碎，并需使用各种不同的表面活性剂、增溶溶解剂、还原剂等，才能将蛋白质尽量溶解出来。大多数情况下都是采用一步法进行蛋白质样品的制备。但是由于不同蛋白质的溶解度及丰度常常存在较大的差异，因此采用细胞分级或蛋白质组分分级顺序提取的方法可以尽量把细胞中的全部蛋白质提取出来。

由于不同蛋白质的溶解度不同，对那些不溶性蛋白质（疏水性很强的蛋白质）使用一步法是很难提取出来的，对低丰度的蛋白质的提取也存在一定的问题。为了富集低拷贝蛋白质，提高蛋白质在2-DE胶中分离的分辨率，一些实验室提出了细胞组分的分步提取，即蛋白质顺序分级抽提法，该法将一个细胞的总蛋白质分成不同的蛋白质组分，以降低蛋白质的复杂性，提高2-DE分辨率。这些亚分级方法主要基于细胞组分的大小或密度不同，采用超离心法分离出线粒体、溶酶体等细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液将不同细胞组分的蛋白质增溶溶解出来，这样将大大减少样品的复杂性。如果在一个细胞中有数千种蛋白质，在一个细胞器内蛋白质的数目则可降至数百种，这样便可增加电泳时蛋白的上样量，有利于提高低丰度蛋白质的分辨率。

另一种顺序提取法主要是基于不同蛋白质溶解度的差异，而使用不同强度增溶剂（离液剂）、表面活性剂顺序提取不同蛋白质组分。1998年，Molley等首先提出的顺序抽提步骤:第一步，细胞裂解，以Tris碱抽提出细胞内的可溶性蛋白质；第二步，把第一步未溶解的细胞沉淀用常规的IEF样品液进行抽提，然后离心，主要是富集膜蛋白；第三步，采用更有效的表面活性剂以及还原剂，如5mol/L脲、2mol/L硫脲、2%CHAPS、2%SB3-10、2mol/L TBP进行抽提；如有必要也可进行第四步抽提，即把第三步未溶解的细胞沉淀再用1%SDS、50mmol/L DTT、25%甘油以及0.4mol/L Tris-HCl（pH8.8）溶解抽提，这样可使与细胞膜或细胞器结合很牢的常规提取不能溶解的膜蛋白质、不溶性蛋白质溶解出来。

双向电泳是蛋白质组学研究中的核心技术之一，是目前常用的唯一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，广泛应用于生物学研究的各个领域。垂直双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-D polyacrylamide gel electrophoresis，2-D PAGE）根据蛋白质等电点及分子量进行双向分离，将复杂的蛋白质混合物分离并可对不同样品或不同状态的蛋白质表达图谱进行对比，提供定量信息，广泛应用于信号转导、蛋白质定位、生理病理过程、疾病标志物，以及蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、配体-受体相互作用等领域的研究。

双向凝胶电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）于1975年首先由O'Farrell等创立，目前主要应用的是GÖrg等建立的固定pH梯度的凝胶电泳（IPG-DALT），其具有分辨率高、上样量大、重复性好的优点，并且可以与质谱联用对蛋白质进行鉴定。基本原理是:在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点（isoelectric point，pI）和分子量，运用等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离。

在第一向等电聚焦电泳中，出于蛋白质分子在不同的pH环境中带不同数量的正电荷或负电荷，当在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点决定于它的氨基酸组成，因此不同蛋白质都有其各自的等电点。细胞内蛋白质PI值范围十分宽广，由此，进行蛋白质的分离和分析。传统的载体两性电解质pH梯度等电点聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定的连续和线性的pH梯度。当带电的蛋白质分子进入此系统时便移动聚焦至相当于其等电点的位置，因此在双向电泳中的第一向是依据等电点不同而对蛋白质进行分离。在20世纪80年代建立了一种具有更高分辨能力的固相pH梯度等电聚焦技术，其分辨率可达0.001pH单位，是目前分辨率最高的电泳方法。这是利用合成一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，其与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有相似的聚合性质，可以参与丙烯酰胺的共价聚合，从而形成稳定的不随环境电场等条件变化的pH梯度。由于固相pH介质与聚丙烯酰胺共价结合，因此形成的pH梯度不受脱水、重新水化和电场因素的影响，所形成的pH梯度十分稳定。而且固相pH梯度凝胶上样量大，平衡时蛋白质不易被洗脱，易于进入第二向凝胶。

