实验三 腐殖质的分离及各组分的性状观察
一、实验目的
1.加深对土壤和沉积物中腐殖质的认识，了解腐殖质的含量和分布特征及其在环境污染迁移和转化中的作用。
2.掌握腐殖质的分离方法、原理以及各组分的主要性状特点。
3.了解腐殖质各组分的性质和特征。
二、实验原理
土壤腐殖质与土壤矿物质紧密结合，要了解土壤腐殖质主要成分及其盐类的性状，必须先把它从土壤中分离提取出来。为了寻找理想的提取剂，使得土壤腐殖质和矿物质能彻底分离，又不改变其物理化学性质，已经开展了许多试验研究。到目前为止，稀的氢氧化钠溶液是最常用的提取液。土壤腐殖质被提取出来后，经酸化和过滤，进一步把胡敏酸和富里酸分开，然后，制成各种腐殖酸的盐类，对其颜色、溶解度等性状进行观察比较，了解和认识腐殖质的组成和各组分的性状。
三、仪器与试剂
1.试剂
（1）0.1mol/L氢氧化钠和0.1mol/L焦磷酸钠混合液。称取化学纯氢氧化钠4g，加少量蒸馏水使之溶解，定容至1L。称取分析纯焦磷酸钠44.5g，加少量蒸馏水使之溶解，定容至1L。上述两溶液等体积混合。
（2）0.5mol/L硫酸钠。称取化学纯硫酸钠72g，加蒸馏水使之溶解，定容至1L。
（3）0.5mol/L和0.1mol/L的硫酸溶液。
（4）1mol/L氯化钠溶液。称取化学纯氯化钠29g，溶于少量蒸馏水中，定容至500mL。
（5）0.5mol/L氯化钙溶液。称取化学纯氯化钙（CaCl2·2H2O）36.7g，溶于少量蒸馏水中，再定容至500mL。
（6）1/3mol/L氯化铝溶液。称取化学纯氯化铝（AlCl3·6H2O）40.2g，溶于水中，再定容至500mL。
2.仪器
三角瓶、漏斗、玻璃棒、滤纸、试管、吸量管、离心机、恒温振荡器、恒温箱等。
四、实验步骤
1.将土壤研细，去除植物根、屑等未分解的有机物，过100目筛后，准确称取土壤4.00g（精确至0.01g）2份，分别放置在2个50mL离心管中。
2.在上述离心管内，加入25mL浸提液（0.1mol/L焦磷酸钠与0.1mol/L氢氧化钠混合液），瓶口加塞，恒温振荡器上震荡30min，100℃的恒温箱1h，离心（8000r/min，10min），倒出上清液于干净的50mL离心管中，再加25mL浸提液，可用竹签把离心管的泥土搅散开来，振荡30min，100℃的恒温箱1h，离心（8000r/min，10min），倒出上清液于50mL同一离心管中备用。两份操作，一份用于步骤3，一份用于步骤4。
3.各组分腐殖质性状的观察
（1）观察稀碱浸提液的腐殖质（即活性腐殖质）溶液的颜色。
（2）用10mL刻度吸量管吸取上述滤液8mL加0.5mol/L硫酸1.5mL（使滤液呈酸性反应），放在塑料离心管内（如塑料离心管上有刻度，则可直接倒入不必用吸量管）摇匀后离心，以加速沉淀物与清液的分离。观察沉淀物（胡敏酸）和清澈液（即富里酸）的颜色。
（3）用吸管吸取上述离心管中的清澈液2mL，分装在编号为①②③的三个试管中。然后弃去离心管中剩余的清澈液，向离心管底中剩余的沉淀物中加蒸馏水8mL，摇匀，沉淀分散后，逐滴加入0.1mol/L氢氧化钠，使沉淀溶解。再吸取该溶液2mL，分装在编号为④⑤⑥的另外三个试管中。在上述①～③和④～⑥号试管中，分别加入1mol/L氯化钠，0.5mol/L氯化钙和1/3mol/L氯化铝各2mL，充分摇匀，观察加入三种试剂后所发生的现象。
（4）将上述各管中清液弃掉，保留沉淀物，分别加蒸馏水2mL，摇匀，然后静止几分钟，观察有无变化发生。
4.各组分腐殖质含量和组成的测定
（1）腐殖酸的测定
吸取5mL上清液（第二步骤）于硬质试管中，加1mL 1mol/L浓盐酸中和至pH值为7.0（可用pH试纸检验），放入水浴锅中蒸干（约4h）。如果颜色较浅再加10mL上清液。
（2）胡敏酸的测定
