模块二 综合性实验
实验十 菜花中核酸的分离和鉴定
一、实验目的
掌握从菜花中分离核酸的方法，并对核糖核酸（RNA）、脱氧核糖核酸（DNA）做定性检定。
二、实验原理
用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液（10%氯化钠溶液）和0.5mol/L高氯酸溶液（70℃）分别提取DNA和RNA，再进行定性检定。
由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。
1.核糖的测定
测定核糖的常用方法是苔黑酚[即3，5—二羟甲苯法（orcinol反应）]。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5—二羟甲苯在沸水浴中加热10～20min后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3，5—二羟甲苯作用产生绿色物质。
DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。
2.脱氧核糖的测定
测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10min后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω—羟基-6—酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。
此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。
上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA与RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
新鲜菜花1kg。
2.仪器
恒温水浴、电炉、离心机、布氏漏斗装置、吸管、烧杯、量筒、剪刀。
3.试剂
（1）95%乙醇1000mL。
（2）丙酮1000mL。
（3）5%高氯酸1000mL。
（4）0.5mol/L高氯酸溶液100mL。
（5）10%氯化钠溶液1000mL。
（6）粗氯化钠500g。
（7）海砂5g。
（8）二苯胺试剂600mL将6g二苯胺溶于600mL冰醋酸中，再加入16.5mL浓硫酸（置冰箱中可保存6个月。使用前，在室温下摇匀）。
（9）三氯化铁浓盐酸溶液600mL将3mL 10%三氯化铁溶液（FeCl3·6H2O配制）加入到600mL浓盐酸中。
（10）苔黑酚乙醇溶液100mL溶解6g苔黑酚于100mL 95%乙醇中（冰箱保存1个月）。
四、实验步骤
（1）核酸的分离
①取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL 95%乙醇和400mg海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。
②滤渣中加入20mL丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。
③再向滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5min后抽干（用力压滤渣，尽量除去丙酮）。
④在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL 5%高氯酸溶液中。搅拌，抽滤，弃去滤液。
⑤将滤渣悬浮于20mL 95%L醇中，抽滤，弃去滤掖。
⑥滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5min，抽滤至干，用力压滤渣尽量除去丙酮。
⑦将干燥的滤渣重新悬浮在40mL 10%氯化钠溶液中。在沸水浴中加热15min。放置，冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并（提取物一）。
⑧将滤渣重新悬浮在20mL 0.5mo1/L高氯酸溶液中。加热到70℃、保温20min（恒温水浴）后抽滤，留滤液（提取物二）。
（2）RNA、DNA的定性检定
①二苯胺反应：如表1-10所示。
表1-10 二苯胺反应
续表
②苔黑酚反应：如表1-11所示。
表1-11 苔黑酚反应
五、结果与讨论
提取物一、提取物二各主要含什么物质？
六、注意事项
（1）溶液应从抽滤瓶上口倒出。
（2）停止抽滤时先旋开安全瓶上的旋塞恢复常压然后关闭抽气泵。
思考题
1.核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质？本实验是怎样除掉的？
2.实验中呈色反应时RNA为什么能产生绿色复合物？DNA产生蓝色物质？
参考文献
[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.
[2]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.
[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.
实验十一 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
一、实验目的
了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
二、实验原理
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
酵母粉200g。
2.仪器
乳钵、150mL锥形瓶、水浴、量筒、漏斗、吸管、滴管、试管及试管架、烧杯、离心机。
3.试剂
（1）0.04mol/L氢氧化钠溶液1000mL。
（2）酸性乙醇溶液500mL将0.3mL浓盐酸加入30mL乙醇中。
（3）95%乙醇1000mL。
（4）乙醚500mL。
（5）1.5mol/L硫酸溶液200mL。
（6）浓氨水50mL。
（7）0.1mol/L硝酸银溶液50mL。
（8）三氯化铁浓盐酸溶液80mL将2mL 10%三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400mL浓盐酸中。
（9）苔黑酚乙醇溶液10mL溶解6g苔黑酚于100mL 95%乙醇中（可冰箱保存1个月）。
（10）定磷试剂50mL
①17%硫酸溶液：将17mL浓硫酸（相对密度1.84）缓缓加入到83mL水中。
②2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100mL水中。
③10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水中，贮于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。
临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合：
17%硫酸溶液∶2.5%钼酸铵溶液∶10%抗坏血酸溶液∶水=1∶1∶1∶2（体积比）。
四、实验步骤
将15g酵母悬浮于90mL 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150mL锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。离心（3000r/min）15min，将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（3000r/min）3min。弃去清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。
取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。
（1）嘌呤碱 取水解液1mL加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mo1/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。
（2）核糖 取1支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意溶液是否变成绿色，说明是否有核糖的存在。
（3）磷酸 取1支试管，加入水解液1mL和定磷试剂1mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。
注：从酵母中提取核酸部分可由两个学生共做1份。水解及组分鉴定部分由每个学生独立操作。
五、结果与讨论
观察有无嘌呤碱、核糖和磷酸等核糖核酸组分并分析原因。
六、注意事项
（1）离心机中对称放置。
（2）离心管装入样品后必须严格配平。
思考题
1.如何得到高产量RNA的粗制品？
2.本实验RNA组分是什么？怎样验证的？
参考文献
[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.
[2]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.
[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.