在第一向IEF电泳结束后，需向第二向SDS电泳转移。在转移前都必须经过平衡，平衡的目的是通过平衡液中的DTT或β-巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质充分结合；另外在平衡过程中使等电聚焦凝胶中的两性载体电解质或固相pH梯度IEF中水化液成分及高浓度的脲扩散出凝胶，并使经聚焦的胶条为第二向浓缩胶缓冲液所平衡，有利于蛋白质从第一向向第二向转移。

双向电泳的第二向是SDS凝胶电泳。SDS是一种阴离子去垢剂，它能破坏蛋白质分子间的非共价结合，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是在强还原剂β-巯基乙醇存在的情况下，蛋白质分子的二硫键已经被还原，保证蛋白质分子与SDS充分结合，从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，这种复合物所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷，因而消除不同蛋白质分子间的电荷差异。而且流体力学和光学性质表明蛋白质与SDS所形成的复合物为长椭圆棒形，蛋白质分子在SDS系统中的迁移率不再受电荷和分子形状等因素的影响，其迁移率主要取决于蛋白质分子质量的大小。

2-D PAGE的优点:可以同时分离大量蛋白质，应用大面积胶条，一次可鉴定近10 000个蛋白质点；可通过蛋白质点染色的强度对其进行定量分析，也可提供蛋白质翻译后修饰信息，具有不同程度的糖基化或磷酸化修饰的蛋白质亚型较容易地进行分离。在血清中，应用2-D PAGE可分辨出100多种血清蛋白，其高度分辨率是各种类型单向PAGE及其他双向PAGE所无法比拟的，因此，它可广泛用于生物大分子的分离和精确分析。随着蛋白质组学的迅速普及与发展，双向电泳技术获得很大改进，特别是固相梯度pH胶条的商品化，使双向电泳的重复性得到极大提高，双向电泳技术更为普及。

当然，双向电泳也存在一些问题。在目前的技术条件下，还不能够很好地分离极端酸性和极端碱性的蛋白、质量过大或过小的蛋白、低丰度蛋白、疏水性较强的蛋白。同时，双向电泳手工操作步骤较多而且烦琐，蛋白分离的效果在很大程度上取决于操作者的经验，尚缺乏高速自动化的技术。

为了研究在生理、病理状态下蛋白质的功能，翻译中和翻译后修饰或某种特殊目的而常常需要使用其他类型的电泳方法。Manube T等根据第一向和第二向是否处于变性条件，而将这些2D-PAGE分为以下4类。

第一向和第二向均在非变性条件下进行。因此分布在凝胶上的蛋白质的等电点及表观分子质量和生理条件下的蛋白质是相一致的，这种类型电泳适合于分析功能蛋白质。

这类电泳的第一向采用非变性的IEF后，在含有2%SDS溶液中进行平衡，第二向为变性SDS电泳。这种类型适合于分析非共价结合的蛋白质与蛋白质的相互作用。

第一向是在非变性的条件下进行等电聚焦，然后用8mol/L脲、5%β-巯基乙醇以及2%SDS进行平衡，再转移至第二向进行电泳。这类电泳可提供关于断裂二硫键的多肽信息。

样品处理及第一向和第二向电泳都是在变性条件下进行的。样品先用2%SDS、5%β-巯基乙醇溶解，95℃变性处理5分钟，第一向IEF在8mol/L脲和1%NP-40条件下进行，然后以2%SDS、5%β-巯基乙醇溶液进行平衡再转移至第二向进行电泳。这类电泳适合于DNA序列对应的多肽结构分析和翻译后或翻译过程修饰中多肽结构差异分析，如糖基化、磷酸化等修饰的蛋白质。