吸取25mL上清液于离心管中，加2mL 6mol/L浓盐酸（pH值为1～1.5，pH试纸检验），放入80℃的恒温箱1h，静置过夜，使胡敏酸和富里酸充分分离。用慢速滤纸过滤，用0.1mol/L的盐水溶液清洗沉淀，至洗涤液无色为止，去掉滤液，用0.05mol/L NaOH溶液（可提前30min放入80℃的恒温箱，这样可以快速溶解）少量多次溶解胡敏酸，用0.05mol/L NaOH溶液定容至25mL，振荡5min，吸取10mL溶液于硬质试管中，如果颜色较浅，可以吸取15mL，于水浴锅中蒸干（约5h），称重（精确至0.0001g）。
（3）富里酸的测定
富里酸=腐殖酸-胡敏酸
（4）胡敏素的测定
胡敏素=腐殖质-腐殖酸
5.腐殖酸的表征（选做）
（1）元素分析。碳、氮、氢、硫元素采用元素分析仪测定，氧含量通过扣除灰分计算而得。
（2）紫外光谱分析。样品溶于0.05mol/L NaHCO3溶液中，浓度约40mg/L，在岛津UV-2450型紫外分光光度计上测定，测定范围为200～400nm。
（3）E4/E6测定。样品溶于0.05mol/L NaHCO3溶液中，浓度约40mg/L，在岛津UV-2450型分光光度计上分别测定465nm（E4）和665nm（E6）下的光密度，并求商值。
（4）傅里叶变换红外光谱分析KBr混合压片法。在傅里叶变换红外光谱仪上测定，扫描范围为500.0～4000.0/cm。
五、实验结果记录与整理
1.腐殖质的分离和性状观察见表3-5。
表3-5 腐殖质的分离和性状观察
注：①～⑥是实验步骤3的操作（3）中的试管编号。
2.腐殖质的组成成分分析见表3-6。
表3-6 腐殖质的组成成分
六、数据处理
根据实验数据结果，计算腐殖质主要成分的含量，利用相关图谱数据，表述腐殖质主要成分的特征。
七、思考题
1.溶解在0.1mol/L氢氧化钠溶液中的腐殖质是哪几类？残留在土壤中的腐殖物质还有哪几类？0.1mol/L氢氧化钠的提取液是什么颜色？是否透明？经酸液沉淀后，溶液中呈现什么颜色？主要是哪一类腐殖质？
2.通过本试验，对各种腐殖质及其盐类对土壤结构性的影响有何体会？
双语词汇
提取 extraction
表征characterization
腐殖质的表征characterization of humic substances
腐殖质的元素特征elemental characteristics of humic substances
形态species
腐殖酸humic acid（HA）
富里酸fulvic acid（FA）
苯环benzene ring
羧基carboxyl
醇羟基alcohol hydroxyl
酚羟基phenolic hydroxyl
羰基carbonyl
氨基amine
官能团functional groups
知识拓展
腐殖质的结构特征
元素及官能团的组成是判别腐殖质结构和性质最简单、最重要的方法之一。腐殖质主要含有C、H、N、O、S五种元素，不同地区腐殖质的元素组成有明显的差异。富里酸中的O含量与O/C原子比明显地高于同一来源的胡敏酸，C、H、N的含量及C/H原子比都较低；且富里酸羧基、醇羟基、酚羟基和酮型羟基的含量高于胡敏酸，而胡敏酸中醌型羟基的含量较高。富里酸的缩合程度较低，氧化程度较高，极性较强，还原性较弱，其分子结构比胡敏酸要简单。胡敏素与胡敏酸在元素组成上十分相似，胡敏素中羧基和羰基含量较高，而甲氧基的含量很低。胡敏素和胡敏酸的总酸度、羧基和酚羟基的含量均明显低于同一来源的富里酸，其含量仅为富里酸的一半左右。通过电镜分析发现，腐殖酸的微观结构呈现弹性海绵状结构特征，胡敏酸与富里酸在低pH值下呈现类似于纤维状结构的形态，随着pH值的增加，胡敏素和富里酸胶团开始聚集，由纤维状结构聚集形成束状和网状结构。